發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)方案

1、生物發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一利用酵母富集培養(yǎng)基分離酵母菌實(shí)驗(yàn)二分離純化酵母菌實(shí)驗(yàn)三酵母菌的保藏實(shí)驗(yàn)四 大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定及ph對(duì)生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響實(shí)驗(yàn)五 發(fā)酵罐的構(gòu)造及操作實(shí)驗(yàn)六發(fā)酵罐實(shí)灌滅菌操作實(shí)驗(yàn)七利用7l發(fā)酵罐對(duì)地衣芽鞄桿菌進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)八淀粉酶生成曲線(xiàn)的測(cè)定實(shí)驗(yàn)一.利用酵母富集培養(yǎng)基分離酵母一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過(guò)木實(shí)驗(yàn)加深理解酵母富集培養(yǎng)基的原理和應(yīng)用;2、掌握涂布分離技術(shù)；3、熟悉從口然樣品土壤中分離酵母菌的具體操作方法二實(shí)驗(yàn)原理酵母菌主要分布于含糖高和酸度較高的口然環(huán)境中，在果園表土和漿果、蔬菜、 花蜜和蜜餞等的表而很容易找到它們。在土壤屮，由于各種微生物混雜在一起冃 酵母菌的數(shù)量相

2、對(duì)比較少，故可以利用酵母菌富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，該培 養(yǎng)基含有較高的葡萄糖（5%）和較酸（ph為4. 5）的環(huán)境，以及能抑制多種雜 菌（許多細(xì)菌、放線(xiàn)菌和快速生長(zhǎng)霉菌）的孟加拉紅（玫塊紅），故十分冇利于 酵母菌的增值。三實(shí)驗(yàn)材料土壤（標(biāo)注采集地點(diǎn)）培養(yǎng)基：酵母富集培養(yǎng)基（5%葡萄糖、0.1%樂(lè)索、0.1%硫化鞍、0.25%磷酸二氫 鉀、0.05%磷酸氫二鈉、0.1%七水合硫酸鎂、0.01%七水合硫酸鐵、0.05%酵母膏、 0. 003%孟加拉紅、1. 9%瓊脂 ph4. 5）移液槍、培養(yǎng)血、天平、涂布棒、棉繩、250ml三角瓶、75%酒精棉花、搖床等四實(shí)驗(yàn)步驟1、采集土樣：采集葡萄園或其他果

3、園、菜地等的土壤若干（要求：先鏟去23cm 的表土，再采集土樣）適當(dāng)研碎。2、稱(chēng)取lg 土樣裝入準(zhǔn)備好的30/250ml蒸憾水中震蕩均勻。3、準(zhǔn)備平板：將酵母菌富集培養(yǎng)基加熱融化，待冷卻至50°c左右后，倒2個(gè)平 板，冷卻待用。4、用移液槍吸取200ul樣品，用涂布法分離菌種。5、恒溫培養(yǎng)：將培養(yǎng)皿倒置后防于37°c恒溫培養(yǎng)箱屮培養(yǎng)2d。五結(jié)果記錄將土壤來(lái)源，平板上得到的菌落特征和菌落數(shù)做表記錄六思考題酵母菌富集培養(yǎng)基中為什么要加孟加拉紅實(shí)驗(yàn)二分離純化酵母菌一實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、通過(guò)木實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)掌握對(duì)菌種純化及保種的操作;二實(shí)驗(yàn)原理從混雜微生物群體中獲得只含冇某一種或某一株微生物的過(guò)

4、程稱(chēng)為微生物分離 與純化。在分了生物學(xué)的研究及應(yīng)用中，不僅需要通過(guò)分離純化技術(shù)從混雜的天 然微生物群屮分離出特定的微生物，而且還必須隨時(shí)注意保持微生物純培養(yǎng)物的 “純潔”，防止其他微主物的混入。三實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)基 pda培養(yǎng)基材料：接種環(huán)、試管斜而、酒精燈、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱等四實(shí)驗(yàn)步驟1、觀察前一次實(shí)驗(yàn)平板，找出符合條件的菌落。2、在超凈工作臺(tái)中用接種環(huán)挑取單菌落一環(huán)在平板上畫(huà)z字型線(xiàn)條3、將平板貼好標(biāo)簽后置于37°c恒溫培養(yǎng)箱屮培養(yǎng)2do五結(jié)果記錄記錄純化斜面后的菌落形態(tài)六思考題選取菌落時(shí)要考慮到那些因素及其原因。實(shí)驗(yàn)三酵母菌的保藏實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握細(xì)菌的一般保藏原理和方法2、掌

5、握甘油保種技術(shù)；3、了解菌種衰退的原理實(shí)驗(yàn)原理菌種保藏是將微生物的菌種經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的保存，不污染其它雜菌，及可保持其形態(tài) 特征和生理性狀，減少變異，防止衰老，以便于將來(lái)使用。菌種在傳代過(guò)程屮，原冇的生產(chǎn)性狀會(huì)逐漸下降，這就是菌種的衰退。衰退 由菌株的口發(fā)突變引起，一旦發(fā)現(xiàn)衰退，就必須立即進(jìn)行復(fù)壯。所謂復(fù)壯，就是 通過(guò)純種分離和性能測(cè)定等方法從衰退的群體屮找到為衰退的個(gè)體，已達(dá)到冋復(fù) 該菌株原有形狀的一種措施。要防止衰退，關(guān)鍵是做好菌種的保藏工作，即創(chuàng)造 一定的物理和化學(xué)條件，如低溫、干燥、缺氧氣或缺養(yǎng)料等，來(lái)降低微生物細(xì)胞 內(nèi)酶的活性，使微生物代謝作用緩慢，其至處于休眠狀態(tài)。所以保藏菌種一般是 選

6、用它的休眠休，如抱子；芽抱等等，并且要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)低溫；干燥；缺氧；避光 和缺少營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境條件，以利于休眠體能長(zhǎng)期地處于休眠狀態(tài)。對(duì)于不產(chǎn)抱子的 微生物，應(yīng)使其新陳代謝處于最低狀態(tài)，又不會(huì)死亡，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的 三實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)基：pda培養(yǎng)基材料:30%甘油、接種環(huán)、試管斜面、酒精燈、超凈工作臺(tái)、移液管、1ml移液 槍、5ml移液槍、1ml/5ml槍頭、恒溫培養(yǎng)箱等四實(shí)驗(yàn)步驟5、菌種保藏一、斜面低溫保藏法： 此法為最常用的一種。一般霉菌；放線(xiàn)菌和有芽泡 的細(xì)菌可保存24個(gè)月，酵母菌可保存2個(gè)月，無(wú)芽砲的細(xì)菌最好每周移接一 次。操作過(guò)程如下：保藏：選取生長(zhǎng)健壯的菌種，于其試管帶棉塞的上半部用滅

7、菌的塑料包扎好，以 防棉塞受潮感染雜菌。置于4°c冰箱中保藏。二、 液體石臘保藏法： 此法可用不分解石臘的菌種保藏。保存吋間是半年至 一年。放線(xiàn)菌；霉菌和產(chǎn)芽胞菌可保藏二年。液體石臘可防止培養(yǎng)基水分的蒸發(fā), 而引起的菌種死亡。同時(shí)可阻止氧氣進(jìn)入，防止好氧菌的生長(zhǎng)。從而延長(zhǎng)菌種保 藏的時(shí)間。但需注意的是試管必須直立放置，并且不便攜帶。操作過(guò)程如下：1、液體石臘的滅菌：將液體石臘裝入錐形瓶中，量不超出錐形瓶體積的1/3, 塞上棉塞，包扎好后，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌二次（120°c30分鐘）。再在110120°c 干燥箱中蒸發(fā)掉蒸汽滅菌時(shí)帶入的水分。此時(shí)石臘透明清亮狀。經(jīng)檢驗(yàn)

8、確定無(wú)菌 后備用。2、菌種培養(yǎng)：挑取前一次純化的健狀單菌落保藏3、加石臘油：用無(wú)菌管吸取石臘油加入菌種試管中，以高出菌種斜面頂點(diǎn)lcm 為宜。少了會(huì)因培養(yǎng)基露出油面，而使培養(yǎng)基變干造成菌死亡。4、收藏：試管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱屮4°c。5、恢復(fù)使用：當(dāng)要使用菌種時(shí)。傾出石臘油。此石臘油可再滅菌重復(fù)使用。接 種培養(yǎng)。由于菌體外粘有油。第一次的菌生長(zhǎng)緩慢，性狀恢復(fù)不是很好。所以要 再移植一次才能得到良好的菌種。六思考題除了上述兩種菌種保藏方法外述有那些保藏法，其各自的優(yōu)點(diǎn)是什么?實(shí)驗(yàn)四大腸桿菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定及ph對(duì)其生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響一、目的要求了解大腸桿菌生r曲線(xiàn)的基本特征，從而

9、認(rèn)識(shí)微生物在一定條件下生、繁殖的 規(guī)律。二、基本原理一定量的微生物，接種在適合的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜的溫度下培養(yǎng)，以菌 數(shù)的對(duì)數(shù)作縱坐標(biāo)，生長(zhǎng)時(shí)間作橫坐標(biāo)，做出的曲線(xiàn)叫生長(zhǎng)曲線(xiàn)。一般可分為延 遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個(gè)吋期。不同的微生物有不同的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，同 一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長(zhǎng)曲線(xiàn)也不一樣。微生物在不同的ph值的 環(huán)境中的生長(zhǎng)情況也不一樣，因此，測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線(xiàn)對(duì)于了解和掌握微生 物的生長(zhǎng)規(guī)律是很冇幫助的。測(cè)定微生物生長(zhǎng)曲線(xiàn)的方法很多，冇血球計(jì)數(shù)法、 平板菌落計(jì)數(shù)法、稱(chēng)重法、比濁法等。木實(shí)驗(yàn)采用比濁法測(cè)定，由于細(xì)菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可利用光 電比色計(jì)

10、測(cè)定菌懸液的光密度來(lái)推知菌液的濃度，并將所測(cè)得的光密度值（0d 值）與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。三、器材培養(yǎng)1820小時(shí)的大腸桿菌培養(yǎng)液，盛有30ml肉膏蛋白豚液體培養(yǎng)基的250ml 三角瓶；72型或72. 1型分光光度計(jì)，自控水浴振蕩器或搖床，無(wú)菌吸管，離 心管,離心機(jī),ph計(jì)等。!1!操作步驟1. 配制培養(yǎng)基和分裝配制好不同ph值（4、5、6、7、8、9、10）的肉膏蛋白月東液體培養(yǎng)基,分裝到250ml 三角瓶中，分裝量為30/250ml,滅菌。2. 接種用1沁 無(wú)菌吸管，毎次準(zhǔn)確地吸取lml大腸桿菌培養(yǎng)液，分別接種到已滅菌的肉 膏蛋白豚液體培養(yǎng)基大試管屮，

11、接種后振蕩，使菌體混勻。3. 培養(yǎng)將接種后錐形瓶置于搖床上，3vc, 180rmp/s振蕩培養(yǎng)。分別在0、2、4、6、8、 10、12、14、16、20小時(shí)在無(wú)菌環(huán)境中取2nd于滅菌的離心管中，立即放冰箱中 貯存，最后一同比濁測(cè)定光密度值。4. 比濁測(cè)定以未接種的肉膏蛋白月東培養(yǎng)基作空白對(duì)照，選用540-560nm波長(zhǎng)進(jìn)行光電比濁 測(cè)定。從最稀濃度的菌懸液開(kāi)始依次進(jìn)行測(cè)定，對(duì)濃度大的菌懸液用未接種的肉 膏蛋白陳液體培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后測(cè)定，使其光密度值在0. 1-0. 65以?xún)?nèi)，記錄 od值時(shí)，注意乘上所稀釋的倍數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1. 結(jié)果（1）將測(cè)定的0d值填入自制表格。（2）繪制大腸桿菌的生長(zhǎng)曲

12、線(xiàn)2 思考題（1）為什么說(shuō)用比濁法測(cè)定的細(xì)菌生長(zhǎng)只是表示細(xì)菌的相對(duì)生長(zhǎng)狀況？（2）在生長(zhǎng)曲線(xiàn)屮為什么會(huì)出現(xiàn)穩(wěn)定期和衰廣期？在生產(chǎn)實(shí)踐屮怎樣縮短延遲 期？怎樣延氏對(duì)數(shù)期及穩(wěn)定期？怎樣控制衰亡期？試舉例說(shuō)明。實(shí)驗(yàn)五發(fā)酵罐的構(gòu)造及操作【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、熟知發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)和管路。2、學(xué)習(xí)空壓機(jī)的使用。3、學(xué)習(xí)蒸汽發(fā)生器的使用?！緦?shí)驗(yàn)原理】按照生物反應(yīng)器的類(lèi)型，發(fā)酵罐可分為三大類(lèi)。（1）敞口式發(fā)酵：屈于繁殖速度快的好氧發(fā)酵，例如酵母工業(yè)；（2）半密閉式發(fā)酵：如酵母菌等的發(fā)酵，大多數(shù)情況下屬于不是很?chē)?yán)格的厭氧發(fā)酵；（3）密閉式發(fā)酵：主要是好氣性的液體 深層培養(yǎng)，要求復(fù)雜，但無(wú)菌程度高。發(fā)酵罐的主要部件包括以下

13、兒部分。罐體：主要用來(lái)培養(yǎng)發(fā)酵各種菌體，密 封性要好（防止菌體被污染）；罐體當(dāng)屮冇攪拌漿，用于發(fā)酵過(guò)程當(dāng)屮不停的攪 拌；空氣處理系統(tǒng)，用來(lái)供給菌體生長(zhǎng)所需耍的空氣或氧氣；蒸汽凈化系統(tǒng)以供 給發(fā)酵罐空消及實(shí)效所需蒸汽；罐體上冇控制傳感器，最常用的冇ph電極和容 氧電極，用來(lái)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程屮發(fā)酵液ph和do的變化。此外有些發(fā)酵罐還配備 有電氣控制系統(tǒng)，用來(lái)顯示和控制發(fā)酵條件等等。【實(shí)驗(yàn)材料】保興bio-tech2002發(fā)酵罐，空氣發(fā)生器，空氣壓縮機(jī)。【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容】認(rèn)識(shí)發(fā)?系統(tǒng)的構(gòu)造，以及各個(gè)部分的功能:（1）構(gòu)造：發(fā)酵系統(tǒng)由三大組塊構(gòu)成：空氣壓縮機(jī)，蒸汽發(fā)生器，自控發(fā)酵罐（2）空氣壓縮機(jī)：用來(lái)供給菌體

14、生長(zhǎng)所需要的空氣或氧氣蒸汽發(fā)生器：供給發(fā)酵罐空消及實(shí)消所需蒸汽罐體：主要用來(lái)培養(yǎng)發(fā)酵各種菌體，密封性要好(防止菌體被污染)；罐體 當(dāng)中有攪拌漿，用于發(fā)酵過(guò)程當(dāng)中不停的攪拌；罐體上還有控制傳感器，最常用 的冇ph電極和溶氧電極，用來(lái)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程屮發(fā)酵液ph和do的變化。2. 空氣壓縮機(jī)的使用(1) 接通電源，將k1調(diào)整至auto檔位。(2) 待電機(jī)自動(dòng)停止加壓后，壓力指針指為6(3) 將調(diào)節(jié)閥f輕輕上提，旋轉(zhuǎn)，調(diào)整空氣壓力為0.2。(4) 打開(kāi)k2。空氣壓縮機(jī)開(kāi)啟完畢。開(kāi)啟完畢后，只需保證電源，在壓力一切正常的條件 下，不必有其他操作。2.蒸汽發(fā)生器的使用(1)將進(jìn)水口接好蒸憾水，保證蒸徭水水位

15、正常，連通皮管內(nèi)充滿(mǎn)蒸徭水。(2)聽(tīng)到蒸傭水不再流向蒸汽發(fā)生器時(shí)，接通電源，打開(kāi)電源鍵po(3)隨著不斷加熱，一段時(shí)間后，鍋爐內(nèi)的溫度和壓力不斷上升，壓力上 升至60kg/cm2,此時(shí)加熱系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)關(guān)閉，壓力和溫度不再上升。蒸汽發(fā)生器開(kāi)啟完畢。開(kāi)啟完畢后，需保證電源和蒸憎水的供應(yīng)即可。3. 認(rèn)識(shí)發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)，發(fā)酵罐空消的流程和具體操作步驟(1)壓縮空氣經(jīng)凈化器(外接)進(jìn)入氣源接口、減壓穩(wěn)壓器、空氣流量計(jì)、空氣出口進(jìn)入空氣過(guò)濾器到達(dá)反應(yīng)器內(nèi)，經(jīng)特制的空氣分布器分散后，進(jìn)入培養(yǎng) 基，尾氣經(jīng)冷凝器、排氣過(guò)濾器后排口排出，本管路具冇減壓、計(jì)量、凈化作用。(2) 自來(lái)水進(jìn)盤(pán)管：自來(lái)水經(jīng)閥w3、電磁閥w4

16、、夾套盤(pán)管進(jìn)水口、夾套內(nèi) 置盤(pán)管、盤(pán)管水出口及冷凝水閥vi排出。(3) 自來(lái)水進(jìn)冷凝器：自來(lái)水經(jīng)w2、冷凝器下部進(jìn)水口進(jìn)入冷凝器，冷凝 器上部出口排出。(4) 自來(lái)水夾套注水：自來(lái)水經(jīng)w1進(jìn)入夾套，經(jīng)夾套排氣閥v2排出。(5) 蒸汽經(jīng)蒸汽閥s1進(jìn)入夾套內(nèi)盤(pán)管對(duì)夾套內(nèi)水加熱，冷凝水經(jīng)閥vi排(6) 被加熱的夾套水產(chǎn)生的蒸汽經(jīng)夾套上法蘭屮的平衡口 n8進(jìn)入鐘罩內(nèi)， 鐘罩內(nèi)的蒸汽冷卻后的冷凝水回流進(jìn)入夾套。(7) 頂部取樣閥口 k8與k6連通。(8) 過(guò)濾器側(cè)口 k5與排氣過(guò)濾器k2 口連通。(9) 將溶氧電極和和ph電極裝入發(fā)酵罐內(nèi)。【思考題】1補(bǔ)料瓶如何連接？實(shí)驗(yàn)六發(fā)酵罐實(shí)罐滅菌操作【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

17、1、學(xué)習(xí)ph電極的標(biāo)定。2、學(xué)習(xí)溶氧電極的標(biāo)定。3、熟悉蒸汽發(fā)生器和空壓機(jī)的操作。4、掌握實(shí)罐滅菌的操作原理和方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】本實(shí)驗(yàn)用分批滅菌，即將培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中，用蒸汽加熱，達(dá)到預(yù)定滅菌 溫度后維持一段吋間，再冷卻到發(fā)酵溫度，然后接種進(jìn)行發(fā)酵，這種滅菌又叫實(shí)罐滅菌。其 特點(diǎn)是原料的滅菌和微生物的發(fā)酵在同一罐中進(jìn)行。優(yōu)點(diǎn)：i、設(shè)備簡(jiǎn)單，不需 要專(zhuān)門(mén)的滅菌設(shè)備；2、操作簡(jiǎn)單易行。缺點(diǎn)：1、加熱和冷卻所需的時(shí)間長(zhǎng)，降 低了發(fā)酵罐的利用率，是生產(chǎn)周期延長(zhǎng)；2、無(wú)法采用高溫短時(shí)間的滅菌方法。 使用于規(guī)模較小的發(fā)酵罐。ph電極（溶氧電極也一樣）標(biāo)定的原理是通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的ph緩沖液來(lái)校正ph 電極及信號(hào)

18、變送放大過(guò)程中引起的測(cè)量誤差，是控制器檢測(cè)顯示值與標(biāo)準(zhǔn)ph緩 沖液保持一致，以提高測(cè)量精度?！緦?shí)驗(yàn)材料】1、實(shí)驗(yàn)儀器：保興bio-tech2002發(fā)酵罐，空氣發(fā)生器。2、實(shí)驗(yàn)試劑：ph標(biāo)準(zhǔn)緩沖液?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】1. 加料將配好的培養(yǎng)基（教學(xué)可用口來(lái)水）通過(guò)加料口添加至發(fā)酵罐內(nèi)，蓋好加料 口。2. ph電極的標(biāo)定1）根據(jù)發(fā)酵過(guò)程的ph值變化范圍偏酸還是偏堿，可以分為兩種情況，偏 酸性情況和偏堿性情況。現(xiàn)以偏酸性為例。2）進(jìn)入主菜單，按f3進(jìn)入標(biāo)定界面。再按f1進(jìn)入ph電極標(biāo)定功能模塊。3）按fl：輸入緩沖液的溫度，一般情況緩沖液為25°c,標(biāo)定后測(cè)量顯示值 就是標(biāo)定值。4）取出ph電極，

19、用蒸憎水沖洗干凈，拿吸水紙吸干，然后插入6.86的零 點(diǎn)緩沖液中。按f2輸入標(biāo)定ph零點(diǎn)的緩沖液值6.86,待基本穩(wěn)定不變后， 根據(jù)操作步驟，確認(rèn)ph零點(diǎn)“標(biāo)定開(kāi)始”；等到ph穩(wěn)定后確認(rèn)ph零點(diǎn)“標(biāo) 定結(jié)束”。此時(shí)測(cè)量值顯示為輸入的零點(diǎn)值。5）將屯極從6.86的零點(diǎn)緩沖液中取出，用蒸惚水沖洗干凈，拿吸水紙吸干, 然后插入4.00的零點(diǎn)緩沖液屮。按f3輸入標(biāo)定斜率的緩沖液值4.00,待基 本穩(wěn)定不變后，根據(jù)操作步驟，確認(rèn)ph斜率“標(biāo)定開(kāi)始”；等到ph穩(wěn)定后 確認(rèn)ph斜率“標(biāo)定結(jié)束”。此時(shí)測(cè)量值顯示為輸入的斜率值。6）為了使標(biāo)定更加準(zhǔn)確，可以重復(fù)4）, 5）步驟。3. 連接管路1）取下馬達(dá)，罐頂蓋

20、上保護(hù)蓋；取下ph電極電纜線(xiàn)，蓋保護(hù)蓋；取下消 泡電纜；取下溶氧電極電纜，蓋好保護(hù)蓋。2）拆下冷凝器上的進(jìn)出水管。（注意出水管中殘留的水濺出）3）所有濾器兩端均用夾了封閉。4）用夾子封閉取樣管4. 開(kāi)始滅菌1）開(kāi)夾套排氣閥v2,開(kāi)夾套進(jìn)水閥w1,當(dāng)閥v2出口有水流出關(guān)夾套進(jìn)水 閥w1,再關(guān)閥v2。2）移去夾套蒸汽平衡閥v3,用保護(hù)罩蓋住發(fā)酵罐，并用傾倒螺釘鎖緊法蘭, 開(kāi)保護(hù)罩頂部排氣閥v4。3）啟動(dòng)蒸汽發(fā)生器。4）關(guān)進(jìn)水閥w3,開(kāi)冷凝水閥vi,開(kāi)蒸汽發(fā)生器出口閥、緩緩開(kāi)蒸汽閥s1, 蒸汽進(jìn)入夾套內(nèi)盤(pán)管。升溫過(guò)程屮調(diào)整閥vi,節(jié)約蒸汽提高效率。5）當(dāng)罩頂部v4 口有蒸汽排出時(shí)，2分鐘后關(guān)閉v4,

21、當(dāng)罐溫接近120攝氏 度或保溫溫度吋，微開(kāi)閥v4適量排氣，并調(diào)整蒸汽閥s1維持罐溫。6）保溫過(guò)程應(yīng)根據(jù)罐溫及吋調(diào)整蒸汽閥s1.5. 滅菌結(jié)束1）保溫結(jié)束后，關(guān)蒸汽閥s1,全開(kāi)冷凝閥vi,開(kāi)水閥w3,并將溫度控制 設(shè)定為自動(dòng)。2）微開(kāi)閥v2排出夾套內(nèi)過(guò)多的水。3）將溫度降至100°c以下,緩緩開(kāi)排氣閥v4（排氣過(guò)大會(huì)損壞排氣過(guò)濾器）, 使保護(hù)罩頂部的壓力表指示為零，移去保護(hù)罩。4）將進(jìn)氣過(guò)濾器k7 i，與控制箱左側(cè)空氣出i連通，開(kāi)彈簧夾，對(duì)發(fā)酵 罐進(jìn)行通氣，調(diào)整空氣流量35l/min。5）將閥v3裝入n8 口。消毒結(jié)束?！咀⒁狻浚簻缇戤叄?qǐng)關(guān)閉蒸汽發(fā)生器并排去蒸汽發(fā)生器內(nèi)的殘汽。oi

22、p實(shí)驗(yàn)七利用7l發(fā)酵罐對(duì)地衣芽抱桿菌進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、熟悉利用小型發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)的基木操作；2、掌握相關(guān)參數(shù)的設(shè)置及控制方式的設(shè)定；3、補(bǔ)料速度的校正；4、高密度培養(yǎng)地衣芽他桿菌。【實(shí)驗(yàn)原理】1. 地衣芽砲桿菌細(xì)胞形態(tài)為桿狀，呈單生排列，其活菌形式進(jìn)入人或動(dòng)物 腸道后，對(duì)葡萄球菌、酵母菌等致病菌冇拮抗作用，而對(duì)雙歧桿菌、乳 酸菌、笑話(huà)鏈球菌等有促進(jìn)生長(zhǎng)作用，可促使機(jī)體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)， 殺滅致病菌。此外，地衣芽抱桿菌通過(guò)奪氧生物效應(yīng)可以使腸道缺氧從 而冇利于大量厭氧菌生長(zhǎng)，是一種重要的微生物調(diào)劑劑，目前已大規(guī)模 應(yīng)用于“整腸生”等紗品及其他保健制劑的制造生產(chǎn)。2. 由于地

23、衣芽抱桿菌的代謝會(huì)受到營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)、ph、溫度、溶解氧等一系列 外界條件的影響，因此選擇合適的發(fā)酵條件對(duì)于菌劑的牛產(chǎn)吋非常必要 的。本實(shí)驗(yàn)要求同學(xué)結(jié)合發(fā)酵工程的基本知識(shí)，對(duì)該菌進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵, 并記錄其發(fā)酵罐參數(shù)。3. 培養(yǎng)條件控制：培養(yǎng)基是菌體生長(zhǎng)和代謝的基質(zhì)，其組成對(duì)菌體的生長(zhǎng) 和代謝起著重要的作用。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中所消耗的物料按添加的形式 來(lái)看有兩大類(lèi)，一是在接種前加入培養(yǎng)基屮的，一是在發(fā)酵過(guò)程屮流加 的。流加的這一部分，或多或少地也起到一定的代謝調(diào)節(jié)作用。4. 碳源碳源是構(gòu)成菌體和產(chǎn)物的碳架來(lái)源及能量來(lái)源。5. 氮源氮源是菌體蛋白質(zhì)等含氮物質(zhì)和谷氨酸中氮的來(lái)源。氮源分為無(wú) 機(jī)氮源和冇機(jī)氮源

24、。菌體利用冇機(jī)氮源比較緩慢，利用無(wú)機(jī)氮源比較迅速， 無(wú)機(jī)氮源有氨水、尿素、液氨、硫酸鞍、碳酸鞍、氯化錢(qián)、硝酸鞍等。氨氮 和尿素氮較硝基氮優(yōu)越，因?yàn)橄趸冉?jīng)過(guò)還原才能被利用。因此，要根 據(jù)菌種和發(fā)酵特點(diǎn)合理選擇氮源。釆用不同的氮源，其使用方法也不同，尿 素使用方便，但發(fā)酵液ph響應(yīng)較慢，同時(shí)，ph的響應(yīng)程度還受菌種床酶活 性、攪拌速度、罐壓及風(fēng)量的影響，多因索造成了 ph的波動(dòng)較大，對(duì)菌體 的后期（產(chǎn)酸期）活性影響較大。6. 溫度對(duì)發(fā)酵的影響發(fā)酵過(guò)程從本質(zhì)上來(lái)講是一個(gè)發(fā)熱過(guò)程，是一個(gè)放熱 反應(yīng)，再加上機(jī)械攪拌所產(chǎn)生的熱量，是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程呈現(xiàn)溫度上升的現(xiàn)象, 發(fā)酵中生物熱的產(chǎn)生有一定的規(guī)律。在

25、發(fā)酵初期，菌體處在適應(yīng)期，菌數(shù)少， 呼吸作用緩慢，產(chǎn)生熱量較少。當(dāng)菌體處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期吋，菌體繁殖吒盛， 呼吸作用激烈，菌體數(shù)量急劇增加，大量產(chǎn)熱，溫度上升快，這一點(diǎn)在大種 量工藝屮尤為明顯，因此必須控制溫度。發(fā)酵后期，菌體的生長(zhǎng)已經(jīng)基本停 止，主要靠體內(nèi)的酶系進(jìn)行發(fā)酵作用，產(chǎn)生熱量不多，溫度上升不打，且有 逐漸降低的趨勢(shì)。溫度對(duì)發(fā)酵的影響是多方面的，從酶學(xué)動(dòng)力學(xué)方面來(lái)看，溫度升高，反 應(yīng)速度加快，菌體生長(zhǎng)加快，產(chǎn)生生成期提前到來(lái)。但酶較易受熱失活，溫 度升高，失活越快，菌體衰老越快，這使得發(fā)酵周期延長(zhǎng)，殘?zhí)窍牟槐M， 也給產(chǎn)物分離帶來(lái)不便。4. ph對(duì)發(fā)酵的影響ph對(duì)微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物積累

26、都冇很人的影響。 不同種類(lèi)的微生物對(duì)ph的要求不同，大多數(shù)細(xì)菌的最是ph為6.57.5,霉 菌一般為ph 4.85.8,酵母為ph 3.86.0,谷氨酸產(chǎn)生菌的最適ph為6.58.0, 各個(gè)不同的菌種又略?xún)硬煌?。ph對(duì)微生物的生長(zhǎng)繁殖和代謝產(chǎn)物形成的影響有以下幾個(gè)方面，ph 影響菌的活性，當(dāng)ph抑制菌體中某些酶的活性時(shí)，使菌體的新陳代謝受阻; ph影響微生物細(xì)胞膜所帶的電荷，從而改變細(xì)胞膜的滲透性，影響微牛物 對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收及代謝產(chǎn)物的排泄，因此影響新陳代謝的正常進(jìn)行；ph 影響培養(yǎng)基某些組分和中間代謝產(chǎn)物的離解，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的 利用；ph不同，往往引起菌體代謝過(guò)程的不同，使代謝

27、產(chǎn)物的質(zhì)量和比例 發(fā)生改變。5. 通風(fēng)和攪樣對(duì)發(fā)酵的影響發(fā)酵的不同階段對(duì)氧的要求不同，一般在菌體生長(zhǎng)繁殖期比谷氨酸生成期對(duì)溶解 氧的耍求低一些，發(fā)酵罐屮溶氧程度主要冇攪拌速度、通風(fēng)量和罐壓三者協(xié)同決 定。(1) 罐壓：在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵罐處于帶壓狀態(tài)，這主要是基 于兩個(gè)方面的考慮，一是正壓可以防止雜菌通過(guò)空氣系統(tǒng)以外 的任何渠道進(jìn)入發(fā)酵罐，較少環(huán)境對(duì)發(fā)酵的污染概率。二是增 加發(fā)酵罐中的氧分壓，提高發(fā)酵液中的氧濃度。發(fā)酵罐的設(shè)計(jì) 壓力一般是0.3mpa, 一般使用壓力是o.impa,建議使用壓力0.05mpao（2）攪拌：攪拌與攪拌器的型式、葉片直徑、轉(zhuǎn)速和攪拌器在發(fā)酵 罐中的相對(duì)位置等冇關(guān)

28、因素決定。一般攪拌器直徑越大，速度 越快，則溶氧系數(shù)約高，反z則溶氧系數(shù)小。（3）風(fēng)量：在罐壓一定的情況下，風(fēng)量的增加可以增加發(fā)酵罐培養(yǎng) 基中的氧分壓，通風(fēng)的計(jì)算，一般采用每分鐘發(fā)酵液體積與所 通的空氣體積之比來(lái)確定，如風(fēng)量1:0.5表示每分鐘每立方米發(fā) 酵液屮通入0.5n?的空氣。罐壓恒定時(shí)，尾風(fēng)風(fēng)量與進(jìn)風(fēng)風(fēng)量相 同，因此，在實(shí)際操作中，我們用安裝在發(fā)酵罐尾氣排放口上 的空氣流量計(jì)來(lái)讀取數(shù)據(jù)。6. 泡沫對(duì)發(fā)酵的影響泡沫是發(fā)酵過(guò)程屮必然會(huì)出現(xiàn)的現(xiàn)彖，泡沫對(duì)發(fā)酵液的特性（如組分、 黏度等）相關(guān)，也與發(fā)酵控制參數(shù)（如罐壓、攪拌、風(fēng)量等）相關(guān)。正常的發(fā)酵泡沫口j完全處在控制之下。泡沫的失控，往往意味

29、著有意外的 情況發(fā)生。泡沫過(guò)多，會(huì)影響到發(fā)酵的正常進(jìn)行。如會(huì)引起發(fā)酵罐內(nèi)大 量溢出而造成浪費(fèi)和環(huán)境污染。泡沐上升到罐頂，可能從軸封滲出，造 成染菌。為了避免發(fā)生這種現(xiàn)象，當(dāng)泡沫過(guò)多時(shí)，必須減少發(fā)酵罐的裝填系數(shù)，但這樣也就減少了設(shè)備的利用率。泡沫過(guò)多，還影響氧的傳遞, 影響通風(fēng)與攪拌的效果。當(dāng)泡沫穩(wěn)定時(shí)，若代謝氣體不能及時(shí)排除就會(huì) 妨礙菌體的呼吸作用，使代謝不正常，甚至使菌體自溶。因此，在發(fā)酵 過(guò)程中如何避免泡沫的過(guò)多產(chǎn)生是需要重視的問(wèn)題。發(fā)酵工業(yè)上消除泡沫的方法常用的冇兩種，機(jī)械消泡和化學(xué)消泡劑 消泡。生產(chǎn)以及實(shí)驗(yàn)中，要根據(jù)消泡原理和發(fā)酵液的性質(zhì)、要求選擇不 同的消泡劑。【實(shí)驗(yàn)材料】 蒸汽發(fā)生

30、器、發(fā)酵罐、空壓機(jī)?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、培養(yǎng)基的配制按工藝要求配制發(fā)酵培養(yǎng)基，7l發(fā)酵罐定容5l,實(shí)際配料吋，定容到預(yù)定 休積的75%左右（即7l發(fā)酵罐定容3.7l）,另25%體積為蒸汽冷凝水和種子液 預(yù)留。種子培養(yǎng)基（g-l1）:蛋白月東10g/l,牛肉膏10g/l,氯化鈉5g/lo發(fā)酵培養(yǎng)基（g-l4 ）:可溶性淀粉15g/l,酵母膏o.2g/l,蛋刨東5g/l,硫酸2.5g/l, 磷酸二氫鉀2.50l,七水和硫酸鎂o.o250l,碳酸鈣o.o5g/l初始ph7.2加料打開(kāi)罐蓋上的加料口，將培養(yǎng)基原液加入發(fā)酵罐內(nèi)。擰緊加料口螺母（注：不要擰的太緊，否則會(huì)損壞密封圈）2、實(shí)消按實(shí)驗(yàn)7完成ph電極

31、標(biāo)定，do電極標(biāo)定，實(shí)消。3、接種（1）火焰封口法：將前次實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備的種子接入發(fā)酵罐。接種時(shí)，先緩慢將罐 壓降低到o.oimpa,關(guān)小進(jìn)氣閥，在接種口上用火焰封口，并將蓋放置 在裝冇75%酒精的培養(yǎng)1111內(nèi)，防止污染。將菌種液在火焰封口下倒入發(fā) 酵罐內(nèi)，蓋上接種閥，旋緊。（2）壓差接種法：為發(fā)酵工業(yè)常用的接種方法。將罐頂流加口在火焰封口 下連接到裝冇菌種的抽濾瓶側(cè)口管道上；將發(fā)酵罐壓力加大到 o.impa,打開(kāi)流加口閥，使發(fā)酵罐和菌種瓶壓力平衡后，關(guān)閉流加閥;打開(kāi)發(fā)酵罐排氣閥，使壓力下降到0.010.02mpa （不能降為零），關(guān) 閉排氣閥，是發(fā)酵罐和菌種瓶間形成壓力差；打開(kāi)流加口閥，依靠壓 力差將菌種液壓入發(fā)酵罐；重復(fù)步驟，直到所有菌種都?jí)喝氚l(fā) 酵罐為止；注意：由于抽濾瓶帶壓作業(yè)，為安全起見(jiàn)，耍選用優(yōu)質(zhì)的抽 濾瓶，并在瓶外加上帆布瓶套，防止意外炸瓶傷人。4、發(fā)酵過(guò)程的控制(1) 發(fā)酵過(guò)程的溫度控制：谷氨酸發(fā)酵012h為長(zhǎng)菌期，最適溫度在 3032°c,發(fā)酵12h后，進(jìn)入產(chǎn)酸期，控制溫度為3436°c。由于發(fā)酵 期代謝活躍，發(fā)酵罐要注意冷卻，防止溫度過(guò)高引起發(fā)酵遲緩；(2) 發(fā)酵過(guò)程中的ph控制：發(fā)酵過(guò)程屮的產(chǎn)物積累導(dǎo)致ph下降，而氮源 的流加導(dǎo)致ph的升高，發(fā)酵中，當(dāng)ph下