生物工程下游技術第十四章+電泳分離技術ppt課件

1、第十四章第十四章 電泳分別技術電泳分別技術電泳是指帶電粒子在電場的作用下，向著與其電泳是指帶電粒子在電場的作用下，向著與其電性相反的電極挪動的景象。電性相反的電極挪動的景象。電泳技術指利用電泳景象對混合物進展分別分電泳技術指利用電泳景象對混合物進展分別分析的技術。析的技術。(1)(1)泳動度泳動度u (u (遷移率遷移率):): 帶電質點在單位強度電場下的帶電質點在單位強度電場下的泳動速度泳動速度不同分子在同一電場中能夠具有不同的泳動度不同分子在同一電場中能夠具有不同的泳動度 3. 3.:0.02-:0.02-0.20.2 4. 4.電滲：液體對固體支持物電滲：液體對固體支持物的相對挪動的相對

2、挪動支持物為溶液，很少用。支持物為溶液，很少用。 凝膠的聚合反響：Ammonium persulfate (free radical initiator)過硫酸銨 Acrylamide (monomer)Bis(acrylamide) (bridge)TEMED (catalyst):四甲基乙二胺自在基的生成者自在基的生成者凝膠的根本單位凝膠的根本單位: :丙烯酰胺丙烯酰胺交聯(lián)使聚合產生分枝交聯(lián)使聚合產生分枝: :甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺協(xié)助傳送自在基的加速劑協(xié)助傳送自在基的加速劑Acrylamide Acrylamide 有毒性！有毒性！-(O S-SO )442-2 SO4CH2=CH-C

3、O-NH21211 2核黃素核黃素-TEMED-TEMED系統(tǒng)與過硫酸銨系統(tǒng)與過硫酸銨-TEMED-TEMED系統(tǒng)系統(tǒng) 丙烯酰胺單體聚合過程：聚合反響聚合反響交聯(lián)劑呵斥分枝交聯(lián)劑呵斥分枝端點自端點自在基可在基可再延續(xù)再延續(xù)freefreeradicalradicalBisBis聚合反響聚合反響交錯連結交錯連結自在基構成自在基構成( )( )(%)100%( )Acr gBis gTV ml( )(%)100%( )( )Bis gCAcr gBis gn核酸核酸(RNA)(RNA)n10410415201520n 104105 104105 5-10 5-10n 105-2 105-21061

4、06 2-2.6 2-2.6HClClH不延續(xù)系統(tǒng)濃縮效應表示圖不延續(xù)系統(tǒng)濃縮效應表示圖 延續(xù)膠與不延續(xù)膠延續(xù)膠與不延續(xù)膠: : 延續(xù)膠：膠條延續(xù)膠：膠條( (膠板膠板) )的濃度、的濃度、pHpH值、值、組成成份不變組成成份不變 不延續(xù)膠不延續(xù)膠: :膠條膠條( (膠板膠板) )的濃度、的濃度、pHpH值、組成成份變化值、組成成份變化延續(xù)膠的制膠過程與點樣過程玻璃板玻璃板 ( (前前, ,后后) )樣本梳樣本梳間間隔隔條條間間隔隔條條 濃縮膠濃縮膠 分別膠分別膠不延續(xù)膠的制膠過程與點樣過程玻璃板玻璃板 ( (前前, ,后后) )樣本梳樣本梳間間隔隔條條間間隔隔條條 電泳凝膠系統(tǒng)的組成：1電泳

5、系統(tǒng)電泳系統(tǒng)pH膠體濃度膠體濃度緩沖液緩沖液上層上層( (負極負極) )緩沖液緩沖液 2樣品溶液樣品溶液 3濃縮膠濃縮膠 6.9 4分別膠分別膠 膠膠體體 5下層下層( (正極正極) )緩沖液緩沖液 Tris-HClTris-HClTris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.3 8.3 5% 7.520% - - - 不延續(xù)膠有聚焦樣品的作用變性膠與非變性膠：變性膠與非變性膠：變性膠：膠電脈在蛋白量變性的形狀下變性膠：膠電脈在蛋白量變性的形狀下進展，進展， 主要指主要指SDSSDS變性條件下進展。變性條件下進展。非變性膠：電泳在蛋白質堅持天

6、然形狀非變性膠：電泳在蛋白質堅持天然形狀下進展，不加變性劑。下進展，不加變性劑。 SDS 在蛋白質外表 均勻敷上 一層負電：SDSboiling變性蛋白質成一線狀分子變性蛋白質成一線狀分子原態(tài)蛋白質原態(tài)蛋白質並且均勻帶上一層負電荷並且均勻帶上一層負電荷非極性尾部非極性尾部極性頭部極性頭部 三種不同性質蛋白質的電泳比較：三種不同性質蛋白質的電泳比較：Molecular WeightpINative PAGESDS-PAGEMobilityProteinQuaternary StructureX YZTetramer(40,000)x4Monomer88,000Monomer60,0005.85.

7、29.3FastSlowMediumSlowUpwardFastX YZ-+。n染色染色將薄膜取出后，置于氨基黑將薄膜取出后，置于氨基黑10B10B染色劑重染色染色劑重染色10min10min。n漂洗漂洗將薄膜取出后，移至漂洗液將薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗假設干次，至無蛋白區(qū)無藍中，漂洗假設干次，至無蛋白區(qū)無藍黑色。黑色。的、線性的的、線性的pH)pH)。5.5.電泳技術問題及對策電泳技術問題及對策1).1).低離子溶液中低離子溶液中, ,不同電荷的蛋白質分子間不同電荷的蛋白質分子間會發(fā)生相互靜電作用會發(fā)生相互靜電作用, ,添加溶液離子強度添加溶液離子強度可減少這種作用可減少這種作用, ,

8、但會提高電泳時的電流但會提高電泳時的電流, ,使產熱更多使產熱更多, ,溫度升高又促進蛋白質的分溫度升高又促進蛋白質的分散散, ,使區(qū)帶變寬使區(qū)帶變寬, ,分辨率下降分辨率下降. .因此電泳緩因此電泳緩沖液的離子強度必需控制適當。沖液的離子強度必需控制適當。0.02-0.2M 0.02-0.2M 的離子強度的離子強度離子強度低離子強度低, ,速度快速度快, ,發(fā)熱低發(fā)熱低, ,有電滲有電滲離子強度高離子強度高, ,速度慢速度慢, ,發(fā)熱大發(fā)熱大電泳技術問題及對策電泳技術問題及對策2).2).蛋白質分子所帶凈電荷主要取決于蛋白質分子所帶凈電荷主要取決于電泳緩沖液的電泳緩沖液的pHpH值值, ,應

9、仔細調整和應仔細調整和控制電泳緩沖液的控制電泳緩沖液的pHpH值值, ,使各組分使各組分分子的凈電荷數差別加大分子的凈電荷數差別加大. .但極端但極端pHpH下蛋白質會變性失活下蛋白質會變性失活, ,因此普通因此普通控制在控制在pH4.5pH4.59.59.5之間之間; ;電泳技術問題及對策電泳技術問題及對策3). 緩沖液的種類,濃度和其他電解質濃度影響蛋白質所帶電荷的極性和數量,同時還影響蛋白質分子間的相互作用,因此必需根據分別溶質的不同選擇適宜的緩沖系統(tǒng);電泳技術問題及對策電泳技術問題及對策4).外表活性劑(SDS等)劇烈破壞蛋白質分子間的非共價作用,使蛋白質分子為外表溶劑分子所包圍,阻止

10、了蛋白質之間的相互作用,同時也消除了不同蛋白質固有的電荷差別;電泳技術問題及對策電泳技術問題及對策5).5).控制電泳介質的有效黏度控制電泳介質的有效黏度, ,包包括選擇適當的凝膠孔徑和添加括選擇適當的凝膠孔徑和添加能添加介質黏度的物質能添加介質黏度的物質; ;電泳技術問題及對策電泳技術問題及對策6).6).電泳過程發(fā)熱量的控制電泳過程發(fā)熱量的控制: : 發(fā)熱的難題：蛋白量變性發(fā)熱的難題：蛋白量變性; ;蛋白質區(qū)帶分蛋白質區(qū)帶分散散, ,分辨率下降分辨率下降; ;對策對策: :減少發(fā)熱減少發(fā)熱: :降低電流降低電流, ,提高電壓提高電壓; ;提高傳熱外提高傳熱外表積表積; ;提高材質的傳熱系數提高材質的傳熱系數; ;提高冷卻系提高冷卻