試述基因工程研究的原理與基本路線并舉例說明其在轉基因動物方面的應用

1、試述基因工程研究的原理與基本路線并舉例說明其在轉基因動物方面的應用基因工程是按照人們的愿望對攜帶遺傳信息的分子（DNA）進行設計和改造,從而培育生物新類型或治療遺傳疾病的一種現(xiàn)代的、嶄新的、分子水平的生物工程技術;包括基因重組、克隆、表達；其核心是構建重組體DNA的技術，因而基因工程和DNA重組技術有時成為同義詞。當代人類社會所面臨的人口的增加、食品的短缺、疑難病的治療、資源的匱乏、環(huán)境染的加劇等重大問題,都在不同程度上依賴于生物技術的研究加以解決。因為生物技術能利用生物資源的可再生性,在常溫常壓下生產(chǎn)珍貴藥品;節(jié)約能源和資源、減少環(huán)境污染;能創(chuàng)造動植物優(yōu)良新品種,增加糧食生產(chǎn),開辟食物新來源

2、;解決疑難病的治療,并能對相關的傳統(tǒng)行業(yè)技術改造和產(chǎn)業(yè)結構調整產(chǎn)生極其深遠的作用。所以生物技術蘊藏著巨大的經(jīng)濟潛力和社會效益。生物技術的發(fā)展,僅有20多年的歷史。然而在世界范圍內給醫(yī)學帶來了一場革命性的變化,給農業(yè)帶來了新的綠色革命,使輕工、食品、環(huán)保、海洋、能源開發(fā)等有關領域得到了前所未有的發(fā)展。一、基因工程的原理現(xiàn)在人們常說的生物技術實際上就是現(xiàn)代生物技術?，F(xiàn)代生物技術包括基因工程、蛋白質工程、細胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等五大工程技術。其中基因工程技術是現(xiàn)代生物技術的核心技術?；蚬こ痰暮诵募夹g是DNA的重組技術，也就是基因克隆技術。既然基因工程這么重要,那么什么是基因工程呢? 基因工程（

3、genetic engineering），是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術，是指利用DNA體外重組或PCR擴增技術從某種生物基因組中分離感興趣的基因，或是用人工合成的方法獲取基因，然后經(jīng)過一系列切割，加工修飾，連接反應形成重組DNA分子，再將其轉入適當?shù)氖荏w細胞，以期獲得基因表達的過程1。根據(jù)這個概念，人們可以從一個生物的基因中提取有用的基因片斷，植入到另外一個生物體內，從而使該生物獲得某些新的遺傳性狀。從而獲得所需要的新的生物的變種，運用基因工程可以加快生物的變異，并使生物的變異朝著有益于人類的方向發(fā)展。同時，這個定義表明，基因工程具有以下幾個重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生

4、物中進行繁殖，能夠跨越天然物種屏障，把來自任何一種生物的基因放置到新的生物中，而這種生物可以與原來生物毫無親緣關系，這種能力是基因工程的第一個重要特征。第二個特征是，一種確定的DNA小片段在新的寄主細胞中進行擴增，這樣實現(xiàn)很少量DNA樣品"拷貝"出大量的DNA，而且是大量沒有污染任何其它DNA序列的、絕對純凈的DNA分子群體?？茖W家將改變人類生殖細胞DNA的技術稱為“基因系治療”（germlinetherapy），通常所說的“基因工程”則是針對改變動植物生殖細胞的。無論稱謂如何，改變個體生殖細胞的DNA都將可能使其后代發(fā)生同樣的改變。而且基因工程是處在分子水平上的操作，因而

5、可以跨越不同的物種進行操作，大大改善了傳統(tǒng)的只能同類生物雜交并且不能控制變異方向的方法。不同種的生物一般是不能交配的，例如魚和牛，就不能進行交配而生出下一代。但是利用基因工程，我們可以把魚的某些基因移植到牛的受精卵上，或者把牛的基因移植到魚的受精卵上，加以培養(yǎng)，就可以產(chǎn)生既有牛的性狀又有魚的性狀的新的物種。雖然基因工程有這么多的好處，但是也不是說可以濫用的。因為每種生物經(jīng)過適者生存的自然選擇，都能適應所處的生存環(huán)境.如果移植了外來的基因，可能會打破其體內的細胞的平衡，從而導致細胞的快速衰老甚至死亡?？梢?，基因工程要正確處理好細胞的相容性。二、基因工程的基本路線：一般來說，基因工程是指在基因水平

6、上的遺傳工程，它是用人為方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質-DNA大分子提取出來，在離體條件下用適當?shù)墓ぞ呙高M行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后與載體一起導入某一更易生長、繁殖的受體細胞中，以讓外源遺傳物質在其中“安家落戶”，進行正常復制和表達，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?（如圖1）：從復雜的生物有機體基因組中，經(jīng)過酶切消化或多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增等步驟，分離出帶有目的基因的DNA片斷。在體外，將帶有目的的基因的外源DNA片斷連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，現(xiàn)成重組DNA

7、分子。將重組DNA分子轉移到適當?shù)氖荏w細胞，并與之一起增殖。從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得重組DNA分子的受體細胞克隆。從這些篩選出來的受體細胞克隆中提取出已經(jīng)得到擴增的目的基因，供進一步分析研究實用。將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能的表達，產(chǎn)生出人類所需要的物質。 圖1 基因工程的一般步驟（一）、目的基因的獲取1直接從染色體DNA中分離：僅適用于原核生物基因的分離，較少采用2人工合成：根據(jù)已知多肽鏈的氨基酸順序，利用遺傳密碼表推定其核苷酸順序再進行人工合成。適應于編碼小分子多肽的基因。3.從mRNA合成cDNA：采用一定的方法釣取特定基因的mRNA，

8、再通過逆轉錄酶催化合成其互補DNA（cDNA）4從基因文庫中篩選5利用PCR合成（二）、目的基因與載體DNA體外重組1. 粘性末端連接法（如圖2）：即同聚物加尾連接法。當載體和目的基因無法采用同一種制酶進行切斷，無法得到相同得粘性末端時，可采用此方法2.人工接尾法（如圖3）3.人工接頭連接法（如圖4） 圖2 粘性末端連接法 圖3 人工結尾法 圖4 人工接頭連接法（三）、重組DNA分子導入受體細胞重組DNA需導入宿主細胞才能進行增殖或表達。重組質?？赏ㄟ^轉化（transformation）方式導入宿主細胞。如果是用噬菌體作為載體的重組體，則需要用外殼蛋白進行包裝，使之成為具有感染能力的噬菌體，再

9、通過轉染(transfection)方式將重組噬菌體DNA導入大腸桿菌等宿主細胞。（四）篩選并鑒定無性繁殖含重組分子的受體細胞（轉化子）1.根據(jù)重組體的表型進行篩選：對于帶有抗藥基因的質粒重組體，可采用插入滅活法（如圖5）進行篩選。 圖5 插入滅活法2. 根據(jù)標志互補進行篩選轉化進來的外源基因產(chǎn)物能夠彌補受體菌株的突變型缺陷。 受體菌： his- 在不含組氨酸的 外源基因：his+ 培養(yǎng)基中生長3.根據(jù)DNA限制酶譜進行分析（如圖6） 圖64.用核酸雜交法（如圖7）進行分析鑒定采用與目的基因部分互補的DNA片段作為探針，與含有重組體的細菌菌落進行雜交，經(jīng)放射自顯影，如結果為陽性，即可確定重組體

10、中帶目的基因。 圖7 核酸雜交法（五）、外源基因的表達1 、原核表達體系大腸桿菌是當前采用最多的原核表達體系 ，尚有一些不足之處：缺乏轉錄后加工機制，只能表達克隆cDNA，不宜表達真核基因組DNA，缺乏適當?shù)姆g后加工機制，表達真核蛋白質不能形成適當折疊或進行糖基化修飾；很難表達大量的可溶性蛋白等。2、真核表達體系與原核表達體系比較，真核表達體系如酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞表達體系顯示了較大優(yōu)勢性。常用于細胞轉染的方法有：磷酸鈣轉染、DEAE葡聚糖介導轉染、電穿孔法、脂質體轉染及顯微注射。三、基因工程在轉基因動物上的應用：（一）轉基因動物的概念 借助基因工程技術把外源目的基因導入生殖細胞、胚胎

11、干細胞和早期胚胎，并在受體染色體上穩(wěn)定整合，使之經(jīng)過各種發(fā)育途徑得到能把外源目的基因傳給子代的個體，即轉基因動物（transgenic animal）3。轉入的目的基因稱為轉基因（transgene），這種轉移目的基因的過程稱為轉基因作用（transgenesis）。關于“轉基因”的概念，通常只限于動、植物中經(jīng)基因工程技術進行的基因轉移，因此品種間不論有性或無性雜交獲得新基因的途徑都不屬此范疇。（二）轉基因動物技術 轉基因動物技術是20世紀80年代初發(fā)展起來的一項生物技術，它克服了物種之間的生殖隔離，實現(xiàn)了動物物種之間遺傳物質的交換和重組。根據(jù)外源基因導入的方法和對象的不同，至今主要有3種途徑

12、可以產(chǎn)生轉基因動物，即顯微注射法、反轉錄病毒法和胚胎干細胞法。 1受精卵原核顯微注射法 顯微注射技術是從動物胚胎學研究移核實驗的基礎上發(fā)展而來。顯微注射法(microinjection)是指通過顯微操作儀把外源基因注入受體動物的受精卵，外源基因整合到受體細胞染色體上，發(fā)育成轉基因動物的技術4。1974年，Jaenisch5應用顯微注射法，在世界上首次成功地獲得了SV40 DNA轉基因小鼠。1981年，Costantini6將兔一珠蛋白基因注入小鼠的受精卵，使受精卵發(fā)育成小鼠，表達出了兔一珠蛋白。20世紀80年代初期人們利用這一方法向動物生殖細胞轉移外源基因，成功地建立了轉基因小鼠。1985年轉

13、基因綿羊和轉基因豬問世，以后轉基因大鼠、兔、雞、牛、魚等都已陸續(xù)取得成功，可見顯微注射法是迄今應用得較為普遍而又最有成效的一種獲得轉基因動物的技術。本方法是在顯微鏡下，用直徑約為1m的玻璃管直接插入受精卵的雄原核內，將毛細管內所帶有的外源基因的DNA注入原核，然后將其移植到假孕母體輸卵管或子宮內并發(fā)育成子代個體。為了解轉基因的整合情況，可酌情應用斑點雜交、多聚酶鏈式反應或Southern印跡雜交等方法對子代個體DNA進行檢測。顯微注射法的優(yōu)點是導入的外源基因片段可長達50 kb，且無需載體，外源基因在宿主染色體上的整合率相對較高。其不足之處是外源基因的整合是隨機的，因而難以控制其整合率；再者，

14、對外源基因能否穩(wěn)定整合于受體基因組的檢測，必須等到子一代個體出生后經(jīng)過選擇才能確定，不利于在生育期長、產(chǎn)仔少的大家畜中應用。2胚胎干細胞介導法 胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）是指從哺乳動物胚胎囊胚期內的細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞，這種細胞具有發(fā)育的多能性，能夠分化出各種組織7。20世紀80年代中期人們開始研究利用ES細胞獲得轉基因動物的方法。這個途徑是將外源基因直接導入ES細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)篩選后再注入到受體囊胚腔中，與其中的囊胚細胞聚集在一起，成為受體胚胎的一部分，參與其分化。由這種胚胎發(fā)育而成嵌合體的轉基因動物，即其中有一部分組織來源于整合有外源基因的供

15、體ES細胞。在嵌合過程中，被轉化的ES細胞分化而成的生殖細胞可通過雜交將引入的外源基因傳遞下去。在以胚胎干細胞為媒介獲得轉基因動物的技術中，既可以用多種方法將外源基因導入ES細胞，且細胞的鑒定、篩選比較方便，又可預先在細胞水平上測定外源基因的拷貝數(shù)、定位和表達的水平以及插入的穩(wěn)定性等，而且將ES細胞注入囊胚的操作較易進行，整合率相對較高。只是建立ES細胞系本身就是一項難度極高的工作，目前小鼠ES細胞系雖已建立，但在豬、羊中還未能得到真正穩(wěn)定的ES細胞株。3.反轉錄病毒轉移基因反轉錄病毒感染法(retrovirus-mediated gene transfer)主要是利用反轉錄病毒DNA的長末端

16、重復序列(LTR)區(qū)域具有轉錄啟動子活性這一特點，將外源基因連接到LTR下部進行重組后，包裝成高滴度病毒顆粒，直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中，攜帶外源基因的反轉錄病毒DNA可以整合到宿主染色體上8。反轉錄病毒是一類含有RNA的動物病毒，它的基因組進入寄主細胞內，在反轉錄酶催化下合成DNA。反轉錄病毒的這種特性說明它有可能是一種天然的轉導因子，可經(jīng)人工操作改建為動物基因的轉移載體。另外，反轉錄病毒感染效率高，但卻不會招致寄主細胞的死亡，被它感染或轉化的動物細胞?？沙掷m(xù)許多世代。反轉錄病毒可用作載體的另一個優(yōu)點是其寄主范圍廣泛，包括無脊椎動物和脊椎動物，其中有的還能夠在人體細胞中生長。 （三）轉

17、基因動物的應用 轉基因動物的研究內容非常廣泛，20世紀8090年代以來從基礎理論到應用技術在深度和廣度上都有了很大發(fā)展，并已日漸由實驗室走向生產(chǎn)實踐。1在基因表達調控研究方面的應用 利用轉基因動物可作為在體內研究外源基因表達調控的“反應器”，下面僅就DNA順式調控元件和基因在發(fā)育中的時空調節(jié)為例予以介紹。（1）順式調控元件的研究 異常的脂蛋白水平與動脈粥樣硬化等疾病有關。人類有5種脂蛋白，各自含有不同的載脂蛋白。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約有17種載脂蛋白，它們的編碼基因已測序，是用于研究心血管疾病的候選基因。把載脂蛋白基因轉入小鼠，可用來研究人脂蛋白代謝、調控以及動脈粥樣硬化。在研究載脂蛋白基因組織特異性表達

18、的順式調控元件時，發(fā)現(xiàn)有兩簇載脂蛋白基因凋節(jié)的組織特異性表達。一簇包括A、C-和 A-基因，定位于人11號染色體長臂2區(qū)3帶（11q23），是按A、C、A的順序組成。C的轉錄方向與其他兩個基因相反。 A-和C-主要在肝和小腸中表達，A-主要在小腸表達。在 C-基因的-0.2-1.4bp之間是調節(jié) A基因在小腸中表達的區(qū)域。這個區(qū)域也是 C和A基因在小腸表達的凋控元件，表明這一元件可以調節(jié)整個載脂蛋白基因簇在小腸的表達。另一基因簇定位于19號染色體長臂1區(qū)3帶（19q13），包含有E、C和C-基因，它們按E、C、C順序排列。E基因主要在肝臟和大部分身體組織中表達，但表達水平低。以后發(fā)現(xiàn)在C基因和

19、C基因之間有一調控區(qū)可使E基因在肝臟內高水平表達，該區(qū)長約154 bp。此外，還證實這個調控區(qū)也調節(jié)該座位其他兩個載脂蛋白基因 C和 C在肝臟的表達。（2）與發(fā)育相關基因的表達與調控 用轉基因動物可研究基因在發(fā)育中的時空調控。珠蛋白基因是研究發(fā)育調控的最好例子。人類珠蛋白基因分為、兩簇，分別定位于16號和11號染色體，各長30kb和60kb。據(jù)1993年的報道，為分析完整的-珠蛋白基因中人的珠蛋白基因的開關調控，Peterson等把一個含有248 kb長的人-珠蛋白基因簇的酵母人工染色體（YAC）轉入小鼠。對轉基因小鼠中此基因簇的表達分析表明，在成年的轉基因動物中只有人-珠蛋白表達；在子一代和

20、子二代動物中證實YAC 座位有樣珠蛋白基因的發(fā)育開關調控，即在卵黃囊中有-和-珠蛋白基因表達，在14天的肝臟中有少量和大量表達，而在成年動物中則僅有珠蛋白基因的mRNA表達。采用先在酵母細胞內通過同源重組的方式使YAC發(fā)生突變，然后把這種突變的YAC導入小鼠，就可以詳細研究整個座位上基因的調控機制，如珠蛋白基因在發(fā)育與分化中的基因表達、定點誘變的基因對發(fā)育凋節(jié)的影響等等。 除前述有關基因表達凋控的研究外，把轉基因動物用于遺傳病動物模型的研制近年來發(fā)展也很快，如把pro-膠原突變基因導入小鼠基因組，可產(chǎn)生類似人的骨發(fā)育不全癥的轉基因小鼠，這對了解人類遺傳病的發(fā)病機理意義重大。2用于基因產(chǎn)品的制備

21、在轉基因動物中，導入的目的基因表達，人們就可以從該動物的乳汁和血液里獲得目的基因產(chǎn)物，因此，可把轉基因動物看作是一種個體表達系統(tǒng)（whole animal expression system），以制備某種基因產(chǎn)物。這樣的轉基因動物常被稱作動物生物反應器（animal bioreactor）。1982年Palmiter把大鼠生長激素基因轉入小鼠，成功地獲得高效表達生長激素的小鼠，其體積明顯增加，證實了用轉基因動物生產(chǎn)外源基因產(chǎn)品的可行性。近年來的報道已證實在轉基因家畜（如豬）的乳腺中可高效合成自身不含有的異源蛋白，如乳清蛋白等。目前，英國正在研究通過羊-乳球蛋白啟動子和乳清蛋白啟動子的控制，在轉

22、基因羊體內表達人1抗胰蛋白酶和凝血因子；在美國已有在轉基因小鼠、乳羊和乳牛乳汁中分別表達產(chǎn)生tPA和促性腺素的研究報道。我國利用轉基因動物為反應器生產(chǎn)基因制品的工作也在展開，最近有關單位已從轉基因羊乳汁中獲得促紅細胞生成素。3動物品種的培育與改良通過外源基因的導人，改造動物的基因組，可達到使家畜、家禽的生長速度加快，肉、蛋或奶產(chǎn)量及品質提高，飼料利用率提高、抗病力加強的目的。加上體細胞克隆技術能使優(yōu)良種畜迅速擴群，可在短時間培育出新品種。對于動物遺傳資源保護的意義更加深遠，對瀕危物種挽救是必不可少的。目前這方面的應用也是轉基因動物最具經(jīng)濟開發(fā)前景的領域之一。把具有優(yōu)良性狀的基因或抗病基因導入畜

23、禽以培育新的品種，這是轉基因動物研究中的一個極重要的方面。如已培育出抗雞白細胞組織增生病毒的轉基因雞新品種。丘才良9把一種寒帶比目魚抗凍蛋白基因(AFP)成功地轉移到大西洋鮭中，為提高某些魚類的抗寒能力做了積極的嘗試，魏彥章10利用人生長激素基因構建的轉基因鯉魚，表現(xiàn)出快速增長的效應。1985年我國學者朱作巖在國際上首次將小鼠MThGH融合基因注入金魚受精卵中，獲得轉基因金魚，其F1比轉基因魚的同代大兩倍。以后該類實驗中還陸續(xù)獲得其他鯽、鯉等幾種轉入生長激素基因的魚。四、展望基因工程技術以其巨大的生命力影響著人類的生活 ，并已逐步滲透到人類生活的各個領域。隨著轉基因技術領域的不斷拓展，在實驗室獲得的新突破和技術成果不斷地運用到生產(chǎn)實踐中去，創(chuàng)造出更多具有優(yōu)良經(jīng)濟性狀的不同種類的轉基因動物，使地球的生物圈變得更加豐富多彩。轉基因技術的出現(xiàn)與發(fā)展為研究動物改良、抗病育種方面，探明人類疾病發(fā)病機理研究以及建立人類遺傳疾病的轉基因動物模型，建立動物生物反應器來生產(chǎn)天然活性藥物蛋白和基因治療以及生產(chǎn)人類器官代用品等方面極具有開發(fā)潛力，轉基因技術的成熟和推廣將給人類帶來無限光明 。參考文獻：1李立家，肖庚富基因工程 M 北京：科學出版社，2 0 0 4 ：1 2蘇明學“基因工程的基本操作程序”的教學分析與設計J生物學通報，2009（44）：33基因工程與轉基因動物J中國禽業(yè)導刊。2001（