生物化學(xué)第2章Ⅱ核酸

1、第四節(jié)第四節(jié) 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)二、核酸的水解二、核酸的水解三、核酸的兩性性質(zhì)三、核酸的兩性性質(zhì)四、核酸的紫外吸收性質(zhì)四、核酸的紫外吸收性質(zhì)五、變性、復(fù)性與雜交五、變性、復(fù)性與雜交1 1、DNADNA為為白色纖維狀固體白色纖維狀固體，RNARNA為為白色粉末狀固白色粉末狀固體體，都微溶于水，其鈉鹽在水中的溶解度較，都微溶于水，其鈉鹽在水中的溶解度較大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有機(jī)大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有機(jī)溶劑。溶劑。（用乙醇從溶液中沉淀核酸）（用乙醇從溶液中沉淀核酸）2 2、DNADNA和和RNARNA在細(xì)胞中常以在細(xì)胞中常以核蛋白核蛋白形式

2、存在，兩形式存在，兩種核蛋白在鹽溶液中的溶解度不同。種核蛋白在鹽溶液中的溶解度不同。 DNADNA核蛋白核蛋白 RNARNA核蛋白核蛋白0.14mol/L NaCl0.14mol/L NaCl - + - + 1-2mol/L NaCl 1-2mol/L NaCl + - + -一、一般物理性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)3 3、DNADNA溶液的溶液的粘度很大粘度很大，而，而RNARNA溶液的粘溶液的粘度度小得多小得多。核酸發(fā)生變性或降解后其。核酸發(fā)生變性或降解后其粘度降低粘度降低。4 4、核酸受到、核酸受到強(qiáng)大離心力強(qiáng)大離心力的作用時(shí)，可從的作用時(shí)，可從溶液中溶液中沉降下來(lái)沉降下來(lái)，其沉降速度與核酸，

3、其沉降速度與核酸的大小和密度有關(guān)。的大小和密度有關(guān)。一、一般物理性質(zhì)一、一般物理性質(zhì)1 1 酸水解酸水解2 2堿水解堿水解3 3酶水解酶水解二、二、核酸的水解核酸的水解核酸分子中的磷酸二酯鍵可在核酸分子中的磷酸二酯鍵可在酸酸或堿性條件下水解或堿性條件下水解 1 1 酸水解酸水解 糖苷鍵和磷酸鍵都能被酸水解糖苷鍵和磷酸鍵都能被酸水解, ,糖苷糖苷鍵比磷酸鍵更容易鍵比磷酸鍵更容易 嘌呤堿的糖苷鍵嘌呤堿的糖苷鍵比嘧啶的比嘧啶的對(duì)酸更不穩(wěn)對(duì)酸更不穩(wěn)定定, ,最不穩(wěn)定是嘌呤與脫氧核糖之間最不穩(wěn)定是嘌呤與脫氧核糖之間的糖苷鍵的糖苷鍵二、二、核酸的水解核酸的水解 2 2 堿水解堿水解 DNADNA和和RNA

4、RNA對(duì)堿的耐受程度有很大差別。對(duì)堿的耐受程度有很大差別。室溫條件下，室溫條件下，DNADNA在堿中變性，但不在堿中變性，但不水解，水解，RNARNA水解。水解。 例如，室溫條件下，在例如，室溫條件下，在0.1 mol/L NaOH0.1 mol/L NaOH溶溶液中，液中，RNARNA幾乎可以完全水解；幾乎可以完全水解；DNADNA在同樣在同樣條件下則不受影響。但溫度條件下則不受影響。但溫度100100度時(shí)，度時(shí)，4 4個(gè)個(gè)小時(shí)也可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。小時(shí)也可得到小分子的寡聚脫氧核苷酸。二、二、核酸的水解核酸的水解 二、二、核酸的水解核酸的水解 3 3 酶水解酶水解 磷酸二酯酶磷酸二

5、酯酶: :非特異水解磷酸二酯鍵非特異水解磷酸二酯鍵 核酸酶核酸酶: :特異水解核酸的磷酸二酯鍵特異水解核酸的磷酸二酯鍵 按底物分類(lèi)按底物分類(lèi): :脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶 按底物作用的方式按底物作用的方式: :核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶 按磷酸二酯鍵斷裂方式按磷酸二酯鍵斷裂方式:3OH:3OH與磷酸間與磷酸間;5OH;5OH與磷與磷 酸間酸間 其他分類(lèi)其他分類(lèi): :雙鏈酶雙鏈酶, ,單鏈酶單鏈酶三、三、核酸的兩性性質(zhì)核酸的兩性性質(zhì)核酸含酸性的磷酸基團(tuán)，又含弱堿性核酸含酸性的磷酸基團(tuán)，又含弱堿性的堿基，為的堿基，為兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì)，可發(fā)生兩性，可

6、發(fā)生兩性解離，解離，核酸的等電點(diǎn)比較低核酸的等電點(diǎn)比較低（DNADNA的等的等電點(diǎn)為電點(diǎn)為4-4.54-4.5，RNARNA的等電點(diǎn)為的等電點(diǎn)為2-2-2.52.5( (低低) )。（核酸在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度。（核酸在其等電點(diǎn)時(shí)溶解度最?。┳钚。┖怂嵯喈?dāng)于多元酸，核酸相當(dāng)于多元酸，pHpH大時(shí)，呈陰離大時(shí)，呈陰離子狀態(tài)；子狀態(tài)；-向向陽(yáng)極陽(yáng)極遷移遷移 在核酸在核酸在在260 nm260 nm附近有最大吸收附近有最大吸收峰；據(jù)此特性可以定性和定量檢峰；據(jù)此特性可以定性和定量檢測(cè)核酸。蛋白質(zhì)在測(cè)核酸。蛋白質(zhì)在280 nm280 nm有一定有一定的吸收峰，因此利用的吸收峰，因此利用D260/OD280

7、D260/OD280比值可判斷核酸樣品的純度。比值可判斷核酸樣品的純度。四、紫外吸收四、紫外吸收減色效應(yīng)減色效應(yīng)：核酸的：核酸的光吸收值通常比各光吸收值通常比各核苷酸成分的光吸核苷酸成分的光吸收之和少收之和少30%-40%30%-40%，這是有規(guī)律的雙螺這是有規(guī)律的雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基緊密旋結(jié)構(gòu)中堿基緊密堆積到一起造成的，堆積到一起造成的，此現(xiàn)象稱(chēng)為此現(xiàn)象稱(chēng)為DNADNA減減色效應(yīng)。色效應(yīng)。五、變性、復(fù)性與雜交五、變性、復(fù)性與雜交（一）、（一）、DNADNA的變性的變性1 1、概念、概念2 2、變性因素、變性因素3 3、變性的指標(biāo)、變性的指標(biāo)1 1、概念、概念 是指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，雙是指核

8、酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，變成無(wú)規(guī)則線團(tuán)的現(xiàn)象。螺旋解開(kāi)，變成無(wú)規(guī)則線團(tuán)的現(xiàn)象。核酸變性其分子中的共價(jià)鍵并沒(méi)有核酸變性其分子中的共價(jià)鍵并沒(méi)有破壞，分子量也不改變，核酸的變破壞，分子量也不改變，核酸的變性（性（ denaturationdenaturation ）2 2、DNADNA的變性的因素的變性的因素 溫度升高；溫度升高；酸堿度改變、酸堿度改變、 pHpH（11.311.3或或5.05.0）；）；有機(jī)溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；有機(jī)溶劑如甲醛和尿素、甲酰胺等；各種射線各種射線低離子濃度低離子濃度 3 3、DNADNA的變性指標(biāo)的變性指標(biāo) 1 1）熔解溫度（熔解溫度（Melting

9、TemperatureMelting Temperature, , TmTm）：DNADNA熱變性發(fā)生在一個(gè)很熱變性發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過(guò)程中光吸收達(dá)到最大吸收性過(guò)程中光吸收達(dá)到最大吸收（完全變性）一半（雙螺旋結(jié)（完全變性）一半（雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半）時(shí)的溫度稱(chēng)為該構(gòu)失去一半）時(shí)的溫度稱(chēng)為該DNADNA的熔點(diǎn)或熔解溫度。（的熔點(diǎn)或熔解溫度。（一般一般DNADNA的的TmTm值在值在80-9580-95 C C之間）之間） Tm Tm 與下列因素有關(guān)：與下列因素有關(guān)： 核酸的均一程度核酸的均一程度，均一性越高的樣，均一性越高的樣品，變性過(guò)程的溫度范圍越

10、小。品，變性過(guò)程的溫度范圍越小。 TmTm與與G-CG-C含量成正比含量成正比。 （G+C)%=(Tm-69.3)X2.44G+C)%=(Tm-69.3)X2.44） TmTm與介質(zhì)離子強(qiáng)度成正比。與介質(zhì)離子強(qiáng)度成正比。mol/LKCl溫度溫度/ /0 0C CA A2602600.020.020.10.11.01.0 2 2）增色效應(yīng)增色效應(yīng)：天然：天然DNADNA分子從雙螺旋分子從雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)閱捂湢罱Y(jié)構(gòu)變?yōu)閱捂湢顟B(tài)時(shí)，它在在紫態(tài)時(shí)，它在在紫外光外光260nm260nm波長(zhǎng)處波長(zhǎng)處的吸收值明顯增的吸收值明顯增加，此現(xiàn)象稱(chēng)為加，此現(xiàn)象稱(chēng)為增色效應(yīng)。增色效應(yīng)。1 1）熔解溫度（熔解溫度（TmT

11、m）：RNARNA本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以本身只有局部的雙螺旋區(qū)，所以變性行為所引起的性質(zhì)變化沒(méi)有變性行為所引起的性質(zhì)變化沒(méi)有DNADNA那樣明顯。那樣明顯。天然狀態(tài)的天然狀態(tài)的DNADNA在完全變性后，紫外在完全變性后，紫外吸收吸收(260 nm)(260 nm)值增加值增加252540%40%. .而而RNARNA變性后，約增加變性后，約增加1.1%1.1%。A A260260值增加值增加粘度下降粘度下降浮力密度增大浮力密度增大分子量不變分子量不變4. DNA4. DNA變性后的表現(xiàn)變性后的表現(xiàn)（二）、（二）、DNADNA的復(fù)性的復(fù)性1 1、概念：、概念：變性變性DNADNA在適當(dāng)?shù)臈l

12、件下，兩條彼在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙此分開(kāi)的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性；螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱(chēng)為復(fù)性；DNADNA的復(fù)性圖示的復(fù)性圖示2 2、影響、影響DNADNA的復(fù)性的因素的復(fù)性的因素分子量越大復(fù)性越難分子量越大復(fù)性越難。濃度越大，復(fù)性越容易濃度越大，復(fù)性越容易。DNADNA的復(fù)性需要一定的鹽濃度，增加的復(fù)性需要一定的鹽濃度，增加鹽濃度，復(fù)性速度加快鹽濃度，復(fù)性速度加快將熱變性的將熱變性的DNADNA驟然冷卻至低溫時(shí)，驟然冷卻至低溫時(shí)，DNADNA不可能復(fù)性。即淬火。不可能復(fù)性。即淬火。但是將變性的但是將變性的DNADNA緩慢冷卻緩慢冷卻時(shí)，

13、可以復(fù)時(shí)，可以復(fù)性，這一過(guò)程也叫性，這一過(guò)程也叫退火退火（annealing)annealing) 退火溫度退火溫度TmTm2525（三）、分子雜交（三）、分子雜交 熱變性的熱變性的DNADNA單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定單鏈，在復(fù)性時(shí)并不一定與同源與同源DNADNA互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，它也也可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源可以與在某些區(qū)域有互補(bǔ)序列的異源DNADNA單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)單鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這樣形成的。這樣形成的新分子稱(chēng)為雜交新分子稱(chēng)為雜交DNADNA分子。分子。 DNADNA單鏈與互補(bǔ)的單鏈與互補(bǔ)的RNARNA鏈之間也可以發(fā)生鏈之間也可以發(fā)生雜交。雜交。So

14、uthern BlotSouthern Blot：DNA-DNADNA-DNA雜交雜交Northern BlotNorthern Blot：DNA-RNADNA-RNA雜交雜交 PCRPCR技術(shù)技術(shù)核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳核酸的雜交在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究中具有重要意義。學(xué)的研究中具有重要意義。分子雜交的種類(lèi)分子雜交的種類(lèi)Southern BlotSouthern Blot：DNA-DNADNA-DNA雜交雜交Northern BlotNorthern Blot：DNA-RNADNA-RNA雜交雜交Western BlotWestern Blot：抗原：抗原- -抗體進(jìn)行雜交抗體進(jìn)行雜交

15、原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯原位雜交：活體組織上進(jìn)行雜交，顯出熒光出熒光 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 核酸的化學(xué)組成 第三節(jié) 核酸的分子結(jié)構(gòu) 第四節(jié) 核酸的性質(zhì) 第五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法第五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸的分離、提純和定量測(cè)定 二二 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 三三 序列測(cè)定序列測(cè)定 四四 PCRPCR 五五 化學(xué)合成化學(xué)合成第五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸的分離、提純和定量測(cè)定 ( (一一) ) 核酸的分離、提純核酸的分離、提純 ( (二二) ) 定量測(cè)定定量測(cè)定第

16、五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸的分離、提純和定量測(cè)定 ( (一一) )核酸的分離、提純核酸的分離、提純 1 1、DNADNA 2 2、RNA RNA 目前分離目前分離DNADNA方法：方法： 鹽抽提，用苯酚和氯仿去蛋白鹽抽提，用苯酚和氯仿去蛋白 SDS/CTABSDS/CTAB 氯化銫密度梯度離心氯化銫密度梯度離心SDS法小量制備法小量制備植物基因組植物基因組DNA的原理的原理 在含有去污劑，如在含有去污劑，如SDS或或CTAB的溶液中，植物細(xì)的溶液中，植物細(xì)胞會(huì)被裂解釋放出細(xì)胞核中的基因組胞會(huì)被裂解釋放出細(xì)胞核中的基因組DNA，通過(guò)氯仿，通過(guò)氯

17、仿/異戊醇的抽提和離心去除掉裂解液中的細(xì)胞碎片、蛋白異戊醇的抽提和離心去除掉裂解液中的細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)以及其它雜質(zhì)，這時(shí)的基因組質(zhì)以及其它雜質(zhì)，這時(shí)的基因組DNA分配在水相中。分配在水相中。 然后用乙醇然后用乙醇(或異丙醇或異丙醇)將水相的將水相的DNA分子沉淀出來(lái)，分子沉淀出來(lái)，最后溶于最后溶于TE緩沖液或純水中備用。緩沖液或純水中備用。1. 剪取新鮮的植物葉片約剪取新鮮的植物葉片約20mg，剪碎置于，剪碎置于1.5ml離心管中；離心管中；2. 向離心管中緩慢加入液氮冷凍植物葉片；向離心管中緩慢加入液氮冷凍植物葉片；3. 在液氮蒸發(fā)去在液氮蒸發(fā)去2/3時(shí)，用自制研杵迅速磨碎葉片；時(shí)，用自制研

18、杵迅速磨碎葉片；4. 立即加入立即加入300uL 65預(yù)熱的提取液搖勻，于預(yù)熱的提取液搖勻，于65水浴約水浴約1hr，其間搖動(dòng)數(shù)次；其間搖動(dòng)數(shù)次；5. 加等體積氯仿加等體積氯仿/異戊醇（異戊醇（24:1）混勻，于）混勻，于12000 rpm離心離心5分；分；6. 轉(zhuǎn)移上清液到另一干凈轉(zhuǎn)移上清液到另一干凈1.5ml離心管中，加入離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻后靜置水乙醇，混勻后靜置2min，14000rpm離心離心5min；7. 傾去上清液并用傾去上清液并用200uL預(yù)冷乙醇（預(yù)冷乙醇（70%）清洗）清洗DNA沉淀，沉淀，14000rpm離心離心5min；8. 用槍頭小

19、心吸去乙醇，自然風(fēng)干用槍頭小心吸去乙醇，自然風(fēng)干DNA后溶于后溶于50uL ddH2O中，中，置置-20保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩Ｖ参锘蚪M植物基因組DNA的小量快速制備方案的小量快速制備方案 2 2、RNARNA注意：用高溫（注意：用高溫（180180度）或度）或DEPCDEPC處理處理 加入加入RNasinRNasin第五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸的分離、提純和定量測(cè)定 ( (一一) ) 核酸的分離、提純核酸的分離、提純 ( (二二) ) 定量測(cè)定定量測(cè)定( (二二) ) 定量測(cè)定定量測(cè)定 紫外分光光度法紫外分光光度法 定磷法定磷法 定糖法定糖法

20、 定磷法定磷法: : 磷含量相對(duì)恒定磷含量相對(duì)恒定, (RNA9.4%; DNA 9.9%), (RNA9.4%; DNA 9.9%) 有機(jī)磷有機(jī)磷 水解成無(wú)機(jī)磷水解成無(wú)機(jī)磷用濃硫酸或過(guò)氯酸用濃硫酸或過(guò)氯酸磷酸磷酸+ +鉬酸鉬酸 磷鉬酸磷鉬酸酸性條件酸性條件還原劑還原劑鉬藍(lán)鉬藍(lán)660nm660nm光密度與磷含量成正比光密度與磷含量成正比定糖法定糖法 ( (核酸含糖核酸含糖) ) 糠醛糠醛+ +與甲基苯二酚與甲基苯二酚( (地衣酚地衣酚) )鮮綠色鮮綠色( (最大最大670nm)670nm)RNA +RNA +鹽酸鹽酸加熱加熱糠醛糠醛FeCl3FeCl3催化劑催化劑DNADNA酸性溶液酸性溶液+

21、 +二苯胺二苯胺加熱加熱藍(lán)色化合物藍(lán)色化合物 ( (最大最大595nm)595nm)第五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸的分離、提純和定量測(cè)定 二二 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 三三 序列測(cè)定序列測(cè)定 四四 PCRPCR 五五 化學(xué)合成化學(xué)合成 二二 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 （一）瓊脂糖凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳 （二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳 DNADNA的凝膠電泳檢測(cè)的凝膠電泳檢測(cè) 通常，通常，瓊脂糖瓊脂糖(agarose)或或聚丙烯酰聚丙烯酰胺胺 (polyacrylamide)凝膠被用于核酸的凝膠被用于核酸的分離研

22、究、鑒定和純化分離研究、鑒定和純化DNA分子。也可分子。也可以用于蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。以用于蛋白質(zhì)與核酸相互作用的研究。瓊脂糖瓊脂糖從紅色海藻瓊脂中提取的良好從紅色海藻瓊脂中提取的良好電泳介質(zhì)，是電泳介質(zhì)，是D-和和L-半乳糖殘基通過(guò)半乳糖殘基通過(guò) 和和 糖苷鍵交替構(gòu)成的糖苷鍵交替構(gòu)成的一種線狀聚合物，瓊脂一種線狀聚合物，瓊脂糖凝膠可以構(gòu)成一個(gè)直徑從糖凝膠可以構(gòu)成一個(gè)直徑從50nm到略大到略大于于200nm的三維篩孔的通道。其密度由瓊的三維篩孔的通道。其密度由瓊脂糖的濃度決定。脂糖的濃度決定。DNADNA的凝膠電泳檢測(cè)的凝膠電泳檢測(cè) （一）瓊脂糖凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳 以以瓊脂糖

23、瓊脂糖為支持物為支持物 操作簡(jiǎn)單、快速，且分離范圍廣操作簡(jiǎn)單、快速，且分離范圍廣 DNADNA在在瓊脂糖瓊脂糖凝膠的遷移速度凝膠的遷移速度 1、核酸分子本身的大小、核酸分子本身的大?。和肿拥哪Σ粒和肿拥哪Σ?系數(shù)成反比的系數(shù)成反比的2、瓊脂糖的濃度、瓊脂糖的濃度：遷移率與膠濃度成反比：遷移率與膠濃度成反比3、DNA的構(gòu)型的構(gòu)型：超螺旋（：超螺旋（I）、環(huán)狀（）、環(huán)狀（II）、）、 線狀（線狀（III）4、所用的電壓、所用的電壓 一般不大于一般不大于5V/cm,一定范圍一定范圍 內(nèi)呈正比內(nèi)呈正比5、電泳緩沖液、電泳緩沖液 溴化乙錠溴化乙錠(ethidiumbromide，簡(jiǎn)稱(chēng)，簡(jiǎn)稱(chēng)EB)是一

24、種核是一種核酸染料，可以插入到酸染料，可以插入到DNA或或RNA分子的分子的堿基之間堿基之間，并在，并在300nm波長(zhǎng)的紫外光照波長(zhǎng)的紫外光照射下放射出橘紅色的熒光，可用來(lái)顯現(xiàn)凝射下放射出橘紅色的熒光，可用來(lái)顯現(xiàn)凝膠中的核酸分子。膠中的核酸分子。在凝膠電泳中，溴化乙錠染料可對(duì)核在凝膠電泳中，溴化乙錠染料可對(duì)核酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感酸分子染色，在紫外光下便可以十分敏感而方便地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中而方便地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA譜帶。譜帶。安全警示：安全警示：EB是一種強(qiáng)的是一種強(qiáng)的DNA誘變誘變劑，使用時(shí)盡量避免觸及皮膚。電泳時(shí)有劑，使用時(shí)盡量避免觸及皮膚。電泳時(shí)有時(shí)使用到較高的電壓，要

25、小心觸電。時(shí)使用到較高的電壓，要小心觸電。DNA的凝膠電泳檢測(cè)的凝膠電泳檢測(cè) DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) +-儀器儀器 電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、移液槍?zhuān)浑娪緝x、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、移液槍?zhuān)凰幤匪幤?Agarose、 loading buffer、 TBE buffer、 EB（溴化乙錠）（溴化乙錠）;上樣緩沖液（上樣緩沖液（6X）配方）配方 0.25% 溴酚藍(lán)、溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯氰醇、二甲苯氰醇、 40%蔗糖；水溶液蔗糖；水溶液4保存。保存。不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍不同濃度瓊脂糖的凝膠分離范圍瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度（，（，W/ V ) DNA分子的有效分離范

26、圍（分子的有效分離范圍（kb)0.7 0.8-100.9 0.5-71.2 0.4-61.5 0.2-32.0 0.1-2PCR擴(kuò)增結(jié)果分析舉例擴(kuò)增結(jié)果分析舉例 M 1 2 3 4 5 6 7 MM, marker;1-2, PCR for CP4-EPSPS gene; 3-4, PCR for 35S Promoter; 5-6, PCR for lectin gene; 7, Negtive control.聚丙烯酰胺凝膠：在由聚丙烯酰胺凝膠：在由TEMED (N、N、N、N-四甲基乙二胺四甲基乙二胺)催化過(guò)硫酸胺還原產(chǎn)生的自由催化過(guò)硫酸胺還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚

27、合形成聚基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線形長(zhǎng)鏈，在交聯(lián)劑丙烯酰胺的線形長(zhǎng)鏈，在交聯(lián)劑N，N-亞甲雙亞甲雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯酰胺丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯酰胺的交聯(lián)鏈形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，鏈長(zhǎng)和交聯(lián)的的交聯(lián)鏈形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，鏈長(zhǎng)和交聯(lián)的程度就決定了凝膠的孔徑，同時(shí)也決定了分離程度就決定了凝膠的孔徑，同時(shí)也決定了分離DNA的能力。的能力。聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠瓊脂糖瓊脂糖凝膠制膠一般將凝膠制膠一般將EBEB直接直接加入加入而而聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠制膠時(shí)制膠時(shí)不能不能將染料加入，會(huì)影響聚合。將染料加入，會(huì)影響聚合。1000bp

28、第五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸的分離、提純和定量測(cè)定 二二 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 三三 序列測(cè)定序列測(cè)定 四四 化學(xué)合成化學(xué)合成 五五 PCRPCR三三 序列測(cè)定序列測(cè)定 1 DNA1 DNA酶法測(cè)序酶法測(cè)序 2 DNA2 DNA的化學(xué)法測(cè)序的化學(xué)法測(cè)序 3 RNA3 RNA的測(cè)序的測(cè)序1 1 DNA DNA酶法測(cè)序酶法測(cè)序 Sanger 于于1975年設(shè)計(jì)快速測(cè)序方法年設(shè)計(jì)快速測(cè)序方法”加減法加減法”三三 序列測(cè)定序列測(cè)定 1 DNA1 DNA酶法測(cè)序酶法測(cè)序 2 DNA2 DNA的化學(xué)法測(cè)序的化學(xué)法測(cè)序 3 RNA3 RNA的測(cè)序的測(cè)序 2 DNA2 DNA的化學(xué)法測(cè)序的化學(xué)法測(cè)序 MaxamMaxam和和Gilbert 于于19771977年發(fā)明年發(fā)明 基本原理基本原理: :特異化學(xué)試劑特異化學(xué)試劑作用與作用與DNADNA分子中分子中的的不同堿基不同堿基, ,然后切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈然后切斷反應(yīng)堿基的多核苷酸鏈3 RNA3 RNA的測(cè)序的測(cè)序第五節(jié)第五節(jié) 核酸的研究方法核酸的研究方法 一一 核酸的分離、提純和定量測(cè)定核酸的分離、提純和定量測(cè)定 二二 核酸的凝膠電泳核酸的凝膠電泳 三三 序列測(cè)定序列測(cè)定 四四 PCRPCR 五五 化學(xué)合成化學(xué)合成DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) The po