基因表達(dá)與蛋白質(zhì)純課件

1、讀書報告讀書報告2010年年9月月30日日什么是基因表達(dá)呢？ 基因表達(dá)(gene expression)是指儲存遺傳信息的基因經(jīng)過一系列步驟表現(xiàn)出其生物功能的整個過程。典型的基因表達(dá)是基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯，產(chǎn)生有生物活性的蛋白質(zhì)的過程。 E . coli 是重要的原核表達(dá)體系。在重組基因轉(zhuǎn)化入E.coli 菌株以后，通過溫度、誘導(dǎo)劑用量以及誘導(dǎo)時間的控制，誘導(dǎo)其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS-PAGE以檢測表達(dá)蛋白質(zhì) 遺傳背景清楚，基因工程操遺傳背景清楚，基因工程操作方便，商品化表達(dá)載體種作方便，商品化表達(dá)載體種類齊全，表達(dá)效率高；類齊全，表達(dá)效率高； 基本不分泌蛋白，易形成包基

2、本不分泌蛋白，易形成包含體含體(無正確折疊的立體結(jié)構(gòu)無正確折疊的立體結(jié)構(gòu))，無加糖等修飾無加糖等修飾 分泌蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，一般有天然分泌蛋白質(zhì)能力強(qiáng)，一般有天然立體結(jié)構(gòu)；立體結(jié)構(gòu)； 無加糖修飾功能，培養(yǎng)液中蛋白無加糖修飾功能，培養(yǎng)液中蛋白酶活性高，重組蛋白易受蛋白酶酶活性高，重組蛋白易受蛋白酶的水解；的水解； 質(zhì)粒不穩(wěn)定，尚無商品化的表達(dá)質(zhì)粒不穩(wěn)定，尚無商品化的表達(dá)載體載體乳酸菌乳酸菌 (Lactic acid bacteria)沙門氏菌沙門氏菌 (Salmonella typhimurium)蘇云金桿菌蘇云金桿菌 (Bacillus thuringiensis)真核表達(dá) 可生產(chǎn)分泌型蛋白；有天

3、然立體結(jié)構(gòu)，可生產(chǎn)分泌型蛋白；有天然立體結(jié)構(gòu)，有加糖修飾功能；可進(jìn)行染色體整合型有加糖修飾功能；可進(jìn)行染色體整合型基因表達(dá)基因表達(dá); 糖鏈與哺乳動物加工的不一致，培養(yǎng)上糖鏈與哺乳動物加工的不一致，培養(yǎng)上清多糖濃度高清多糖濃度高; 商品化表達(dá)體系：商品化表達(dá)體系： 釀酒酵母釀酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）; 畢氏酵母畢氏酵母 (Pichia pastoris); 裂殖酵母裂殖酵母（Schizosaccharomyce pombe） 可以病毒感染的型式在成蟲中生產(chǎn)，可以病毒感染的型式在成蟲中生產(chǎn)，也可在體外培養(yǎng)細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白也可在體外培養(yǎng)細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白; 適合分泌型和膜蛋

4、白的表達(dá)，有加適合分泌型和膜蛋白的表達(dá)，有加糖修飾；糖修飾； 糖鏈有所區(qū)別，表達(dá)量有限；糖鏈有所區(qū)別，表達(dá)量有限； 作為藥物宿主細(xì)胞未被作為藥物宿主細(xì)胞未被FDA認(rèn)可認(rèn)可 可進(jìn)行分泌表達(dá)，有天然可進(jìn)行分泌表達(dá)，有天然立體結(jié)構(gòu)，加糖方式與人立體結(jié)構(gòu)，加糖方式與人體蛋白質(zhì)完全一致；體蛋白質(zhì)完全一致； 表達(dá)量不夠高，培養(yǎng)成本表達(dá)量不夠高，培養(yǎng)成本較高較高 植物可大面積種植，可以廉植物可大面積種植，可以廉價大規(guī)模生產(chǎn)；價大規(guī)模生產(chǎn)； 轉(zhuǎn)基因植物制作費(fèi)時，表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物制作費(fèi)時，表達(dá)的組織特異性較難控制；的組織特異性較難控制； 表達(dá)量較難提高，分離純化表達(dá)量較難提高，分離純化不方便不方便 分泌生產(chǎn)有天然

5、立體結(jié)構(gòu)和分泌生產(chǎn)有天然立體結(jié)構(gòu)和活性的蛋白質(zhì)至乳汁，產(chǎn)量活性的蛋白質(zhì)至乳汁，產(chǎn)量高，分離純化方便，特別適高，分離純化方便，特別適合藥用蛋白的生產(chǎn)；合藥用蛋白的生產(chǎn)； 轉(zhuǎn)基因動物制作花費(fèi)巨大，轉(zhuǎn)基因動物制作花費(fèi)巨大，實(shí)驗(yàn)周期長實(shí)驗(yàn)周期長 區(qū)別區(qū)別表達(dá)表達(dá)類型類型 載體載體載體舉例載體舉例產(chǎn)物產(chǎn)物原核原核表達(dá)表達(dá)一般簡單，質(zhì)一般簡單，質(zhì)粒不整合到大粒不整合到大腸桿菌的腸桿菌的DNA 而是自己復(fù)制而是自己復(fù)制表達(dá)表達(dá) pET 系列系列產(chǎn)物一級結(jié)構(gòu)產(chǎn)物一級結(jié)構(gòu)正確，但折疊正確，但折疊不一定正確不一定正確 ，沒有糖基化和沒有糖基化和磷酸化等修飾磷酸化等修飾 真核真核表達(dá)表達(dá)一般由宿主細(xì)一般由宿主細(xì)胞匹

6、配的整合胞匹配的整合機(jī)制的載體整機(jī)制的載體整合載體在基因合載體在基因組上表達(dá)組上表達(dá)酵母酵母 Y 系系列列產(chǎn)物一般修飾產(chǎn)物一般修飾的比較好，糖的比較好，糖基化等完全，基化等完全，更接近天然蛋更接近天然蛋白白原核表達(dá)一般程序 1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，根據(jù)重組載體的標(biāo)志（抗Amp或藍(lán)白斑）作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。 2、測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。 3、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。 （秦（秦 偉等，水稻密碼子優(yōu)化的偉等，水稻密碼子優(yōu)化的cry2A* 基因在大

7、腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，2008） （秦（秦 偉等，水稻密碼子優(yōu)化的偉等，水稻密碼子優(yōu)化的cry2A* 基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，2008） （秦（秦 偉等，水稻密碼子優(yōu)化的偉等，水稻密碼子優(yōu)化的cry2A* 基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，2008） （秦（秦 偉等，水稻密碼子優(yōu)化的偉等，水稻密碼子優(yōu)化的cry2A* 基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，基因

8、在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，2008） （秦（秦 偉等，水稻密碼子優(yōu)化的偉等，水稻密碼子優(yōu)化的cry2A* 基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，基因在大腸桿菌中的表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的純化，生物工程，2008）幫助可溶化幫助可溶化幫助分泌到周質(zhì)幫助分泌到周質(zhì)可用親和層析純化可用親和層析純化純化方便純化方便: 先用先用 溶液處理溶液處理, 然后然后 洗出洗出原核表達(dá)優(yōu)化策略如何避免包涵體表達(dá)n延長表達(dá)時間（過夜），低溫培養(yǎng)（延長表達(dá)時間（過夜），低溫培養(yǎng)（2530）n 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化誘導(dǎo)條件的優(yōu)化 n 某些氨基酸的取代某些氨基酸的取代n 共表達(dá)分子伴侶，硫氧還原蛋白的融合表達(dá)或與目標(biāo)蛋白的共表達(dá)共表達(dá)分子伴侶，硫氧還原蛋白的融合表達(dá)或與目標(biāo)蛋白的共表達(dá)n 蛋白毒性，穩(wěn)定性分析，更換宿主菌蛋白毒性，穩(wěn)定性分析，更換宿主菌(利用硫氧還蛋白還原酶缺陷菌株作利用硫氧還蛋白還原酶缺陷菌株作為宿主菌為宿主菌)。 培養(yǎng)基中可加葡萄糖，通常用培養(yǎng)基中可加葡萄糖，通常用2%的濃度。的濃度。 在培養(yǎng)過程中，要保持細(xì)菌搖瓶有良好的通氣條件，充足的氧流量可以在培養(yǎng)過程中，要保持細(xì)菌搖瓶有良好的通氣條件，充足的氧流量可以減少包涵體的形成減少包涵體的形成 His標(biāo)簽蛋白的純化流程 未檢測到蛋白表達(dá)n質(zhì)粒是否成功轉(zhuǎn)化到宿主菌，是否質(zhì)粒丟失/不穩(wěn)定？n誘