細胞培養(yǎng)基種類與基本成分

1、-作者xxxx-日期xxxx細胞培養(yǎng)基種類與基本成分【精品文檔】細胞培養(yǎng)基種類與基本成分抗體圈培養(yǎng)基種類經典的培養(yǎng)基有很多種，其中 DMEM、 RPMI 1640、 MEM 、 DMEM/F12 都是應用最廣泛的培養(yǎng)基。其他 如 M199 、 IMDM 、 L15培養(yǎng)基等也用于某些細胞的培養(yǎng)。其具體的特征及應用如下：1、BME細胞培養(yǎng)基基礎Eagle培養(yǎng)基（Basal Medium Eagle），1955年Eagle設計，BSS12種氨基酸谷氨酰胺8種維生素。簡單、便于添加，適于各種傳代細胞系和特殊研究用，在此基礎上改良的細胞培養(yǎng)基品種有MEM、DMEM、IMDM

2、等。2、MEM細胞培養(yǎng)基又稱低限量Eagle培養(yǎng)基（Minimal Essential Medium），1959年在Eagle's基礎培養(yǎng)基（BME）上修改而來，刪去賴氨酸、生物素，氨基酸濃度增加，適合多種細胞單層生長，有可高壓滅菌品種，是一種最基本、試用范圍最廣的培養(yǎng)基，但因其營養(yǎng)成分所限，針對生產之特定細胞培養(yǎng)與表達時，并不一定是使用效果最佳或者最經濟的培養(yǎng)基。3、DMEM細胞培養(yǎng)基DMEM是由Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，起初是為小鼠成纖維細胞設計的。DMEM的氨基酸濃度是MEM的兩倍，維生素濃度是MEM的4倍，采用雙倍的HCO3-和CO2濃度起到更

3、好的緩沖作用。最初的配方中葡萄糖含量為1000 mg/L，后來為了某些細胞的生長需要，將葡萄糖含量又調整為4500 mg/L，這就是大家常說的低糖和高糖了。低糖適于依賴性貼壁細胞培養(yǎng)，特別適用于生長速度快、附著性較差的腫瘤細胞培養(yǎng)。高糖更適合高密度懸浮細胞培養(yǎng)，也適用于附著性較差，但又不希望它脫離原來生長點的克隆培養(yǎng)，也可用于雜交瘤中骨髓瘤細胞和DNA轉染的轉化細胞的培養(yǎng)。例如CHO細胞表達生產乙肝疫苗、CHO細胞表達EPO。4、IMDM細胞培養(yǎng)基Guilber 和Iscove將Dulbecco' Medium 改良為 Isc

4、ove's Medium，用于培養(yǎng)紅細胞和巨噬細胞前體。此種培養(yǎng)液含有硒、額外的氨基酸和維生素、丙酮酸鈉和HEPES。并用硝酸鉀取代了硝酸鐵。IMDM還能夠促進小鼠B淋巴細胞，LPS刺激的B細胞，骨髓造血細胞，T細胞和淋巴瘤細胞的生長。IMDM為營養(yǎng)非常豐富的培養(yǎng)液，因此可以用于高密度細胞的快速增殖培養(yǎng)。5、RPMI-1640細胞培養(yǎng)基Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，針對淋巴細胞培養(yǎng)設計，含BSS21種氨基酸維生素11種等?，F也用于懸浮細胞培養(yǎng)，如哺乳動物、特殊造血細胞、正常或惡性增

5、生的白細胞，雜交瘤細胞的培養(yǎng)，其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴細胞、T細胞淋巴瘤細胞以及HCT-15上皮細胞等均可參考使用。6、HamF10細胞培養(yǎng)基1963年Ham設計，含微量元素，可在血清含量低時用，適用于克隆化培養(yǎng)。F10適用于倉鼠、人二倍體細胞，特適于羊水細胞培養(yǎng)。7、DMEM/F12細胞培養(yǎng)基Ham's F12是為在低血清濃度下克隆CHO細胞而設計的，現在也廣泛應用于克隆形成率的分析及原代培養(yǎng)。F12還可以與DMEM等體積混合使用，得到一種高濃度與成分多樣化相結合的產物，這種培養(yǎng)基已應用于許多原代培養(yǎng)及更難養(yǎng)的細胞系的培養(yǎng)。由

6、于營養(yǎng)成分豐富，且可以使用較少血清，故也常作為無血清培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基。8、M199細胞培養(yǎng)基1950年Morgan等設計的具有確定化學成分的細胞培養(yǎng)液，即M-199。除BSS外，含有53種成分，為全面培養(yǎng)基，主要用于雞胚成纖維細胞培養(yǎng)。此培養(yǎng)液必須輔以血清才能支持長期培養(yǎng)。M-199可用于培養(yǎng)多種種屬來源的細胞，并能培養(yǎng)轉染的細胞?，F廣泛用于病毒學、疫苗生產。9、McCoy5A培養(yǎng)基1959年MeCoy為肉瘤細胞設計，BSS40種成分?？芍С侄喾N（如骨髓、皮膚、肺和脾臟等）的原代移植物的生長，除適于一般的原代細胞培養(yǎng)外，主要用于作組織活檢培養(yǎng)、一些淋巴細胞培養(yǎng)以及一些難培養(yǎng)細胞的生長支持。例

7、如Jensen大鼠肉瘤成纖維細胞、人淋巴細胞、HT-29、BHL-100等上皮細胞。10、L15 細胞培養(yǎng)基L-15培養(yǎng)液適用于快速增殖瘤細胞的培養(yǎng)，用于在CO2缺乏的情況下培養(yǎng)腫瘤細胞株。此培養(yǎng)液采用磷酸鹽緩沖體系，氨基酸組成進一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。培養(yǎng)基成分細胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基），按其物質狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基需由實驗者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直接使用，非常方便。1、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無機鹽、維生素及其它輔助物質：氨基酸氨基酸是組成

8、蛋白質的基本單位。不同種類的細胞對氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時，細胞生長不良而死亡。因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應置于-20冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4冰箱中儲存2 周以上時，還應重新加入原來量的谷氨酰胺。碳水化合物碳水化合物是細胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。無機鹽培養(yǎng)液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡。

9、此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細胞調節(jié)細胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個非常重要的因素, 細胞通?？赡褪?60mOsm/kg 320 mOsm/kg。標準培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內波動。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質有可能會明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強酸或強堿中的物質。向培養(yǎng)液中添加HEPES 時需按以下方法調節(jié)鈉離子濃度。緩沖系統(tǒng)大多數細胞所需pH 在 7.2 - 7.4。但是，細胞培養(yǎng)最適pH 值隨培養(yǎng)的細胞種類不同而不同。成纖維細胞喜歡較高pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉化細胞系則需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。由于多數培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與CO2 體

10、系進行緩沖，因此，氣相中的CO2 濃度應與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2 濃度設定在5，培養(yǎng)液中NaHCO3 的加入量為1.97g/L；如果CO2 濃度維持在10，培養(yǎng)液中NaHCO3 的加入量為3.95g/L。細胞培養(yǎng)瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換。HEPES 是一種非離子緩沖液，在pH 7.2 - 7.4 范圍內具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細胞培養(yǎng)瓶的蓋子應擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。

11、大多數培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH 指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。維生素在細胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細胞系生長。其它成分在一些較為復雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術中常用的DMEM 培養(yǎng)液，使用時還需要補加丙酮酸鈉和2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 對細胞生長有很重要的作用。有人認為它相當于胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基，其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導細胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時避免過氧化物對培養(yǎng)細胞的

12、損害。另一個重要作用是促進分裂原的反應和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)對淋巴細胞的轉化作用，已廣泛應用于雜交瘤技術，另外，也開始用于一些難以培養(yǎng)的細胞。2-Me 是一種小分子還原劑，極易氧化。分子量為78.13，純的2-Me 是一種無色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為5×10-5M。常配制成0.1M 的儲存液，用時每升培養(yǎng)液加0.5ml。液體培養(yǎng)基保存：液體培養(yǎng)基應于4冰箱避光保存，實驗前放入37預熱。未加血清液體培養(yǎng)基有效期為12 個月。液體培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解。如果細胞生長不良，可以再添加適量L-谷氨酰

13、胺。干粉培養(yǎng)基保存：4冰箱避光保存，有效期36 個月。血清細胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點，新生小牛血清的質量與胎牛血清的質量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質，其質量明顯不如前兩種。血清的質量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞生長的物質。因此

14、，在購買大量血清之前，必須對血清支持細胞生長能力進行檢測，然后再大量購買質量好的同一批號的血清，并注意以下幾點：（1）需要長期保存的血清必須儲存于-20 70 低溫冰箱中。4冰箱中保存時間切勿超過1 個月。由于血清結冰時體積會增加約10，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶凍裂。（2）一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌。如發(fā)現血清有懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)液內一起過濾，切勿直接過濾血清。（3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 至 -70 低溫冰箱中的血清放入4冰箱中溶解1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心

15、勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20進入37解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝集而出現沉淀。（4）熱滅活是指56, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作此熱處理，因為熱處理會造成血清沉淀物顯著增多，而且還會影響血清的質量。補體參與反應有：細胞毒作用, 平滑肌細胞收縮, 肥大細胞和血小板釋放組胺, 增強吞噬作用, 促進淋巴細胞和巨噬細胞發(fā)生化學趨化和活化。（5）切勿將血清在37放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破會而影響血清質量。（6）血清中的沉淀物絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質量。可用離心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。顯微鏡下“小黑點”：經過熱處理過的血清，沉淀物的形成會顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點”，常誤認為血清受污染。一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如