不同的培養(yǎng)條件對高山紅景天雄株花藥培養(yǎng)的影響

1、摘要本論文以吉林省和龍地區(qū)高山紅景天開花初期的雄株花藥為材料研宄了不 同的培養(yǎng)條件對高山紅景天雄株花藥培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：1、在本實(shí)驗(yàn)的設(shè)置（小花柄長度為3、4、5mm；小花直徑為1、2、3mm）范 圍內(nèi)，當(dāng)小花直徑為1mm時，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高。2、高山紅景天的小花直徑為lmm時，花粉發(fā)育時期大多數(shù)處于單核中期，此 時，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率在設(shè)置（小花直徑為1mm以下、1 mm、2 mm、3mm） 范圍內(nèi)達(dá)到最高，其后逐漸下降。3、在實(shí)驗(yàn)（接種密度為10、20、30、40、50粒/瓶）中，每瓶高山紅景天 花藥接種密度越大越有利于花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。4、在ms、b5、n6三種基本培養(yǎng)基

2、屮，高山紅景天花藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高 的是n6培養(yǎng)基，但是，在ms培養(yǎng)基中時，花藥愈傷組織生長速度較快，且顏色 多為綠色和黃綠色，并且有綠點(diǎn)。5、當(dāng)生長素和細(xì)胞分裂素濃度較低時，適合用naa和iba作為生長素；當(dāng) 生長素濃度低，細(xì)胞分裂素濃度高時，iaa適合作為生長素；當(dāng)生長素和細(xì)胞分 裂素濃度高時，iba適合作為生長素。但是，采用iba和iaa作為生長素時，誘 導(dǎo)出的愈傷組織生長速度較慢，愈傷組織塊較小，顏色多為黃褐色或褐色，用 naa作為生長素時，誘導(dǎo)出的愈傷組織生長速度較快，愈傷組織塊較大，顏色多 為綠色，比較有利于進(jìn)一步分化，因此，在高山紅景天的花藥愈傷組織誘導(dǎo)過程 屮生長素采用naa

3、效果較好。6、在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的溫度（16°c、20°c、25°c、30°c）范圍內(nèi)，溫度在25"c 時較有利于高山紅景天花藥愈傷組織誘導(dǎo)，溫度較高和較低均不利于高山紅景天 花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。7、在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的光照時間（10h、12h、14h、16h）范圍內(nèi)，光照時間為 12h時對高山紅景天花藥愈傷組織的誘導(dǎo)比較有利，光照時間較長和較短均不利 于高山紅景天花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。8、在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的光照強(qiáng)度（olux、looolux、20001ux、30001ux）范圍內(nèi)， 光照強(qiáng)度在0-20001ux時較有利于高山紅景天花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，光照強(qiáng)度在

4、 30001ux時，不利于高山紅景天花藥愈傷組織的誘導(dǎo)。9、在所設(shè)計的兒種培養(yǎng)環(huán)境中，將高山紅景天花藥接種之后先放置在25°c 黑暗條件下培養(yǎng)7天的處理整體誘導(dǎo)情況較好,花藥愈傷組織長勢較快，并且顏 色多為綠色和黃綠色。10、在ms、b5、n6三種基本培養(yǎng)基中，基本培養(yǎng)基為ms時，高山紅景天花 藥愈傷組織分化率最高，b5次之、n6最差。11、在三種生長素(naa、iaa、iba)中，從分化率和長出不定芽的情況看， 生長素采用naa時，高山紅景天花藥愈傷組織分化效果較好，生長素采用1aa 時分化效果居中，生長素為iba時最差。12、在生長素 iaa 的四種濃度(0. 1 mg/l, 0

5、. 5 mg/l，1. 0 mg/l, 2. 0 mg/l) 屮，較高(2. 0 mg/l)和較低(0. 1 mg/l)的濃度均不利于高山紅景天花藥愈傷組織 分化，在細(xì)胞分裂素6-ba的三種濃度(3.0 mg/l, 4. omg/l, 5.0 mg/l)屮，愈傷組織分化率隨濃度升高呈現(xiàn)出上升的趨勢。13、在四種光照時間(10h、12h、14h、16h)屮，光照時間為12h時，比較有利于高山紅景天花藥愈傷組織的分化，光照時間過長和過短都不利于分化，蘇 中，光照時間在10h花藥愈傷組織的分化率最低。14、在四種光照強(qiáng)度(olux、looolux、20001ux、30001ux)中,光照強(qiáng)度 在20

6、001ux時，比較有利于高山紅景天花藥愈傷組織的分化，較高和較低的光照 強(qiáng)度都不利于分化，其屮，光照強(qiáng)度在loooltix時，花藥愈傷組織的分化率明顯 低于光照強(qiáng)度為30001 ux吋的分化率，并且光照強(qiáng)度為looolux時，沒有長出不 定芽。15、在四種溫度(16°c、20°c、25°c、30°c)中，溫度在25°c時最有利于 高山紅景天花藥愈傷組織的分化。關(guān)鍵詞: 高山紅景天；花藥；愈傷組織；光溫條件第一章前言1.1組織培養(yǎng)的基本概述隨著科技的發(fā)展，生物技術(shù)在世界范圍內(nèi)迅速地發(fā)展，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、食品 工業(yè)、能源工業(yè)等各個領(lǐng)域都顯示出極大的生

7、產(chǎn)潛力，與此同時，生物技術(shù)的一 個重要組成部分一組織培養(yǎng)，受到研究人員越來越多的關(guān)注1。將植物的組織、器官等用消毒后的刀片切取下來，接種在相應(yīng)的培養(yǎng)基中， 材料可在培養(yǎng)基中生訟成愈傷組織，或發(fā)展成植物，這種技術(shù)稱為植物組織培養(yǎng)2, 3.4o關(guān)于組織培養(yǎng)技術(shù)，有很多優(yōu)點(diǎn)：生長條件能夠控制。植物組織培養(yǎng)所使 用的外植體材料可以在人為設(shè)置的培養(yǎng)棊和培養(yǎng)條件下生長，不受不良的環(huán)境條 件影響，生長條件比較穩(wěn)定，植物的生長發(fā)育能夠冇條不紊的進(jìn)行。利用人為 因素可以調(diào)控植物組織培養(yǎng)過程中的條件，從而使植物在生長發(fā)育過程中比較迅 速。有利于工業(yè)生產(chǎn)和自動控制，管理方便。植物組織培養(yǎng)是在一定的場所中, 可以人為

8、的提供培養(yǎng)條件，有利于高度集約化和高密度工廠化生產(chǎn)，更有利于自 動控制生產(chǎn)，是農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的未來方向。fi前國|aj外已經(jīng)通過莖尖培養(yǎng)方法 得到了馬鈴薯等數(shù)百種經(jīng)濟(jì)作物的脫病毒苗5。植物快速繁殖也需要植物組織培 養(yǎng)技術(shù)，其中法國學(xué)者morel6釆用了快速繁殖方法，生產(chǎn)出大批量的蘭花，自 此，植物快速繁殖這種技術(shù)被應(yīng)用于許多方面。植物組織培養(yǎng)技術(shù)也可以用于生 產(chǎn)藥物和次級代謝產(chǎn)物，如生物堿，蛋白質(zhì)，糖類，藥物等，近年來，在這一領(lǐng) 域的發(fā)展非常迅速，已開發(fā)超過400種植物。與此同時，藥用植物的細(xì)胞培養(yǎng)， 已經(jīng)克服了藥用植物生長緩慢、冇效成分積累冇限等缺陷，具冇廣闊的發(fā)展前景 7。植物組織培養(yǎng)技術(shù)

9、提高了植物各個方面研究發(fā)展速度，包括遺傳' 生理， 生化等，基于植物組織培養(yǎng)的研宄，生產(chǎn)許多遺傳轉(zhuǎn)化，突變體的篩選，基因轉(zhuǎn) 染，dna的直接指導(dǎo)技術(shù)，己成為基因工程的發(fā)展的主導(dǎo)技術(shù)。據(jù)預(yù)測，未來10 年，我國市場對組培苗的需求量將會越來越大，每年以7%-8%w的速度遞増， 使其發(fā)展前景可觀。1.2花藥培養(yǎng)的概述將發(fā)育到一定階段的花藥粒，在無菌操作條件下，把花藥粒接種在培養(yǎng)基中， 進(jìn)行培養(yǎng)，叫做花藥培養(yǎng)"ei，這種培養(yǎng)方法是植物組織培養(yǎng)技術(shù)中的一部分。印度的專家guha和maheshuari11 12對毛葉蔓陀羅(datura inoxia)的花藥進(jìn) 行數(shù)十年的研究，最終開發(fā)出

10、體細(xì)胞胚胎和植株再生體，從此，國內(nèi)外許多專家 學(xué)者開始研究相關(guān)植物花藥培養(yǎng)技術(shù)。經(jīng)過許學(xué)多年的研究發(fā)現(xiàn)，花藥培養(yǎng)吋， 受到多種因素同時控制，如：一、供體植株的基因型。mityko113選擇了不同基因型的辣椒，將其花藥取下 來，接種在培養(yǎng)基中，在觀察過程中發(fā)現(xiàn)：愈傷組織長勢之間存在不同表現(xiàn)。據(jù) 報道，屬于茄類1材料，植物花粉數(shù)量很小。張艷敏u5等采用二百一十六種不同 基因型小麥的子一代作為外植體，接種在人工配制的培養(yǎng)基中，進(jìn)行花藥培養(yǎng), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：植物材料的選擇在花藥培養(yǎng)中只有重要意義，不同基因型的材料，愈 傷組織是很不同的。二、花粉的發(fā)育時期。據(jù)資料顯示，不同種類的植物，花粉的敏感時期有差 異

11、，例如，玉米641的花粉，當(dāng)其內(nèi)部花粉發(fā)育到單核靠邊期時，愈傷組織誘導(dǎo)率 最高，這一吋期比較適合進(jìn)行花藥培養(yǎng)。主要農(nóng)作物-小麥65當(dāng)其內(nèi)部花粉發(fā)育 到單核中期時，愈傷組織誘導(dǎo)效果最佳。王玉英"6等研究人員，采用辣椒作為外 植體，將其接種在培養(yǎng)基中，進(jìn)行花藥培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)辣椒的花粉發(fā)育 到單核早期開始至雙核期結(jié)束，這段期間都比較適宜培養(yǎng)。歐陽17等經(jīng)過多年的 研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)作物的發(fā)育處于單核屮后期時最有利于植物的花藥培養(yǎng)，原因 主要包括以下的兩個方面：一、小孢子發(fā)育最為關(guān)鍵的階段是第三階段。二、在 整個過程中，內(nèi)源激素含量的變化出現(xiàn)了差異，當(dāng)其變得不合適時，花粉細(xì)胞這 時已經(jīng)

12、成熟。三、光溫條件。離體花藥在培養(yǎng)過程中受光照條件和溫度條件的影響，通常 情況不，黑暗培養(yǎng)或者散射光比較有利于誘導(dǎo)愈傷組織和胚胎的形成，雖然在綠 茁分化過程中強(qiáng)光更有利，但是，主要農(nóng)作物小麥的1s愈傷組織在誘導(dǎo)的過程中 會受到影響。因此，無論是形成愈傷組織，還是向綠苗分化的過程，都需要比較 弱的光照。經(jīng)過潛心研宄，發(fā)現(xiàn)在植物的花藥培養(yǎng)中，溫度同樣具有重耍意義。 外國專家1)111肪519研'允花粉胚的過程中發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行花藥培養(yǎng)時，在35"c條件下 誘導(dǎo)->25°c條件培養(yǎng)，這樣不但可以提高出愈率，還可以使其長勢比較好。郭奕 明20和其他研究人員經(jīng)過長時間漫長的

13、研究發(fā)現(xiàn)，采用低溫預(yù)處理的方法對于誘 導(dǎo)效果很重要。四、花藥接種密度。外國sunderland多年從事植物的組織培養(yǎng)工作，不 斷探索在植物組織培養(yǎng)過程中各種因素對愈傷組織產(chǎn)生的百分率的影響，在他的 一項(xiàng)研宂中，說明了關(guān)于花藥接種密度這一因素對植物花藥組織培養(yǎng)時的產(chǎn)生愈 傷組織的影響，他研究發(fā)現(xiàn)，花藥的多少影響著愈傷組織產(chǎn)生的多少，如果實(shí)驗(yàn) 中花藥數(shù)量放入的越多，那么產(chǎn)生的愈傷組織也就會在一定程度上增加，冋樣的， 李春玲122和其他專家學(xué)者對甜椒花藥粒的研究也同樣證明了 sunderland的推斷， 李春玲22通過調(diào)整每接種小瓶甜椒花藥粒單位面積上的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)密度越是大， 就會讓甜椒的胚產(chǎn)生更多

14、的愈傷組織數(shù)，看來，接種小瓶里單位而積上的花藥數(shù) 量，也是接種密度，似乎和愈傷組織生產(chǎn)之間存在正相關(guān)關(guān)系。五、培養(yǎng)基的成分。研究人員陸續(xù)地研究花藥培養(yǎng)，奮非常重要的發(fā)現(xiàn)，除 了一些原始的ms培養(yǎng)基，nitsch培養(yǎng)基，乂發(fā)現(xiàn)了幾個新的培養(yǎng)基種類123，對在 植物的內(nèi)部花粉發(fā)育成愈傷組織的過程中，培養(yǎng)基成分意義重大。采用胡麻241 花藥作為外植體，接種在培養(yǎng)基中，進(jìn)行研宂，發(fā)現(xiàn)在胡麻花藥愈傷組織形成的 過程屮，使用生長素，細(xì)胞分裂素時.用二氯苯氧乙酸和kt,相比之下，有利于 亞麻花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，因此可以得出結(jié)論：對于花藥培養(yǎng)，植物激素是至關(guān) 重要的。1.3高山紅景天的概述及其在組織培養(yǎng)方面的

15、研究進(jìn)展高山紅景天29 rhodiola sachntinensis）屬于景天科crassulacea）、也 景夭烕（rhodiola）的多年生草本植物129,主要以根和莖入藥3°_31。高山紅景天分 為雌性植株、雄性植株、兩性植株，所有這些都是聚傘花序花序32，花在頂部的 植物生長。在長g山地區(qū)，紅景天主要種植在十七以上百米海拔山樺樹森林和高 山凍原，是一種典型的高山植物134，其生長的地方土壤大多是山地苔原土和生草 森林土，土層較淺、砂石較多，土壤ph5-6,其生境十分特殊。高山紅景天的研宄首次開始在六十年的前蘇聯(lián)、kurkin 351和其他專家發(fā)現(xiàn)， 紅景天滋養(yǎng)作用比人參好。高

16、山紅景天有很多方面的作用，不但能抗微波輻射:36, 能夠益智強(qiáng)身、抗疲勞、提高工作效率，而且能夠提高肌體對各種刺激的穩(wěn)定性， 適應(yīng)高原氣候38。高山紅景天含有8種氨基酸39。高山紅景天的有效成份主要 包括紅景天甙和貳元酪醇'1q,其具有獨(dú)特的藥理作用，所以人們 不斷大量的開發(fā)和利用高山紅景天。截止目前，市場上用高山紅景天開發(fā)出來的 用品有很多，如保健品、飲料和藥品等等。然而，由于自然資源的分布窄，較少 的存儲，不高的成熟率，自然萌發(fā)率低等因素所以作為野生資源的高山紅 景天滿足不了市場上對高山紅景天發(fā)展需要，而人工種植的高山紅景天由于在生 長吋間段不同，在收獲、加工等方面均存在較大的差異

17、，在一定程度上，使人們 的開發(fā)利用受到了限制。為了今后的研究和發(fā)展，國內(nèi)外一些專家致力于高山紅 景天的研宄工作，總結(jié)出了很多有價值的經(jīng)驗(yàn)。在組織培養(yǎng)方而，關(guān)于紅景天的研宂已經(jīng)取得了很多成果，ishmuratova一 論14346通過對紅景天組織培養(yǎng)的研宄，證實(shí)每年的六月、七月、九月采取種子 或者混合芽作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)效果最好。furmanowa-m453通過對組織提 取物藥理特性的研宄，發(fā)現(xiàn)其制劑可能具有更高的生物活性和更低的毒性。高山紅景天這種植物被廣泛的研宄，距今它己經(jīng)有30年歷史，我國羅明47_51 和姜明蘭對它進(jìn)行組織培養(yǎng)已經(jīng)很長時間，劉世強(qiáng)52也利用它的外植體，去尋找 不同的外

18、植體在形成愈傷組織的時候的能力大小。相同的條件下，例如相同系列 的外植體，同吋對它們施以不同量的各種植物激素，在其形成和分化的過程里， 采用若干的配比方式，則結(jié)果證明，誘導(dǎo)和分化的結(jié)果有很大差異。張弓1531利用 它的莖和葉這些器官，放入不同培養(yǎng)基，來對它進(jìn)行脫分化，再進(jìn)行再分化，實(shí) 驗(yàn)者選擇的植物部位很關(guān)鍵，部位選擇正確，會大大促進(jìn)實(shí)驗(yàn)的效率，減少不必 要的重復(fù)工作。因此這些因素和影響條件需要我們尤為關(guān)注和重視。國內(nèi)的許明 子54等學(xué)者采用吉林省長白山地區(qū)的高山紅景天的莖、種子和試管苗接種培養(yǎng)基 中，發(fā)現(xiàn)，在高山紅景天愈傷組織生長時，幼苗葉片需要不同的激素濃度、溫度 和光照：劉劍鋒1551等

19、學(xué)者研究采用的材料是高山紅景天的葉片，培養(yǎng)條件對其愈 傷組織誘導(dǎo)有較大的影響，對芽的生根有有較大的影響；著名的學(xué)薺閻秀峰56 等研宂包埋-玻璃化法超低溫保存對材料的影響，選取了兩種不同來源的高山紅 景天，研究發(fā)現(xiàn)，不同預(yù)處理后的效果不同，對高山紅景天莖尖超低溫保存，在 嵌入過程中，不同的溫度和不同的預(yù)處理，成活率不相同。在研究發(fā)展史上，著 名學(xué)者代蘇偉56，利用高山紅景天的根和莖為外植體，進(jìn)行了組織培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié) 果表明，用ms、white和修改的fox培養(yǎng)基，在其屮補(bǔ)充百分之十的椰子汁，好處 很多，王琳57等人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ms基本培養(yǎng)基中硝酸銨和硝酸鉀總的含量不變吋， 增加或者減少硝酸銨的含量

20、一般不影響愈傷組織的增長量；減少硝酸鐘的含量， 能夠降低愈傷組織的增長量，而增加硝酸鉀的含量，能夠提高愈傷組織的增長量。 許明子58、安桂花和其他學(xué)者選擇高山紅景天莖段為外植體，研宂了植物激素對 愈傷組織的誘導(dǎo)水平的影響，結(jié)果表明，不同的植物激素誘導(dǎo)效果不同，許明子， 燕雁59在組織培養(yǎng)方面，對不同性別的高山紅景天進(jìn)行了研究，采用不冋性別的 高山紅景天葉片作為外植體材料，研究出最適宜的環(huán)境條件，同時研宄出最適宜 的外植體條件,。崔苗采摘吉林省長白山地區(qū)的高山紅景天植株開花初期的的 雄性花藥為材料。試驗(yàn)結(jié)果表明：攝氏四度的條件下，低溫預(yù)處理24小時，顯著 提高花藥愈傷組織誘導(dǎo)；當(dāng)naa濃度為1.

21、0mg/l, 6-ba的濃度為2. omg/l時，在高 山紅景天花藥愈傷組織生長過程中，采用變溫（16-25d比較適宜；當(dāng)溫度選 擇不變時，在高山紅景天花藥出愈后，溫度選擇25°c,光照時間選取16h,光照 強(qiáng)度選取1000-20001ux,在這些條件下，高山紅景天愈傷組織生長更有利。1.4本實(shí)驗(yàn)研究的目的和意義從前蘇聯(lián)人開始研宄高山紅景天至今，己經(jīng)有很多專家學(xué)者對高山紅景天組 織培養(yǎng)這方面進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究，取得了大大小小的成就，為后人的研究工作提供 了基礎(chǔ)理論。但其還有很多祌秘的面紗未被揭曉，還沒能建立一個完整的組織培 養(yǎng)體系，特別是在花藥組織培養(yǎng)方面還有很多地方處于空白時期。在三十

22、年之前，就陸續(xù)有很多的科技工作者對高山紅景天進(jìn)行過調(diào)查和實(shí) 驗(yàn)，也有一些科學(xué)家對其進(jìn)行了組織培養(yǎng)的相關(guān)研究。本論文在此基礎(chǔ)上，利用 花藥為外植體，探索花粉細(xì)胞發(fā)育時期對愈傷組織產(chǎn)生的關(guān)系，探索每瓶接種量 和愈傷組織產(chǎn)生的關(guān)系，探索激素種類對花藥培養(yǎng)影響的重要性，同時，探索光 照和溫度對愈傷組織形成和分化的影響程度，致力于找到最佳的形成條件，為后 續(xù)工作帶來便利。第二章高山紅景天花粉發(fā)育時期對花藥愈傷組織誘導(dǎo)影響研究2.1材料本實(shí)驗(yàn)采用高山紅景天開花初期的雄株花蕾中的花藥作為材料，分別于 2012年5月20 h和2013年5月21 h在吉林省和龍市釆摘。2.2方法2.2.1材料處理將2012年取

23、回的高山紅景天雄株花蕾用直尺量出小花柄長度和小花直徑大 小，進(jìn)行分類，用鋁鈾紙包好放在4°c條件下低溫預(yù)處理24小時一流水沖洗 一75%的酒精中浸泡花蕾30s用0.1%的升汞溶液中消毒5（->無菌蒸餾水中連 續(xù)沖洗4次一將花蕾置于經(jīng)高溫滅菌后的培養(yǎng)皿屮。用消毒后的刀片將花蕾上的 小花切下來分散在培養(yǎng)皿中，準(zhǔn)備接種。將2013年取回的高山紅景天的雄株花蕾用直尺量出小花直徑，進(jìn)行分類，一 部分分裝于卡諾氐固定液（無水乙醇：冰醋酸=34）固定24小時一90%酒精中沖 洗1次->85%酒精中沖洗1次->70%酒精中沖洗1次->4°c低溫保存。壓片過程中， 染

24、色劑使用醋酸洋紅，在顯微鏡下觀察并且拍照；另一部分作為接種材料。2.2.2培養(yǎng)條件（1）培養(yǎng)基為ms+0. 5mg/l naa+2. 0 mg/l 6-ba，p11 值為5. 8,蔗糖濃度為30g/l， 瓊脂濃度為7g/l。（2）溫度采用25°c，首先將培養(yǎng)棊放在黑暗屮培養(yǎng)一周，然后給予光照強(qiáng)度 15002000lux，光照時間12小時，繼續(xù)培養(yǎng)。2.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計2.3.1雄花中小花柄長度和小花直徑大小的實(shí)驗(yàn)設(shè)計本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2012年材料屮小花柄的長度和小花的直徑大小，在小花柄長度 為3mm時，將小花分為1mm, 2mm兩個水平；在小花柄長度為4mm時，將小花分 為2mm，3inm兩個水

25、平；在小花柄長度為5mm時，將小花分為1mm, 2mm兩個水平。2.3.2小花的大小與花粉發(fā)育時期關(guān)系的實(shí)驗(yàn)設(shè)計本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2013年材料中小花直徑大小，將小花分為1酮以下、lmni、2mm、 3mm, 4個水平，在保存液中每種材料大約取200個小花，每個小花取1個花藥， 在顯微鏡下，每個片子從不同的角度觀看三次，從而確定該花粉細(xì)胞的發(fā)育時期。2.3.3花粉發(fā)育時期與花藥愈傷組織誘導(dǎo)關(guān)系的實(shí)驗(yàn)設(shè)計本實(shí)驗(yàn)根據(jù)2013年材料中小花直徑大小，分別取四個不同發(fā)育時期的小花， 用消毒后的鑷子把小花剝開取出花藥接種在培養(yǎng)基上。2.4結(jié)果與分析2.4.1小花柄長度和小花直徑大小對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響將取回來

26、的高山紅景天花蕾按照小花柄長度和小花直徑大小進(jìn)行分類，采用 同一培養(yǎng)基接種，結(jié)果表明：高山紅景天雄株花蕾中的小花柄長度和小花直徑大 小影響花藥愈傷組織的出愈（表1-1）。小花柄長度和花藥愈傷組織誘導(dǎo)率并沒有顯示明顯的關(guān)系，花的大小和愈傷 組織的誘導(dǎo)率之間存在著密切的關(guān)系，從表中可以看出，當(dāng)花直徑為1mm時，花 藥您傷組織的誘導(dǎo)率最高，小花的大小為2mm時，誘導(dǎo)率居中，花的大小為3mm 時，誘導(dǎo)率最差；經(jīng)過方差分析，f>f0.01,表明小花柄長度為5mm小花直徑為 1吋，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率與.其他小花的花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率之間存在極 顯著性差異。表1-1不同長度小花柄和小花直徑的出愈情況

27、 注：iii、iv、v表示花柄長度，1、2、3表示小花直徑大小2.4.2不同大小的小花與花粉發(fā)育時期關(guān)系2.4.2. 1高山紅景天花粉細(xì)胞在不同的發(fā)育階段表現(xiàn)特征（1）四分體時期：胼胝質(zhì)將四個小孢子被著，乂將每個小孢子細(xì)胞分開。（圖1）（2）單核早期：小孢子細(xì)胞從四分體中分離出來，細(xì)胞較小，細(xì)胞中核仁位于 屮間位置。（圖2）（3）單核中期：細(xì)胞體積的大小與正常細(xì)胞大小一樣，細(xì)胞核居于細(xì)胞中間位 置，其中少部分細(xì)胞的核仁開始向細(xì)胞的邊緣移動。（圖3）（4）單核晚期：細(xì)胞核位于細(xì)胞邊緣。（圖4）（5）雙核期：營養(yǎng)細(xì)胞和生殖細(xì)胞構(gòu)成二細(xì)胞花粉粒，細(xì)胞有萌發(fā)孔，花粉粒 已趨于成熟。（圖5）2.4.2.

28、2小花大小與花粉發(fā)育時期的關(guān)系為了y解高山紅景天雄株花蕾屮的小花直徑大小與小花內(nèi)部花粉發(fā)育時期的關(guān)系，將取回來的高山紅景天花蕾按照小花直徑大小進(jìn)行分類，利用顯微鏡觀 察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)小花直徑低于1mm時，花粉細(xì)胞的發(fā)育處于單核早期的比較 多，而在四分體時期和單核屮期的比較少，單核早期數(shù)r占制片總數(shù)的86.5%; 當(dāng)小花直徑為lmm時，大多數(shù)花粉細(xì)胞的發(fā)育時期處于單核屮期，只有少部分 為單核晚期，單核中期數(shù)r占制片總數(shù)的90.5%;當(dāng)小花直徑為2mm時，大多 數(shù)花粉細(xì)胞的發(fā)育時期處于單核晚期，只有少部分為單核屮期和雙核期，單核晚 期數(shù)a占制片總數(shù)的91%;當(dāng)小花直徑為3mm時，雙核期數(shù)目占制片總

29、數(shù)的88% （表 2）。表1-2不同大小的小花的發(fā)育情況2.4.3不同發(fā)育階段的花粉與花藥愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)系為了了解高山紅景天雄株花蕾中不同發(fā)育階段的小花對花藥愈傷組織誘導(dǎo) 的影響，將四個不同發(fā)育階段的花藥粒接種在同一種培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：四個 不同發(fā)育時期的高山紅景天雄株花藥均能誘導(dǎo)出愈傷組織，但是誘導(dǎo)率之間存在著差異。從單核早期開始誘導(dǎo)率逐漸升高，當(dāng)花粉細(xì)胞發(fā)育到單核中期時，愈傷組織誘導(dǎo)率為22. 7%，達(dá)到最高，其后逐漸降低。經(jīng)過方差分析，f=5. 678f0.01,表明花粉細(xì)胞發(fā)育處于單核屮期時，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率與花粉細(xì)胞發(fā)育處于雙核期吋的花藥愈傷組織誘導(dǎo)率之間存在著極顯著性差異（表

30、1-3）。表1-3花粉的不同發(fā)育時期出愈率情況2.5結(jié)論1、高山紅景天不同大小的小花對花藥愈傷組織的誘導(dǎo)有影響，其屮當(dāng)小花直 徑為lmm時，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高。2、在高山紅景天雄株小花的直徑為lmm時，花粉細(xì)胞發(fā)育大多數(shù)處于單核中 期，此時，花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率在本實(shí)驗(yàn)設(shè)罝范圍內(nèi)達(dá)到最高，其后逐漸降低。第三章培養(yǎng)基成分和不同接種密度對愈傷組織誘導(dǎo)的影響研究3.1材料本研宂采用吉林省和龍市高山紅景天開花初期的雄株花蕾屮的花藥為材料 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。3.2方法將取in的高山紅景天的雄株花蕾用鋁鉑紙包好在4°c條件下低溫預(yù)處理24 小時一流水沖洗30min75%的酒精中浸泡花蕾30s用0.

31、1%的升汞溶液中消毒 5111-無菌蒸餾水屮連續(xù)沖洗4次-將花蕾置于經(jīng)高溫滅菌后的培養(yǎng)皿屮。用消 毒后的刀片將花蕾上的小花切下來分散在培養(yǎng)皿中，準(zhǔn)備接種。3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計3.3.1不同種類的基本培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)設(shè)計本實(shí)驗(yàn)設(shè)計丫3種棊本培養(yǎng)棊（ms、b5、n6）,生長素采用naa，細(xì)胞分裂素 采用6-ba，其屮naa的濃度設(shè)置為0. lmg/l和0. 5mg/l兩個水平，6-ba的濃度設(shè)置 為l.omg/l，取同樣大小的小花，用消毒后的鑷子把小花剝開取出花藥粒接種在 培養(yǎng)基上。3.3.2不同種類生長素的實(shí)驗(yàn)設(shè)計本實(shí)驗(yàn)設(shè)計了3種生長素，分別為naa、iba、iaa?；九囵B(yǎng)基釆用ms，附加 了生長素和細(xì)

32、胞分裂素6-ba,其中生長素的濃度設(shè)罝為0. 5mg/l和1. omg/l兩個水 平，6-8人的濃度設(shè)置為1.0 1幾和2.01幾兩個水平,取同樣大小的小花，用消 毒后的鑷子把小花剝開取出花藥接種在培養(yǎng)基上。3.3.3不同接種密度的實(shí)驗(yàn)設(shè)計本實(shí)驗(yàn)設(shè)計了5個梯度的接種密度，分別為每瓶10、20、30、40、50?；ㄋ帯?基本培養(yǎng)基采用ms，附加了生長素naa和細(xì)胞分裂素6-ba,其中naa的濃度設(shè)置為 0. 5mg/l，6-ba的濃度設(shè)置為1. 0 mg/l和2. omg/l兩個水平，取同樣大小的小花， 用消毒后的鑷子把小花剝開取出花藥接種在培養(yǎng)基上。3.3.4其他培養(yǎng)條件和誘導(dǎo)率的計算培養(yǎng)條件

33、：每升溶液中加入蔗糖30g，瓊脂7g，將溶液的酸堿度調(diào)成5. 8。 環(huán)境條件：溫度采用25"c,首先把培養(yǎng)基放在黑暗中培養(yǎng)一周，然后給予光照強(qiáng)度15002000lux，光照時間12小時，繼續(xù)培養(yǎng)。3.4結(jié)果與分析3.4.1不同種類基本培養(yǎng)基對花藥愈傷組織誘導(dǎo)的影響設(shè)置三種基木培養(yǎng)基（ms、b5、n6）,分別附加在生長素naa兩種不同濃度 條件下進(jìn)行了誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn):采用不同的基木培養(yǎng)基，高山紅景天說我花 藥愈傷組織誘導(dǎo)率不同（表2-1）。表2-1基本培養(yǎng)基成分不同的出愈情況在生長素naa的濃度為0. 1 mg/l的條件下，基本培養(yǎng)基為n6的培養(yǎng)基中花 藥愈傷組織誘導(dǎo)率最高，其次為

34、b5, ms最差；在生長素naa的濃度為0.5 mg/l 的條件下，基本培養(yǎng)基為n6的培養(yǎng)基中花藥愈傷組織誘導(dǎo)率仍然最高，其次為 b5, ms最差。在生長素naa的兩種不同濃度下，均表現(xiàn)出基本培養(yǎng)基為n6培養(yǎng) 基中花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率最高：經(jīng)過方差分析，f&6.8df。.。，表明處理間存在 顯著性差異。同時，在愈傷組織生長過程中發(fā)現(xiàn)，ms培養(yǎng)基中的愈傷組織多為綠色而且 愈傷組織塊比較大（圖2-1）。圖2-1高山紅景天花藥愈傷組織在不同基本培養(yǎng)基中的l<:勢 注：基本培養(yǎng)基：n6, ms, b5 （左右）3.4.2不同種類生長素與花藥愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)系為了更好的了解不同種類生長素（

35、iaa、naa、iba）對高山紅景天花藥愈傷 組織誘導(dǎo)的影響，在ms培養(yǎng)基中附加了細(xì)胞分裂素，而且生長素（0.5和1.0 mg/l）和細(xì)胞分裂素（1.0和2.0mg/l）均設(shè)置了兩種不同濃度，進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同種類的生長素對高山紅景天花藥愈傷組織的誘導(dǎo)有差異（表 2-2l表2-2不同生長素出愈情況當(dāng)生長素濃度采用0. 5mg/l，細(xì)胞分裂素6-ba濃度采用1.0mg/l時，生長 素iba和naa的培養(yǎng)基中花藥愈傷組織誘導(dǎo)率高于生長素iaa的培養(yǎng)基中花藥 愈傷組織的誘導(dǎo)率，說明生長素naa和tba較適合花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，經(jīng)過方 差分析，f&0. 51，ffo. 05,表明處

36、理間不存在顯著性差異。在生長素濃度為0. 5mg/l,細(xì)胞分裂素6-ba濃度為2. 0 mg/l條件下，生長 素為1aa的培養(yǎng)基中花藥愈傷組織誘異率較高，生長素為naa培養(yǎng)基中花藥愈傷 組織誘異率次之，花藥愈傷組織誘異率最差的培養(yǎng)基中生長素是1ba。說明在設(shè) 置范圍內(nèi)生長素1aa較適合花藥愈傷組織的誘異，naa次之，1ba最差，經(jīng)過方差分析，fo. 50, f<fq.q5.表明處理間不存在顯著性差異。在生長素濃度采用1. omg/l,細(xì)胞分裂素6-ba濃度為2. 0 mg/l條件下，附加丫生長素iba的培養(yǎng)基屮花藥愈傷組織誘導(dǎo)率較高，生長素為iaa的培養(yǎng)基屮 花藥愈傷組織誘導(dǎo)率次之，花藥愈傷組織誘導(dǎo)率較差的培養(yǎng)基中生長素采用的是 naao說明在設(shè)置范圍內(nèi)生長素iba較適合花藥愈傷組織的誘導(dǎo)，iaa次之，naa 最差，經(jīng)過方差分析，f&6. 95, f>fq.q5.但