試劑盒原理PPT課件

1、第一部分 抗原抗體基本概念一、概念抗原（Antigen, AgAntigen, Ag）是刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)（應(yīng)是指抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答產(chǎn)物-抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞）答（答是指相應(yīng)抗原與免疫應(yīng)答產(chǎn)物結(jié)合并將其排除體外）的物質(zhì)?？乖饕覆≡⑸锛捌浯x產(chǎn)物以及抗毒素血清和藥物等。根據(jù)來源可分為外來抗原和自身抗原。第1頁/共36頁 二、抗原的兩種基本特性1. 1. 免疫原性（immunogenecityimmunogenecity），是指抗原分子能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞）的性質(zhì)。 免疫原性示意圖第2頁/共36頁抗原性（antigenicityantigenicity

2、），又稱免疫反應(yīng)性，是指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞）發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。致敏致敏抗體第3頁/共36頁 三、完全抗原與半抗原 1. 1. 完全抗原（complete antigen)complete antigen)具有免疫原性和抗原性的物質(zhì)。 2. 2. 半抗原（incomplete antigen incomplete antigen ）無免疫原性，只有抗原性的物質(zhì)。 3. 3. 載體（carriercarrier）賦予半抗原以免疫原性的蛋白質(zhì)。4. 4. 半抗原 + + 蛋白質(zhì)（載體） 完全抗原。 5. 5. 抗原決定簇（antigenic determinantanti

3、genic determinant）, , 又稱表位（epitopeepitope）?？乖肿哟嬖诘哪芘cTCR/BCRTCR/BCR或抗體FabFab片段特異性結(jié)合的特殊化學(xué)基團(tuán)，是免疫應(yīng)答特異性的物質(zhì)基礎(chǔ)。 第4頁/共36頁四、 抗體概論1. 1. 抗體（antibody, Abantibody, Ab） 是由抗原刺激而產(chǎn)生并能與刺激其產(chǎn)生的抗原發(fā)生特異性結(jié)合的、具有免疫功能的糖蛋白?？贵w主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。 2. 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Igimmunoglobulin, Ig） 具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗

4、體分子相似的球蛋白。第5頁/共36頁五、單克隆抗體和多克隆抗體1.1.多克隆抗體（polyclonal antibodypolyclonal antibody） 抗原分子通常具有多個(gè)抗原決定簇，動(dòng)物免疫后可刺激多種具有相應(yīng)抗原受體的B B細(xì)胞發(fā)生免疫應(yīng)答，因而可產(chǎn)生多種針對(duì)不同抗原決定簇的抗體。這些由不同B B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的抗體稱為多克隆抗體（polycolonal antibody, PcAbpolycolonal antibody, PcAb）。 第6頁/共36頁2.2.單克隆抗體（monoclonal antibody, McAbmonoclonal antibody, McAb）A.A

5、.定義：由單一克隆B B細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只識(shí)別抗原 分子某一特定抗原決定簇的、具有高度特異性的抗體。B.B.特點(diǎn) 具有高度均一性。C.C.雜交瘤細(xì)胞 骨髓瘤細(xì)胞 無限增殖； 免疫B B細(xì)胞 合成、分泌特異性抗體。D.D.雜交瘤技術(shù) HATHAT培養(yǎng)基：次黃嘌(H)(H)、氨基蝶呤(A)(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)(T)。第7頁/共36頁單克隆抗體制備流程單克隆抗體制備流程1.1.免疫動(dòng)物免疫動(dòng)物（使小鼠產(chǎn)生致敏（使小鼠產(chǎn)生致敏B B淋巴細(xì)胞）淋巴細(xì)胞）2.2.細(xì)胞融合（加入細(xì)胞融合（加入PEGPEG）3.3.選擇性培養(yǎng)（選擇性培養(yǎng)（HATHAT選擇性培養(yǎng)基）選擇性培養(yǎng)基）4.4.雜交瘤陽性克

6、隆的篩選與克隆化雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化（ELISAELISA方法進(jìn)行篩選，特異性，親和方法進(jìn)行篩選，特異性，親和力，效價(jià)及交叉反應(yīng)的評(píng)價(jià)）力，效價(jià)及交叉反應(yīng)的評(píng)價(jià)）5.5.單克隆抗體的大量制備單克隆抗體的大量制備（體內(nèi)誘生：腹水）（體內(nèi)誘生：腹水）（體外培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)液）（體外培養(yǎng)：細(xì)胞培養(yǎng)液）第8頁/共36頁單克隆抗體與多克隆抗體的比較第9頁/共36頁酶標(biāo)板 已包被抗原或抗體試劑 標(biāo)準(zhǔn)品、抗體、酶標(biāo)物 顯色液、終止液 樣品處理液、洗滌液說明書第二部分第二部分 ELISAELISA試劑盒的組成及原理試劑盒的組成及原理操作流程操作流程注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)第10頁/共36頁 1 1 間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)

7、抗原間接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 樣本中的待測(cè)藥物和固相化的抗原共同競(jìng)爭(zhēng)一定量的抗體，加入酶標(biāo)樣本中的待測(cè)藥物和固相化的抗原共同競(jìng)爭(zhēng)一定量的抗體，加入酶標(biāo)記抗抗體（酶標(biāo)二抗）后能與固相化的抗原抗體復(fù)合物特異性結(jié)合，記抗抗體（酶標(biāo)二抗）后能與固相化的抗原抗體復(fù)合物特異性結(jié)合，經(jīng)底物顯色后檢測(cè)，樣本中藥物含量愈高，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的抗體量愈多，經(jīng)底物顯色后檢測(cè)，樣本中藥物含量愈高，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的抗體量愈多，從而結(jié)合在固相上的酶標(biāo)記抗抗體（酶標(biāo)二抗）量愈少，最后的顯色從而結(jié)合在固相上的酶標(biāo)記抗抗體（酶標(biāo)二抗）量愈少，最后的顯色也愈淺。本公司及國內(nèi)產(chǎn)品多用此法。具體操作步驟如下：也愈淺。本公司及國內(nèi)產(chǎn)品多用此法。具體操作步驟

8、如下： 1）加入標(biāo)準(zhǔn)品）加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，再加入抗體，保溫反應(yīng)。樣本中藥物與固相抗樣本，再加入抗體，保溫反應(yīng)。樣本中藥物與固相抗原同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)與特異性抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去原同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)與特異性抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結(jié)合不緊密的物質(zhì)。游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結(jié)合不緊密的物質(zhì)。2）加酶標(biāo)抗抗體，固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，）加酶標(biāo)抗抗體，固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合，從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢藥物從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量與樣本中受檢藥物的量負(fù)相關(guān)。的量負(fù)相關(guān)。3

9、）加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測(cè)）加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測(cè)分析，測(cè)知樣本中抗原的量。分析，測(cè)知樣本中抗原的量。第11頁/共36頁 2 2 直接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原直接競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原（1）直接競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)抗原法測(cè)抗原）直接競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)抗原法測(cè)抗原樣本中的待測(cè)藥物和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，經(jīng)底物顯樣本中的待測(cè)藥物和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，經(jīng)底物顯色后檢測(cè)，樣本中藥物含量愈高，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原量愈少，色后檢測(cè)，樣本中藥物含量愈高，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原量愈少，最后的顯色也愈淺。最后的顯色也愈淺。（2）直接競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)抗體法測(cè)抗原）直接

10、競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)抗體法測(cè)抗原樣本中的待測(cè)藥物和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的酶標(biāo)記抗體，經(jīng)底物顯樣本中的待測(cè)藥物和固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合一定量的酶標(biāo)記抗體，經(jīng)底物顯色后檢測(cè)，樣本中藥物含量愈高，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，最色后檢測(cè)，樣本中藥物含量愈高，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，最后顯色也愈淺。后顯色也愈淺。直接競(jìng)爭(zhēng)法具體操作步驟如下：直接競(jìng)爭(zhēng)法具體操作步驟如下： 1）加入標(biāo)準(zhǔn)品）加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本，再加入酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原），保溫反應(yīng)。樣本，再加入酶標(biāo)抗體（或酶標(biāo)抗原），保溫反應(yīng)。樣本中藥物與固相抗原（或酶標(biāo)抗原）同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)與特異性抗體（或固樣本中藥物與固相抗原（或酶標(biāo)抗原）同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)與特異性抗體（或固相抗體）結(jié)

11、合，形成固相抗原相抗體）結(jié)合，形成固相抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物（或抗體酶標(biāo)抗體復(fù)合物（或抗體-酶標(biāo)抗原復(fù)酶標(biāo)抗原復(fù)合物）。洗滌除去游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結(jié)合不緊密的物質(zhì)。合物）。洗滌除去游離物質(zhì)及吸附在固相載體上結(jié)合不緊密的物質(zhì)。2）加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測(cè)）加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過儀器檢測(cè)分析，測(cè)知樣本中抗原的量。分析，測(cè)知樣本中抗原的量。 國外大部分國外大部分ELISA試劑盒均采用此類型。試劑盒均采用此類型。第12頁/共36頁 3 3雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如乳鐵蛋白。此法適用于檢驗(yàn)

12、各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如乳鐵蛋白。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體包被固相載體和制備和制備酶結(jié)合物酶結(jié)合物而建立此法。（曲線正相關(guān)）而建立此法。（曲線正相關(guān)）第13頁/共36頁第三部分 分析軟件使用及結(jié)果分析第14頁/共36頁第15頁/共36頁第16頁/共36頁第17頁/共36頁第18頁/共36頁第19頁/共36頁第20頁/共36頁第21頁/共36頁第22頁/共36頁第四部分 ELISAELISA試劑盒可能出現(xiàn)的問題及解決方法第23頁/共36頁第24頁/共36頁第五部分 常見的霉菌毒素及其危害、限量標(biāo)準(zhǔn)n黃曲霉毒素（黃曲霉毒素（A

13、lfatoxinsAlfatoxins）：）：包括包括B1B1、B2B2、G1G1、G2G2、M1M1、M2M2等等1717種，其種，其中中B1B1毒性最強(qiáng)。黃曲霉毒素中毒可降低畜禽對(duì)疾病的抵抗力；毒性最強(qiáng)。黃曲霉毒素中毒可降低畜禽對(duì)疾病的抵抗力；n玉米赤霉烯酮（玉米赤霉烯酮（ZearalenoneZearalenone）：雌激素樣作用，繁殖機(jī)能障礙；雌激素樣作用，繁殖機(jī)能障礙；n嘔吐毒素（嘔吐毒素（VomitoxinVomitoxin）：）：采食量下降、增重下降，皮膚炎癥；采食量下降、增重下降，皮膚炎癥；nT-2T-2毒素毒素( (T-2 Toxin)T-2 Toxin)：口腔潰瘍，食欲不振

14、，皮膚炎癥，消化道紊亂；口腔潰瘍，食欲不振，皮膚炎癥，消化道紊亂；n伏馬伏馬毒素毒素( (Fumonisin)Fumonisin)：神經(jīng)錯(cuò)亂，肝臟受損；神經(jīng)錯(cuò)亂，肝臟受損；n赭曲霉毒素赭曲霉毒素( (Ochratoxins)Ochratoxins)：產(chǎn)生腎毒素，痛風(fēng)癥。產(chǎn)生腎毒素，痛風(fēng)癥。第25頁/共36頁 霉菌毒素的殘留限量毒素毒素樣品類型樣品類型限量限量 (g/kg)黃曲霉毒素黃曲霉毒素 B1B1玉米及玉米產(chǎn)品，花生及花生產(chǎn)品，花生油、玉米油玉米及玉米產(chǎn)品，花生及花生產(chǎn)品，花生油、玉米油20稻谷、大米、其他食用油稻谷、大米、其他食用油10小麥、大麥及其加工制品，大豆及其發(fā)酵制品、調(diào)味品、小

15、麥、大麥及其加工制品，大豆及其發(fā)酵制品、調(diào)味品、堅(jiān)果、其他谷物堅(jiān)果、其他谷物5嬰兒配方食品：大豆類、米類、米粉嬰兒配方食品：大豆類、米類、米粉0.5黃曲霉毒素黃曲霉毒素 M1M1乳及乳制品乳及乳制品0.5嬰幼兒配方食品嬰幼兒配方食品0.5GB2761-2011食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)限量標(biāo)準(zhǔn)第26頁/共36頁毒素毒素樣品種類樣品種類限量限量 (g/kg)黃曲霉毒素黃曲霉毒素 B1玉米、花生餅（粕）、棉籽餅（粕）、菜籽餅（粕） 50肉牛精料補(bǔ)充料豆粕30生長肥育豬、種豬配合料及濃縮料20肉用仔雞后期、生長雞、產(chǎn)蛋雞配合飼料及濃縮料鵪鶉配合飼料及濃縮料肉用仔鴨后

16、期、生長鴨、產(chǎn)蛋鴨配合飼料及濃縮料15仔豬配合飼料及濃縮料10肉用仔雞前期、雛雞配合飼料及濃縮料肉用仔鴨前期、雛鴨配合飼料及濃縮料奶牛精補(bǔ)料10 霉菌毒素的殘留限量GB 13078-2001 飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)黃曲霉毒素黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)限量標(biāo)準(zhǔn)第27頁/共36頁 霉菌毒素的殘留限量毒素毒素樣品類型樣品類型限量限量 (g/kg)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DONDON）谷物及其制品（玉米、玉米面；小麥、小麥粉、大谷物及其制品（玉米、玉米面；小麥、小麥粉、大麥、麥片）、豬料、犢牛料、泌乳期料麥、麥片）、豬料、犢牛料、泌乳期料牛料、禽料牛料、禽料10005000玉米赤霉烯酮（玉米

17、赤霉烯酮（ZENZEN）谷物及其制品谷物及其制品配合飼料、玉米配合飼料、玉米60500T-2T-2毒素毒素豬配合飼料、禽配合飼料豬配合飼料、禽配合飼料1000赭曲霉毒素（赭曲霉毒素（OTAOTA）谷物及其制品；豆類及其制品谷物及其制品；豆類及其制品配合飼料、玉米配合飼料、玉米5100第28頁/共36頁第六部分 試劑盒結(jié)果分析 靈敏度:應(yīng)用該方法能檢測(cè)待測(cè)抗原的最低量。 準(zhǔn)確度:指測(cè)定值(平均值)與真實(shí)值的接近程度,表示分析結(jié)果的正確性，由于無法知道樣本的真實(shí)濃度，故通常采用添加回收率來表示。 回收率=(測(cè)定值-空白值)/添加量 精密度:指用某種方法重復(fù)測(cè)定同一均質(zhì)樣品所得測(cè)定值的彼此接近程度,

18、表示分析結(jié)果的重復(fù)性，用變異系數(shù)表示。第29頁/共36頁第六部分 試劑盒結(jié)果分析 檢測(cè)限（LOD ）：指分析方法能夠從樣品背景信號(hào)中檢測(cè)出待測(cè)物質(zhì)存在時(shí)所需最低濃度。LOD反映了分析方法整體的靈敏度效能指標(biāo)。LOD=B+2SD或B+3SD。（試劑盒中檢測(cè)限=靈敏度*樣本稀釋倍數(shù)） 定量限（LOQ ）：指分析方法能夠?qū)悠分写郎y(cè)物進(jìn)行定量測(cè)定的最低濃度。用于定量方法的驗(yàn)證。一般要求其CV10%,回收率80%，LOQ=B+10SD。第30頁/共36頁第六部分 試劑盒結(jié)果分析 殘留檢測(cè)限（MRL）：規(guī)定的樣本中藥物最高不得超過的濃度。很多情況下各國規(guī)定的值之間有一定的差異，多數(shù)情況下我國規(guī)定的值較日本、歐盟、美國的高一些。 陰性和陽性陰性：即樣本中不含被檢測(cè)物質(zhì)陽性：樣本中含有被檢測(cè)物質(zhì) 假陰性與假陽性假陰性：因?yàn)槟承┮蛩氐挠绊?，原本含有被檢測(cè)物的樣本檢測(cè)的結(jié)果為陰性假陽性：與假陰性的情況相反第31頁/共36頁第六部分 試劑盒結(jié)果分析 零標(biāo)OD值：1.4-2.3，表示產(chǎn)品的穩(wěn)定性，過高的OD值可能是由于操作失誤引起的。（酶標(biāo)儀的選擇） IC50：半數(shù)抑制濃度。是控制曲線整體形狀的關(guān)鍵。（是結(jié)果穩(wěn)定程度的代表參數(shù)） 線性（R2值）：代表現(xiàn)有數(shù)據(jù)和方程式趨勢(shì)線的擬合度，R