低磷脅迫下乙烯對小麥幼苗生理生化指標(biāo)的影響

1、 實 驗 論 文 題 目：低磷脅迫下乙烯對小麥幼苗生理生化指標(biāo)的影響姓 名： 學(xué) 號：      院 系： 生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院 專 業(yè)： 生物技術(shù) 年級班級： 2012級生物技術(shù) 指導(dǎo)教師： 張帆 2014年11月30日低磷脅迫下乙烯對小麥幼苗生理生化指標(biāo)的影響摘要：關(guān)鍵詞：小麥；磷脅迫；乙烯；磷含量引言：1材料與方法1.1材料培養(yǎng)及處理本實驗所用材料為小麥種子，由周口種子公司提供。選取大小相近的種子，用95熱水浸燙種子 5 s。將其放入培養(yǎng)籃中用蒸餾水培養(yǎng)，播種10天后，幼苗第一片真子葉完全展開時，將其轉(zhuǎn)入Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)，每盆Hoagland 營養(yǎng)

2、液500ml，栽種植株20株。實驗設(shè)置試驗設(shè)高磷(Hoagland 營養(yǎng)液的含磷水平為2 mmol · L1Pi， HP)、 高磷 + 乙烯(HP + Eth)、 低磷(將 Hoagland營養(yǎng)液中磷水平降到 20 mol·L1 Pi， LP)、 低磷 +乙烯(LP + Eth)4 個處理， 完全培養(yǎng)液（NP）、完全培養(yǎng)液+乙烯（NP+Eth）、兩組水培。5 次重復(fù)。低磷組中補加KCl 以補充因減少 KH 2 PO 4 的施入而引起的 K 虧缺。營養(yǎng)液中乙烯的濃度為 50mol·L 1。15 d后(幼苗第三片復(fù)葉完全展開)取樣測定小麥各項生理指標(biāo)。培養(yǎng)期間，3d更

3、換1 次營養(yǎng)液。每天通氣 1 2 h， 自然光照。1.2 測定項目與指標(biāo)1.2.1 形態(tài)學(xué)指標(biāo)及生物量測定:分別在 4 個處理組中隨機采取 10 個植株， 用直尺測量其主根長度、 最長側(cè)根長度， 用排水法測定根系體積， 然后稱量其地上部分與地下部分的鮮重和干重。再利用最長根長與根干重做比， 得出植株比根長。1.2.2光合速率及蒸騰速率:使用 CB- 1101 型光合蒸騰測定系統(tǒng)儀， 采用開路系統(tǒng)， 上午 10 00 11 00測定倒數(shù)第 3 片復(fù)葉的光合速率及蒸騰速率。每個處理重復(fù) 3 次1.2.3組織磷含量測定1.2.3.1實驗原理測定磷含量的方法主要有磷鉬藍比色法(適宜含磷量較低)和釩鉬黃

4、比色法(適宜含磷量較高)等。可直接用于植物組織可溶性磷的測定。如用于植物材料全磷含量測定，需將材料用濃H2SO4 H202消煮轉(zhuǎn)化為可溶性磷。 1磷鉬藍比色法 在適宜的酸性條件下，磷酸能與鉬酸銨作用形成磷鉬酸按，并被抗壞血酸或氯化亞錫等還原劑還原，生成藍色的磷鉬藍，并在650 nm處有最大吸收蜂，其顏色深淺與含磷量成正比，可直接比色測定。2釩鉬黃比色法 待測液中的正磷酸與偏釩酸和鉬酸能生成黃色的三元雜多酸，溶液黃色的深淺與磷酸含量成正比，生成物在440nm波長有吸收高峰?？捎帽壬ǘ苛住４朔ǖ膬?yōu)點是黃色穩(wěn)定，對顯色條件要求不十分嚴(yán)格，操作簡便，干擾物少，靈敏度較低，工作范圍隨選用的吸收波長而

5、異。選用波長（nm） 400nm 440nm 470nm 490nm 測磷工作范圍（mg/g） 0.75-5.5 2.0-15 4-7 7-201.2.3.2材料、設(shè)備及試劑 1材科 玉米、接骨木、瓜類、葡萄等幼苗；各種植物的根、莖、葉、種子及全株過60-80目篩干粉。 2設(shè)備 電子天平、分光光度計、恒溫水浴鍋、容量瓶、刻度試管、漏斗、小紙等。 3試劑 (1)2.5鉬酸銨溶液 稱取(NH4)2MoO4鳴25g用蒸餾水溶解并定容至1000ml。 (2)10mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)液 精確稱取烘至恒重的分析純KH2PO4 0.4398g加蒸餾水溶解定容至1000m1，搖勻；取此液10ml定容至100ml即為

6、10mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)液。(3)10抗壞血酸溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配)。 (4)定磷試劑 按下列順序及比例將各試劑混合即成。蒸餾水、6mol/L硫酸、2.5鉬酸銨、10抗壞血酸按2:1:1:1(體積比)混合，貯于棕色瓶內(nèi)。若變?yōu)樽攸S色即不能使用。 (5)釩鉬酸銨試劑A液：25g(NH4)6MO7O24·4H2O(鉬酸銨)溶于400ml水。B液：1.25g偏釩酸銨溶于300ml沸水冷卻后加入250ml濃HNO3將A液緩緩傾入B液中，攪勻定容1000m1，貯于棕色瓶中。(7)6mol/L Na0H 稱24gNa0H溶于100ml水。(8)0.2二硝基酚指示劑 0.2g 2,6二硝基酚(或2,4二硝基酚

7、)溶于100ml水。(9)50mg/L磷標(biāo)難液 稱0.2197g經(jīng)烘干的分析純KH2PO4溶于400ml水加入25ml，3mol/LH2SO4定容1000m1，此液可久貯。1.2.3.3操作方法1.2.3.3.1磷鉬藍比色法(1)樣品制備 取作物組織(葉、葉鞘或莖等)用組織搗碎機或研缽制成勻漿，定容，過濾(必要時可用活性炭脫色)，濾液備用。傷流液可直接測定。(2)標(biāo)難曲線制作及樣品測定 取6支試管，分別編號為o。5，按下表順序加入磷標(biāo)準(zhǔn)液及其他試劑，以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。另取1支試管編號為6，作為樣品管，按下表加人各試劑。并將各管充分搖勻，在45水浴中保溫25min，以空白作對照，在分光光度計650

8、nm處測定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，磷含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并根據(jù)6號管的吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出測定液中磷含量。表一 磷鉬藍比色法測磷反應(yīng)體系項目管號0123456各管含磷量（µg）0246810x10mg/L磷標(biāo)準(zhǔn)液（ml）00.20.40.60.81.0樣品0.2蒸餾水（ml）3.02.82.62.42.22.02.8定磷試劑（ml）3.03.03.03.03.03.03.0吸光度值（A650）1.2.3.3.2釩鉬黃比色法(1)樣品制備(參見磷鉬藍比色法)。(2)樣品測定：吸待測液5-10ml于容量瓶，加2滴二硝基酚指示劑，加6mol/LNaaOH中和至剛呈黃色，加

9、10ml釩鉬酸銨試劑，用蒸餾水定容，在440nm處比色，以空白溶液調(diào)零。(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：50ml容量瓶8個，編號07，準(zhǔn)確吸50mg/L磷貯備標(biāo)液0、1、2.5、5、7.5、10、15ml分別加入各瓶，按步驟(2)加入各試劑顯色，即得：0、1.0、5、5.0、7.5、10、15磷的標(biāo)準(zhǔn)色階，測定A440。以吸光度為縱坐標(biāo)，磷標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線。1.2.3.4實驗結(jié)果按計算公式計算樣品中磷的百分含量。樣品含磷量()mx×V/V1×W×10-4mx：標(biāo)準(zhǔn)曲線查出測定液中磷含量(µg)V：樣品提取液總體積(ml)V1：用于測定的樣品液(ml)

10、：w：樣品鮮重或干重(g)10-4：樣品含磷量(µg/g)換算成百分含量應(yīng)乘系數(shù) 1.2.4葉綠素含量的測定（分光光度法）：將0.1克葉片剪碎，入25mL容量瓶，加95%乙醇25ml，加蓋，于3040黑暗的溫箱保溫24h，至葉片變白，于663、645nm下比色（需注意比色前需添加95%乙醇至容量瓶刻度線）。用95%乙醇作為空白管調(diào)零。色素含量（mg·g-1）= 濃度（mg·L-1）×提取液總量（ml）/ 葉片重量（g）×1000葉綠素a的濃度 = 13.95 ´ OD665 6.88 ´ OD649 葉綠素b的濃度 = 24

11、.96 ´ OD649 7.32 ´ OD665 1.2.5根系活力的測定（TTC法）：稱根尖0.5g，放入50mL燒杯中，加入0.4%TTC和磷酸緩沖液的等量混合液10ml，浸沒根，37下暗保溫3h，后加1mol·L-1硫酸2ml，停止反應(yīng)。（同時做一空白實驗，先加硫酸，再加根樣，其他操作同上）。取出根，吸干水分后與乙酸乙酯34ml一起在研缽內(nèi)磨碎，以提出甲月替。紅色提取液移入刻度試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌二、三次，移入試管，最后加乙酸乙酯使總量為10ml，在波長485nm下比色，以乙酸乙酯為空白調(diào)零。根系活力計算：四氮唑還原強度（mg·g-1根

12、鮮重h-1）C×V/1000/根重（g）×時間（h）其中C為根據(jù)所測樣品提取液的吸光度值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上所查處的樣品提取液的濃度（mgTPF/L）；V為樣品提取液的總體積（mL）；根系活力標(biāo)準(zhǔn)曲線 1.2.6硝酸還原酶活性測定磺胺比色法(李合生植物生理生化實驗原理和技術(shù)M北京：高等教育出版社2000125-127)1.2.6.1原理：還原酶(nitrate reductase，NR)，是植物氮素同化的關(guān)鍵酶，它催化植物體內(nèi)的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽：產(chǎn)生的亞硝酸鹽與對-氨基苯磺酸(對-氨基苯磺酸胺)及-萘胺(或萘基乙烯二胺)在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應(yīng)如下： 紅色偶氮

13、化合物生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮的量表示。一般單位鮮重以N g/(g.h)為單位。1.2.6.2材料、儀器設(shè)備及試劑1.2.6.2.1材料 ：植物器官(花瓣、葉片等)1.2.6.2.2儀器設(shè)備：冰箱、低溫高速離心機、微量加樣器 (1mL、100L)、移液管、精密電子天平、分光光度計、具塞試管、研缽、剪刀、鑷子、恒溫水浴、離心管、洗耳球1.2.6.2.3試劑： (1)亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取分析純亞硝酸鈉0.9857g溶于無離子水后定溶至1000mL，然后在吸取 5mL定溶至1000 mL，即為含亞硝態(tài)氮的1/mL的標(biāo)準(zhǔn)液

14、。(2)0.1mol/L的磷酸緩沖液(PH7.5)：Na2HPO4·12H2O (30.0905g)與NaH2PO4·2H2O (2.4965g)加無離子水后定溶至1000mL。(3) 1%磺胺溶液：1.0g磺胺溶于100 mL 3mol/L HCl中(25mL濃鹽酸加水定溶至100mL即為3mol/L HCl)，用蒸餾水稀釋至100ml。(4)0.02%萘基乙烯胺溶液：0.200g萘基乙烯二胺溶于100mL無離子水中，貯于棕色瓶中。(5) 0.1mol/L KNO3溶液：2.5275g KNO3溶于250mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(PH7.5)。(6)0.025m

15、ol/LPH8.7的磷酸緩沖液：8.8640g Na2HPO4·12H2O和0.0570g NaH2PO4·2H2O定溶于1000mL無離子水中。(7)提取緩沖液：0.1211半光氨酸、0.0372g EDTA溶于100mL 0.025mol/LPH8.7的磷酸緩沖液。(8)2mg/mL NADH溶液：2mg NADH溶于1mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(PH7.5)。1.2.6.3試驗步驟 (一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取7支潔凈烘干的15mL刻度試管按下表順序加入試劑，配成02.0g的系列標(biāo)準(zhǔn)亞硝態(tài)氮溶液。搖勻后在25下保溫30min，然后在540nm下比色測定。以亞硝態(tài)氮

16、(g)為橫坐標(biāo)(x)，吸光度值為縱坐標(biāo)(y)建立回歸方程。試劑/mL管號1234567亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液00.20.40.81.21.62.0蒸餾水2.01.81.61.20.80.40.01%磺胺44444440.02%萘基乙烯胺溶液4444444每管含亞硝態(tài)氮/g00.20.40.81.21.62.0(二)樣品中硝酸還原酶活力測定(1)酶的提取 稱取材料0.5g鮮樣，剪碎于研體中置于低溫冰箱冰凍30min，取出置于冰浴中加入少量石英砂及4mL提取緩沖液，研磨勻漿，轉(zhuǎn)移于離心管中在4、4000r/min下離心15min，上清液即為粗酶提取液。(2)酶的反應(yīng) 取粗酶液0.4mL于10mL的試管中

17、，加入1.2mL 0.1mol/L KNO3磷酸緩沖液和0.4mL NADH溶液，混勻，在25水浴中保溫30min，對照不加NADH溶液，而以0.4mL 0.1mol/L的磷酸緩沖液(PH7.5)代替。(3)終止反應(yīng)與比色反應(yīng)保溫結(jié)束后立即加入1mL磺胺溶液終止酶反應(yīng)，再加入1mL萘基乙烯胺溶液，顯色15min后于4000r/min下離心5min，取上清液在540nm下比色測定吸光度。根據(jù)回歸方程計算出反應(yīng)液中所產(chǎn)生的亞硝酸態(tài)氮(g)。1.2.6.4計算單位鮮重樣品中硝酸還原酶活性=(x/V2)×V1/(W×t)式中：x為反應(yīng)液酶催化產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮總量，g；V1為提取酶時加

18、入的緩沖液體積，mL；V2為酶反應(yīng)時加入的粗酶液體積，mL；W為樣品鮮重，g；t為反應(yīng)時間，h。1.2.7 MDA含量測定硫代巴比妥酸(TBA)法(龔富生，張嘉寶植物生理學(xué)實驗M北京：氣象出版社1995247-249)1.2.7.1原理在酸性和高溫條件下，丙二醛和硫代巴比妥酸反應(yīng)生成紅棕色的3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮，在532nm處有最大吸收峰。但該反應(yīng)受到可溶性糖和蛋白的極大干擾，可溶性糖和蛋白的吸收波長分別在450nm和600nm處。 植物組織器官的衰老總是伴隨著細胞內(nèi)膜的破壞，表現(xiàn)為細胞內(nèi)的電解質(zhì)大量滲漏出來，研究結(jié)果表明，細胞衰老過程中膜的破壞是由細胞中(特別是線粒體和葉綠體)

19、產(chǎn)生的生物自由基(如O 2.-、OH.、1O2等)使膜脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用而造成的。膜脂過氧化作用產(chǎn)生的自由基，它不僅能夠連續(xù)誘發(fā)膜脂過氧化作用，而且還可以使蛋白質(zhì)脫H+而產(chǎn)生蛋白質(zhì)自由基，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生鏈?zhǔn)骄酆稀亩辜毎ぷ冃?，最終導(dǎo)致細胞損傷、衰老或死亡。膜脂過氧化作用可能以下列進行： 丙二醛硫代巴比妥酸(TBA) 丙二醛 5,5-亞丙烯苯-雙硫代巴比妥酸(雙TBA)(三甲川)1.2.7.2材料、設(shè)備與試劑(一)材料 植物組織器官(葉片、花瓣等)(二)設(shè)備 分光光度計、水浴鍋、研缽、精密電子天平、臺式天平、試管、試管架、剪刀、量筒、燒杯、離心機、離心管（10mL）、微量加樣

20、器（1000L）、移液管、鑷子(三)試劑 (1)20%三氯乙酸(TCA三氯醋酸)；(2)2.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液：0.25g的硫代巴比妥酸粉劑加入到20%的三氯乙酸中定溶到100mL；(3)三氯乙酸(20%)：20g定溶到100mL為20%；1.2.7.3方法與步驟(1)分別取植株相應(yīng)部位的材料0.2g，洗凈擦干。(2)加1mL蒸餾水于研缽中充分研磨，并轉(zhuǎn)移到試管中，再用4mL蒸餾水沖洗研缽(分兩次)，仍轉(zhuǎn)移至試管中。(3)向每個試管提取液中加5mL 0.5%硫代巴比妥酸溶液，充分搖勻。(4)置沸水浴中煮沸10min，立即取出放入冷水中冷卻。(5)配平后，然后3000r/m離心15m

21、in，取上清液用分光光度計測其450nm、532nm、600nm處的吸光度(OD)值。 1.2.7.4計算MDA含量的計算公式：MDA(mmol.g-1FW)=6.452×(D532-D600)-0.599×D450×VT/(V1×W)1.2.8 POD(過氧化物酶)活力測定愈創(chuàng)木酚比色法1.2.8.1原理POD廣泛分布在植物的各個組織器官中，在有過氧化氫存在下，POD能使愈創(chuàng)木酚氧化生成茶褐色物質(zhì)，可用分光光度計定量測量生成物的OD，從而測定出POD的含量。1.2.8.2材料、儀器設(shè)備及試劑(一)材料 植物器官(花瓣、葉片等)(二)儀器設(shè)備冰箱、低溫高

22、速離心機、微量加樣器 (1mL、100L)、移液管、精密電子天平、UV-752型紫外分光光度計、試管、研缽、剪刀、鑷子 (三)試劑(1)0.01mol/L PH7.0的磷酸緩沖液：61.0mL 0.1mol/L Na2HPO4與39.0mL 0.1mol/L NaH2PO4混合加蒸餾水至1000mL；(2)0.02mol/L的愈創(chuàng)木酚：取0.11mL愈創(chuàng)木酚加水至50mL；(3)0.04mol/L的過氧化氫：取80L 30%過氧化氫加水至20mL，是用前配制；1.2.8.3酶液的制備(1)取材料0.2g，加少許石英砂，再加1mL（分三次加）PH 7.0的PBS。(2)冰浴中充分研磨，4，120

23、00r/m 離心15min。(3)取上清液分裝于Eppendoff管中，保存于-20的冰箱中備用。(4)取2個比色杯，按下表加入各種試劑。表 POD活力測定加樣表反應(yīng)物對照樣品磷酸緩沖液/ mL3.02.9愈創(chuàng)木酚/ mL0.050.05酶液/ mL 00.1(5)加好反應(yīng)物搖勻，在樣品管中加10L 0.04mol·L-1過氧化氫溶液，即刻搖勻，在470nm處測OD值，讀出第2分鐘、第3分鐘的OD值，按下面的公式計算酶活力單位1.2.8.4計算1.2.9脯氨酸含量測定磺基水楊酸浸提法(李合生植物生理生化實驗原理和技術(shù)M北京：高等教育出版社2000258-260)1.2.9.1原理當(dāng)用

24、磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中。色素的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出(或用回歸方程計算)脯氨酸的含量。1.2.9.2材料、儀器設(shè)備及試劑(一)材料 植物器官(花瓣、葉片等)(二)儀器設(shè)備冰箱、普通離心機、微量加樣器 (1ml、20l、100l)、移液管、精密電子天平、分光光度計、試管、研缽、剪刀、鑷子、小燒杯、容量瓶、大試管、普通試管、注射器、水浴鍋、漏斗、漏斗架、濾紙 (三)試劑(1) 酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸

25、和20mL6mol/L磷酸中，攪拌加熱(70)溶解，貯于冰箱中。(2)3%磺基水楊酸：3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定溶至100mL。(3)冰醋酸(4)甲苯1.2.9.3試驗步驟(一)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 (1)在精密電子天平上精確稱取25mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250mL容量瓶中，加蒸餾水定溶，此標(biāo)準(zhǔn)液每毫升含脯氨酸100g。(2)系列脯氨酸濃度的配制：取6個50mL的容量瓶，分別乘入脯氨酸原液0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL及3.0mL，用蒸餾水定溶至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1g/mL、2g/mL、3g/mL、4g/mL、5g/mL和6g/mL。(3)取6個試管，分別吸取2mL系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，每管在沸水中加熱30min。(4)冷卻后各試管準(zhǔn)確加入4mL甲苯，振蕩30s，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。(5)用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為對照，于520nm波長處進行比色。(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：先求