DNA重組技術(shù)的基本工具

1、專題專題1 1 基因工程基因工程1基礎(chǔ)理論和技術(shù)的發(fā)展催生了基因工程20世紀(jì)中葉，基礎(chǔ)理論取得了重大突破 1.DNA是遺傳物質(zhì)的證明 2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和中心法則的確立 3.遺傳密碼的破譯2技術(shù)發(fā)明使基因工程的實(shí)施成為可能 1.基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn) 2.工具酶的發(fā)現(xiàn) 3.DNA合成和測(cè)序技術(shù)的發(fā)明 4.DNA體外重組的實(shí)現(xiàn) 5.重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功 6.第一例轉(zhuǎn)基因動(dòng)物問(wèn)世 7.PCR技術(shù)的發(fā)明3基因工程的概念：基因工程的概念： 基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNADNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦

2、予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在由于基因工程是在DNADNA分子水平上分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做施工的，因此又叫做DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)或基因拼接或基因拼接技術(shù)。技術(shù)。4重組重組DNA導(dǎo)入導(dǎo)入形成形成51.1 DNA1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具6 基因工基因工程需要哪程需要哪些基本工些基本工具具? ?7分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶8一、分子手術(shù)刀一、分子手術(shù)刀-限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶

3、( (限制酶）限制酶）9DNA分子上的一段脫氧核苷酸鏈10 T磷磷酸酸二二酯酯鍵鍵1234512345 A1112內(nèi)切酶切割內(nèi)切酶切割DNADNA后形成的末端后形成的末端黏性末端、平黏性末端、平末端是如何形成的？末端是如何形成的？13141516 大腸桿菌的一種限制酶大腸桿菌的一種限制酶（EcoR)EcoR)能識(shí)別能識(shí)別GAATTCGAATTC序列，序列，并在并在G G和和A A之間切開形成黏性末之間切開形成黏性末端。端。 SmaSma能識(shí)別能識(shí)別CCCGGGCCCGGG序列，并序列，并在在C C和和G G之間切割形成平末端之間切割形成平末端 。17當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的

4、中心軸線（圖中虛線）兩側(cè)中心軸線（圖中虛線）兩側(cè)將將DNADNA的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是的兩條鏈分別切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端黏性末端，而當(dāng)限制，而當(dāng)限制酶在它識(shí)別序列的酶在它識(shí)別序列的中心軸線處中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的則是切開時(shí)，產(chǎn)生的則是平末端平末端。18限制酶所識(shí)別的序列，無(wú)論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線,中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是的。1920黏性末端黏性末端平末端平末端21尋根問(wèn)底尋根問(wèn)底:限制酶存在于原核細(xì)胞中的限制酶存在于原核細(xì)胞中的作用是什么？為什么限制酶不剪切細(xì)菌作用是什么？為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的本身的DNA？22怎樣理解限制酶和怎樣理解限制酶和

5、DNA連接酶在微生物中能夠分離連接酶在微生物中能夠分離到到,而高等植物和動(dòng)物中沒(méi)有而高等植物和動(dòng)物中沒(méi)有?23為什么限制酶不能為什么限制酶不能將自己的將自己的DNA分子分子剪切掉？剪切掉？1 1、DNADNA分子不具分子不具備該種限制酶的備該種限制酶的識(shí)別切割序列；識(shí)別切割序列；2 2、通過(guò)甲基化酶、通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不上，使限制酶不能切開。能切開。241.1.原核生物容易受到自然界外源原核生物容易受到自然界外源DNADNA的入侵，但是，生物在長(zhǎng)期的的入侵，但是，生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵進(jìn)

6、化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來(lái)病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNADNA侵入時(shí)，會(huì)利侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源用限制酶將外源DNADNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源原核生物中主要起到切割外源DNADNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。的目的。2.2.迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細(xì)菌或霉菌迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部分都是從細(xì)菌或霉菌中提取出來(lái)的，它們各自可以識(shí)別和切斷中提取出來(lái)的，

7、它們各自可以識(shí)別和切斷DNADNA上特定的堿基序列。上特定的堿基序列。細(xì)菌中限制酶之所以不切斷自身細(xì)菌中限制酶之所以不切斷自身DNADNA，是因?yàn)槲⑸镌陂L(zhǎng)期的進(jìn)化，是因?yàn)槲⑸镌陂L(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，對(duì)于外源入侵的過(guò)程中形成了一套完善的防御機(jī)制，對(duì)于外源入侵的DNADNA可以降解可以降解掉。生物在長(zhǎng)期演化過(guò)程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其掉。生物在長(zhǎng)期演化過(guò)程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNADNA分子分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過(guò)甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣

8、，盡基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNADNA被切斷，并且可以防被切斷，并且可以防止外源止外源DNADNA的入侵的入侵. .25二、連接酶二、連接酶“分子縫合針?lè)肿涌p合針”.作用：連接磷酸二酯鍵作用：連接磷酸二酯鍵26 限制酶切割后產(chǎn)生兩種不同的末端。限制酶切割后產(chǎn)生兩種不同的末端。那么恢復(fù)它們的連接時(shí)，所用那么恢復(fù)它們的連接時(shí)，所用DNA連接連接酶是否可以不加選擇？酶是否可以不加選擇？E.coliDNAE.coliDNA連接酶：連接黏性末端連接酶：連接黏性末端T T4 4DNADNA連接酶：連

9、接黏性末端和平末端連接酶：連接黏性末端和平末端.DNA.DNA連接酶的種類連接酶的種類27DNADNA連接酶連接酶-“-“分子縫合針?lè)肿涌p合針”分分類類E.coliDNAE.coliDNA連接酶連接酶T T4 4DNADNA連接酶連接酶差別差別: : E.coliDNAE.coliDNA連接酶連接酶只能只能將雙鏈將雙鏈DNADNA片段互片段互補(bǔ)的黏性末端之間連接起來(lái)補(bǔ)的黏性末端之間連接起來(lái), ,不能將雙鏈不能將雙鏈DNADNA片段片段平末端之間進(jìn)行連接平末端之間進(jìn)行連接; T; T4 4DNADNA連接酶既可以連接酶既可以“縫縫合合”雙鏈雙鏈DNADNA片段互補(bǔ)的黏性末端片段互補(bǔ)的黏性末端,

10、,又可以又可以“縫合縫合”雙鏈雙鏈DNADNA片段的平末端片段的平末端, ,但連接平末端之間的效率但連接平末端之間的效率比較低。比較低。28DNA連接酶連接酶分子縫合針?lè)肿涌p合針常用類型常用類型EcoliEcoli DNADNA連接連接酶酶T T4 4 DNADNA連接酶連接酶來(lái)源來(lái)源大腸桿菌大腸桿菌T T4 4噬菌體噬菌體功能功能連接黏性末端連接黏性末端連接黏性末端和平末連接黏性末端和平末端端結(jié)果結(jié)果恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵酸二酯鍵29DNA聚合酶和聚合酶和DNA連接酶有何連接酶有何相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？相同點(diǎn)和不同點(diǎn)？30答：不是一回事。答

11、：不是一回事。DNADNA連接酶和連接酶和DNADNA聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在聚合酶都是形成磷酸二酯鍵（在相鄰核苷酸的相鄰核苷酸的3 3位碳原子上的羥基與位碳原子上的羥基與5 5位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？基之間形成），那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？（1 1）DNADNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸片段的33末端末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNADNA連接酶是在兩個(gè)連接酶是在兩個(gè)DNADNA片段之間形片段之間形成磷酸二酯鍵，不

12、是在單個(gè)核苷酸與成磷酸二酯鍵，不是在單個(gè)核苷酸與DNADNA片段之間形成磷酸二酯鍵。片段之間形成磷酸二酯鍵。（2 2）DNADNA聚合酶是以一條聚合酶是以一條DNADNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNADNA鏈；而鏈；而DNADNA連接酶是將連接酶是將DNADNA雙鏈上雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。因此的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。因此DNADNA連接酶不需要模板。連接酶不需要模板。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。此外，二者雖然都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的酶，但組成和性質(zhì)各不相同。31DNADN

13、A連接酶連接酶DNADNA聚合酶聚合酶連接連接DNADNA鏈鏈連接部位連接部位相同點(diǎn)相同點(diǎn)雙鏈雙鏈單鏈單鏈在兩在兩DNADNA片段之間形片段之間形成磷酸二酯鍵成磷酸二酯鍵將單個(gè)核苷酸加將單個(gè)核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3 3末端的末端的羥基上，形成磷羥基上，形成磷酸二酯鍵酸二酯鍵都能形成都能形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵二者都由蛋白質(zhì)構(gòu)成二者都由蛋白質(zhì)構(gòu)成32假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制假如目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后不能復(fù)制將怎樣？將怎樣？作為載體沒(méi)有切割位點(diǎn)將怎樣？作為載體沒(méi)有切割位點(diǎn)將怎樣？目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察目的基因是否進(jìn)入受體細(xì)胞，你如何察覺(jué)？覺(jué)？如果載體

14、對(duì)受體細(xì)胞有害將怎樣？如果載體對(duì)受體細(xì)胞有害將怎樣？三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體三、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 “分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車”33載體的必要條件載體的必要條件 能自我復(fù)制能自我復(fù)制 或能進(jìn)入受體生物細(xì)胞并在或能進(jìn)入受體生物細(xì)胞并在受體生物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá)受體生物細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達(dá) 有一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn)有一個(gè)或多個(gè)切割位點(diǎn) 具有標(biāo)記基因具有標(biāo)記基因 以便重組后進(jìn)行篩選以便重組后進(jìn)行篩選 對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單 以便提取和在體外進(jìn)行操作，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作太大就不便操作34能復(fù)制并帶著插能復(fù)制并帶著插入的目的基因一入的目的基因一起復(fù)制起復(fù)制有切割位點(diǎn)

15、有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基青霉素的培養(yǎng)基鑒別。鑒別。35常用的分子運(yùn)輸車常用的分子運(yùn)輸車有哪些？有哪些？質(zhì)粒、質(zhì)粒、噬菌體衍生物、噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒動(dòng)植物病毒3637小結(jié)基因工程基因工程的工具的工具限制酶限制酶主要存在于原核生物中主要存在于原核生物中具有專一性具有專一性(識(shí)別序列識(shí)別序列)切開切開DNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵DNA連連接酶接酶連接磷酸二酯鍵連接磷酸二酯鍵種類種類E.coliDNA連接酶連接酶T4 DNADNA連接酶連接酶載體載體具備的具備的條件條件自我復(fù)制自我復(fù)制具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具一個(gè)多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具

16、標(biāo)記基因具標(biāo)記基因大小適中大小適中質(zhì)粒、質(zhì)粒、噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害對(duì)受體細(xì)胞無(wú)害38思考與探究思考與探究總結(jié)規(guī)律總結(jié)規(guī)律限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？限制酶所識(shí)別的序列有什么特點(diǎn)？無(wú)論是無(wú)論是6 6個(gè)堿基還是個(gè)堿基還是4 4個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈軸線兩側(cè)的雙鏈DNADNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的。 1.1.限制酶在限制酶在DNADNA的任何部位都能將的任何部位都能將DNADNA切開嗎？以下是四種切開嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的不同限制酶切割形成的DNAD

17、NA片段：片段：(1) (1) CTGCACTGCA (2) (2) ACAC (3) GC (3) GC G G TGTG CG CG（4 4）G G (5) (5) G G (6) (6) GCGC CTTAACTTAA ACGTC ACGTC CGCG(7) GT(7) GT (8)AATTC(8)AATTC CA CA G G你是否能用你是否能用DNADNA連接酶將它們連接起來(lái)？連接酶將它們連接起來(lái)？39 2和7能連接形成ACGT TGCA； 4和8能連接形成GAATTC CTTAAG； 3和6能連接形成GCGC CGCG； 1和5能連接形成CTGCAG GACGTC。40 3.基因工

18、程中作為載體使用的基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核處染色體即獨(dú)立于細(xì)菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？其實(shí)不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。使用呢？其實(shí)不然，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。（1） 載體載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制

19、酶的切點(diǎn)所處可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。于因目的基因的插入而失活。（2） 載體載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。的復(fù)制而同步復(fù)制。（3） 載體載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。（4） 載體載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到必需是安全的

20、，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。（5） 載體載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。就不便操作。 實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。行人工改造后才能用于基因工程操作。414.網(wǎng)上查詢：DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？ 迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不連接酶都不具有連接單鏈具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)的能力，至于原

21、因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單在還不清楚，也許將來(lái)會(huì)發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈鏈DNA的酶。的酶。421.在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的基因的DNA片段，需使用（片段，需使用（ ）A. 同種限制酶同種限制酶 B. 兩種限制酶兩種限制酶C. 同種連接酶同種連接酶 D. 兩種連接酶兩種連接酶434445問(wèn)題問(wèn)題:DNA聚合酶與聚合酶與DNA連接酶是同一種酶的不連接酶是同一種酶的不同名稱嗎同名稱嗎?相同相同區(qū)別區(qū)別DNADNA聚聚合酶合酶形成磷形成磷酸二酯酸二酯鍵鍵只能將單個(gè)核苷酸連接到核酸片段上只能將單個(gè)核苷酸連接到核酸片段上; ;以一條以一條DNAD

22、NA鏈為模板鏈為模板, ,形成互補(bǔ)的形成互補(bǔ)的DNADNA鏈。鏈。DNADNA連連接酶接酶將兩個(gè)將兩個(gè)DNADNA片段之是形成磷酸二脂鍵；片段之是形成磷酸二脂鍵；將將DNADNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)，不需要模板。不需要模板。46問(wèn)題：標(biāo)記基因的作用及其應(yīng)用問(wèn)題：標(biāo)記基因的作用及其應(yīng)用標(biāo)記標(biāo)記基因基因抗四環(huán)素的基因抗四環(huán)素的基因抗氨芐青霉素的基因抗氨芐青霉素的基因特定顏色的基因特定顏色的基因四環(huán)素四環(huán)素氨芐青霉素氨芐青霉素47習(xí)題習(xí)題:已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基已知標(biāo)記基因有抗四環(huán)素基因和抗氨芐青霉素的基因因,現(xiàn)探討某細(xì)菌的質(zhì)粒中有無(wú)標(biāo)記基

23、因或標(biāo)記基因是什現(xiàn)探討某細(xì)菌的質(zhì)粒中有無(wú)標(biāo)記基因或標(biāo)記基因是什么么?請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、寫出可能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并得出相應(yīng)的請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、寫出可能的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并得出相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)論對(duì)照組：對(duì)照組：不添加抗不添加抗生素生素實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組1：添加一定濃添加一定濃度的四環(huán)素度的四環(huán)素實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組2：添加一定濃添加一定濃度的氨芐青度的氨芐青霉素霉素實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組3：添：添加一定濃度的加一定濃度的四環(huán)素和氨芐四環(huán)素和氨芐青霉素青霉素對(duì)照組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組1 1實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組2 2實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組3 3 結(jié)結(jié) 論論結(jié)果一結(jié)果一+ + + + +既含有抗四環(huán)素基因也含既含有抗四環(huán)素基因也含有抗氨芐青霉素基因有抗氨芐青霉素基

24、因結(jié)果二結(jié)果二+ + +只含有抗四環(huán)素基因只含有抗四環(huán)素基因結(jié)果三結(jié)果三+ + +只含有抗氨芐青霉素基因只含有抗氨芐青霉素基因結(jié)果四結(jié)果四+ +既不含有抗四環(huán)素基因也既不含有抗四環(huán)素基因也不含有抗氨芐青霉素基因不含有抗氨芐青霉素基因48載體的三大功能：載體的三大功能：1）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。）為外源基因提供進(jìn)入受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。2）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的復(fù)制能力或整合力。）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的復(fù)制能力或整合力。3）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的擴(kuò)增和表達(dá)能力。）為外源基因提供在受體細(xì)胞的的擴(kuò)增和表達(dá)能力。理想載體具備四個(gè)條件：理想載體具備四個(gè)條件：1)具有對(duì)受體

25、細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，提高導(dǎo)具有對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性，提高導(dǎo)入細(xì)胞的效率。入細(xì)胞的效率。2)具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位具有與特定受體細(xì)胞相適應(yīng)的復(fù)制位點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使外源基因在受體細(xì)胞點(diǎn)或整合位點(diǎn)，使外源基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。中穩(wěn)定遺傳。3)具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識(shí)別切割位點(diǎn)，有利于外源基因的拼接插入。位點(diǎn)，有利于外源基因的拼接插入。4)具有合適的選擇標(biāo)記（報(bào)告基因），具有合適的選擇標(biāo)記（報(bào)告基因），便于便于DNA重組分子的檢測(cè)。重組分子的檢測(cè)。問(wèn)題問(wèn)題:為什么需要載體為什么需要載體,直接將基因?qū)胧荏w直接將基因?qū)胧荏w細(xì)胞行不行細(xì)胞行不行?49質(zhì)粒的構(gòu)建

26、與改造質(zhì)粒的構(gòu)建與改造1)1)刪除不必要的刪除不必要的DNADNA區(qū)域，縮小分子量，提高區(qū)域，縮小分子量，提高外源外源DNADNA片段裝載量。片段裝載量。2)2)滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。滅活某些質(zhì)粒的編碼基因。3)3)加入易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因。加入易于識(shí)別的選擇標(biāo)記基因。 4)4)加入特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件。加入特殊的基因表達(dá)調(diào)控元件。 一般來(lái)說(shuō)，天然運(yùn)載體往往不能滿足人類的所有要求，一般來(lái)說(shuō)，天然運(yùn)載體往往不能滿足人類的所有要求，因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)某些天然的運(yùn)載體因此人們根據(jù)不同的目的和需要，對(duì)某些天然的運(yùn)載體進(jìn)行人工改建。進(jìn)行人工改建。 50（08海南高考）海南高考）右圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所右圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡(jiǎn)圖，小箭頭所指分別為限制酶指分別為限制酶EcoR、BamH的酶切位點(diǎn)，的酶切位點(diǎn)，a