2基因工程制藥1

1、第二章 基因工程制藥 基因工程是將一種生物的基因分離出來，在體外進行酶切和連接插入載體構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，導(dǎo)入另一種宿主細胞使目的基團得到復(fù)制和表達的技術(shù)。 基因工程可生產(chǎn)的主要藥物是指醫(yī)用活性蛋白和多肽，包括免疫性蛋白、細胞因子、激素、酶等。2.1 基因工程藥物生產(chǎn)的過程2.2 目的基因的獲得2.3 基因的表達2.4 基因工程菌生長代謝的特點2.5 基因工程菌的穩(wěn)定性2.6 基因工程菌的發(fā)酵2.7 基因工程藥物的分離純化2.8 包含體的復(fù)性2.9 基因工程藥物的質(zhì)量控制 2.1 基因工程藥物生產(chǎn)的過程獲得目的基因獲得目的基因重組質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌基因工程菌除菌過濾除菌過濾產(chǎn)物分

2、離純化產(chǎn)物分離純化培養(yǎng)工程菌培養(yǎng)工程菌包裝包裝成品檢定成品檢定半成品檢定半成品檢定基因工程的基本要素：工具酶、目的基因、載體、宿主上、下游2.2 目的基因的獲得一、構(gòu)建基因文庫提取細胞基因組提取細胞基因組dna酶切酶切克隆至特定載體克隆至特定載體雜交或其他雜交或其他方式篩選方式篩選基因文庫基因文庫轉(zhuǎn)化特定宿主細胞轉(zhuǎn)化特定宿主細胞探針探針(如根據(jù)氨基酸序列反推過來的如根據(jù)氨基酸序列反推過來的dna序列，根據(jù)蛋白保守性得到的同序列，根據(jù)蛋白保守性得到的同源序列，已知的部分源序列，已知的部分dna序列序列 )獲取目的基因獲取目的基因適合于無內(nèi)含子的原核生物二、構(gòu)建cdna文庫適合于真核生物基因克隆。

3、提取細胞提取細胞mrna反轉(zhuǎn)錄合反轉(zhuǎn)錄合成成cdna第第一鏈一鏈cdna第二鏈的第二鏈的合成合成雜交篩選雜交篩選或其他方或其他方式篩選式篩選cdna文庫文庫轉(zhuǎn)化特定轉(zhuǎn)化特定宿主細胞宿主細胞探針探針獲取目的基因獲取目的基因cdna片斷片斷與載體連接與載體連接三、 pcr方式 先決條件：已知目的基因的dna序列。 原核：以基因組為模板 反轉(zhuǎn)錄pcr（rt-pcr）：提取mrna，反轉(zhuǎn)錄生成cdna作為模板進行pcr擴增獲得目的基因。四、化學(xué)合成 已知基因或蛋白質(zhì)全長序列，合成短的寡核苷酸片斷，拼接為長的dna片斷，再用連接酶連接成完整基因。2.3 基因表達 基因表達：結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯

4、及所有的加工過程。 一、宿主細胞的選擇 首要條件：能夠生產(chǎn)出有活性的目的產(chǎn)物。 其他條件：容易獲得較高濃度的細胞；容易獲得較高濃度的細胞； 產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高；產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高； 能利用易得廉價原料；能利用易得廉價原料； 不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素； 容易進行容易進行dna重組技術(shù)操作；重組技術(shù)操作； 產(chǎn)物容易提取純化。產(chǎn)物容易提取純化。表達系統(tǒng)的分類：表達系統(tǒng)的分類：1、原核表達體系、原核表達體系（1）大腸桿菌）大腸桿菌：目前采用最多的原核表達體系。：目前采用最多的原核表達體系。 革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌 優(yōu)勢：優(yōu)勢： 遺傳背景清楚，基因組序列已確定；遺傳背景清楚，基因組序

5、列已確定； 生長迅速，平均生長迅速，平均2030min繁殖一代；繁殖一代； 易于培養(yǎng)，生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模培養(yǎng)；易于培養(yǎng)，生產(chǎn)成本低，適合大規(guī)模培養(yǎng)； 外源基因表達水平高，可達總蛋白的外源基因表達水平高，可達總蛋白的530以上；以上； 有大量可供選擇利用的克隆和高效表達載體。有大量可供選擇利用的克隆和高效表達載體。 缺點：缺點：n缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)，缺少糖基化功能缺乏翻譯后加工修飾系統(tǒng)，缺少糖基化功能；n沒有有效釋放蛋白到培養(yǎng)基中的分泌機制沒有有效釋放蛋白到培養(yǎng)基中的分泌機制；n表達的外源蛋白多形成包涵體，蛋白的復(fù)性較困難表達的外源蛋白多形成包涵體，蛋白的復(fù)性較困難 ；n翻譯目的蛋白翻譯

6、目的蛋白n n端常多一個甲硫氨酸殘基（端常多一個甲硫氨酸殘基（augaug編碼）。編碼）。 （2）枯草芽孢桿菌）枯草芽孢桿菌 革蘭氏陽性菌，其基因組測序已經(jīng)完成。革蘭氏陽性菌，其基因組測序已經(jīng)完成。 胞外分泌能力強；胞外分泌能力強； 有很多可用的質(zhì)粒載體；有很多可用的質(zhì)粒載體； 無糖基化功能；無糖基化功能； 具有很強的胞外蛋白酶活性，對目的產(chǎn)物有具有很強的胞外蛋白酶活性，對目的產(chǎn)物有不同程度降解。不同程度降解。（3）鏈霉菌）鏈霉菌 優(yōu)點：優(yōu)點： 對人畜基本無致病性；對人畜基本無致病性； 已發(fā)展了一大批有實用價值的載體質(zhì)粒；已發(fā)展了一大批有實用價值的載體質(zhì)粒； 鏈霉菌的模式菌株天藍色鏈霉菌的基因

7、組測序已完成；鏈霉菌的模式菌株天藍色鏈霉菌的基因組測序已完成； 具有很強的外分泌能力；具有很強的外分泌能力； 表達蛋白基本能正確折疊，不形成包含體；表達蛋白基本能正確折疊，不形成包含體； 具有糖基化功能具有糖基化功能 為重要的工業(yè)微生物，下游培養(yǎng)工藝成熟。為重要的工業(yè)微生物，下游培養(yǎng)工藝成熟。 缺點：缺點： 對其分子生物學(xué)研究不深入；對其分子生物學(xué)研究不深入； 對外源基因表達的影響因素，特別是分泌機理還需系統(tǒng)對外源基因表達的影響因素，特別是分泌機理還需系統(tǒng)研究。研究。n 2、真核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)（1）酵母）酵母 單細胞生物，無毒，易培養(yǎng)，繁殖快。單細胞生物，無毒，易培養(yǎng)，繁殖快。 具有分

8、泌功能，能夠糖基化。具有分泌功能，能夠糖基化。 以往多采用以往多采用釀酒酵母（釀酒酵母（saccharomyces cerevisiae）作作為表達系統(tǒng)，近年來采用為表達系統(tǒng)，近年來采用畢赤酵母（畢赤酵母（pichia pastoris）表達表達蛋白增多。蛋白增多。 畢赤酵母轉(zhuǎn)錄外源基因的啟動子來自于畢赤酵母畢赤酵母轉(zhuǎn)錄外源基因的啟動子來自于畢赤酵母醇氧醇氧化酶化酶i（aox1）的啟動子，）的啟動子，受受甲醇甲醇的嚴格調(diào)控，可使外源的嚴格調(diào)控，可使外源基因高效表達?；蚋咝П磉_。 畢赤酵母的特點：畢赤酵母的特點： 為真核表達體系，可進行翻譯后修飾；為真核表達體系，可進行翻譯后修飾； 表達量高，

9、明膠的表達量可達表達量高，明膠的表達量可達14.8g/l; 比其他的真核表達體系培養(yǎng)成本低，只需要含鹽的簡比其他的真核表達體系培養(yǎng)成本低，只需要含鹽的簡單培養(yǎng)基；單培養(yǎng)基； 適于高密度培養(yǎng)，菌體干重可達適于高密度培養(yǎng)，菌體干重可達100g/l以上。以上。 雜蛋白較少，產(chǎn)物純化容易。雜蛋白較少，產(chǎn)物純化容易。 為了最大限度的穩(wěn)定畢赤酵母表達菌的穩(wěn)定性，已為了最大限度的穩(wěn)定畢赤酵母表達菌的穩(wěn)定性，已構(gòu)建的畢赤酵母載體均為構(gòu)建的畢赤酵母載體均為整合型載體；整合型載體；轉(zhuǎn)化前在限制轉(zhuǎn)化前在限制性內(nèi)切酶單酶切位點進行酶切使性內(nèi)切酶單酶切位點進行酶切使載體線形化，載體線形化，然后轉(zhuǎn)然后轉(zhuǎn)化畢赤酵母，線形化

10、的載體與酵母染色體發(fā)生同源重化畢赤酵母，線形化的載體與酵母染色體發(fā)生同源重組插入到染色體中。組插入到染色體中。 常用載體：常用載體： 非分泌載體（非分泌載體（pao815、ppic3k、ppicz等）等） 分泌型載體（分泌型載體（ ppic9k、ppicz等）等）（2）絲狀真菌）絲狀真菌 近年來在近年來在30種以上種以上絲狀真菌中建立了絲狀真菌中建立了dna轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化體系。（3）昆蟲細胞表達體系）昆蟲細胞表達體系 以昆蟲細胞為表達宿主。以昆蟲細胞為表達宿主。 （4）哺乳動物細胞表達系統(tǒng)）哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 以中國倉鼠卵巢細胞（以中國倉鼠卵巢細胞（cho）和非洲綠猴腎細胞）和非洲綠猴腎細胞（

11、cos）細胞使用最多。）細胞使用最多。 優(yōu)點：優(yōu)點：糖基化的基因產(chǎn)物接近或類似于天然產(chǎn)物，可糖基化的基因產(chǎn)物接近或類似于天然產(chǎn)物，可分泌表達。分泌表達。 缺點：缺點：生長速度慢，培養(yǎng)條件苛刻，成本高。生長速度慢，培養(yǎng)條件苛刻，成本高。 二、大腸桿菌中的基因表達二、大腸桿菌中的基因表達1. 有效的表達載體有效的表達載體2. 密碼子偏好性密碼子偏好性3. 外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位4. 蛋白降解蛋白降解5. 融合表達融合表達6. 分子伴侶分子伴侶1. 有效的表達載體有效的表達載體 典型的大腸桿菌表達載體主要包括：啟動子、操縱位點序列、典型的大腸桿菌表達載體主要包括

12、：啟動子、操縱位點序列、多克隆位點、轉(zhuǎn)錄及翻譯信號、質(zhì)粒復(fù)制起點及抗性基因。多克隆位點、轉(zhuǎn)錄及翻譯信號、質(zhì)粒復(fù)制起點及抗性基因。pgex-3x4952 bpamp(r)laciqgststart codon (atg) for gstcoding region for factor xa cleavagelac operatorrbsoriregion necessary for replicationtac promoter -10promoter -10tac promoter -35promoter -35avai (940)bamhi (935)ecori (945)psti (190

13、6)smai (942)xmai (940)apali (19)apali (1476)apali (2722)apali (3632)1. 有效的表達載體有效的表達載體(1) 載體的復(fù)制 松弛型的載體可增加基因的拷貝數(shù)，有利于外源基因表達。 高拷貝數(shù)的質(zhì)粒加強菌的代謝負荷，會影響菌體生長，不利于表達。1. 有效的表達載體有效的表達載體(2) 啟動子 大腸桿菌啟動子由-10區(qū)和-35區(qū)組成，兩者之間通常間隔1618個核苷酸。 通常采用強啟動子表達蛋白； 誘導(dǎo)型啟動子可人為控制蛋白表達時機； 在表達毒性蛋白或?qū)λ拗饔泻Φ耐庠吹鞍讜r，需要采用強抑制型的啟動子，以減少外源蛋白的本底轉(zhuǎn)錄。 質(zhì)粒質(zhì)粒啟

14、動子啟動子誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)方式提供商提供商pbv220 plpr串聯(lián)啟串聯(lián)啟動子動子42度熱誘導(dǎo)度熱誘導(dǎo)pet系列系列t7iptgnovagen pthiohisa,b,ctrciptginvitrogenpbad系列系列arabad l-阿拉伯糖阿拉伯糖invitrogenpqe系列系列t5iptgqiagenpgex系列系列taciptgge1. 有效的表達載體有效的表達載體(3) 核糖體結(jié)合位點（rbs）與翻譯起始 rbs是翻譯開始時核糖體30s小亞基識別并結(jié)合的mrna 部位，包括起始密碼子及其上游3-13堿基處長度為3-9個核苷酸的sd序列。 sd位點在翻譯起始階段與16s rrna的3

15、端互補結(jié)合。 sdsd序列和序列和sdsd與起始密碼子間的距離影響翻譯起始與起始密碼子間的距離影響翻譯起始的效率：的效率：n在間隔相同的情況下，不同在間隔相同的情況下，不同sdsd序列翻譯效率不同。序列翻譯效率不同。uaaggagguaaggagg的的sdsd序列比序列比aaggaaagga的的sdsd序列能使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量序列能使蛋白質(zhì)的產(chǎn)量提高提高3-63-6倍；倍；n對于同一對于同一sdsd序列，存在一最佳的間隔。序列，存在一最佳的間隔。aaggaaagga的間隔為的間隔為5-75-7個核苷酸，而個核苷酸，而uaaggagguaaggagg的間隔為的間隔為4-84-8個核苷酸；個核苷酸；n

16、對于同一對于同一sdsd序列，有一翻譯所必需的最小間隔序列，有一翻譯所必需的最小間隔。 在在mrna的翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)在決定基因表達效的翻譯起始區(qū)的二級結(jié)構(gòu)在決定基因表達效率方面具有重要作用：率方面具有重要作用：n提高rbs中a、t殘基的豐度能增強某些基因的表達；n突變sd區(qū)上游或下游的某些特定核苷酸會抑制mrna二級結(jié)構(gòu)的形成和提高翻譯效率；n位于起始密碼子下游的密碼子堿基組成，同樣會影響mrna 5端的二級結(jié)構(gòu)，可在保留編碼蛋白序列的同時重新構(gòu)建基因的5端，使其a、t含量增加，減少mrna二級結(jié)構(gòu)增加翻譯效率。 1. 有效的表達載體有效的表達載體(4) 終止密碼子 在構(gòu)建表達載體時，通

17、常插入三個終止密碼在構(gòu)建表達載體時，通常插入三個終止密碼子以防止核糖體的跳躍。在子以防止核糖體的跳躍。在e.coli中偏向于使用中偏向于使用uaa密碼子，尤其當(dāng)其后存在一個密碼子，尤其當(dāng)其后存在一個u形成形成uaau時其轉(zhuǎn)錄終止效率最有效時其轉(zhuǎn)錄終止效率最有效。1. 有效的表達載體有效的表達載體(5) 轉(zhuǎn)錄終止子 在原核生物中，轉(zhuǎn)錄終止有兩種不同的機制：在原核生物中，轉(zhuǎn)錄終止有兩種不同的機制： 其一其一蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄終止；蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄終止； 其二是非其二是非依賴性轉(zhuǎn)錄終止作用，它取決于依賴性轉(zhuǎn)錄終止作用，它取決于dna模模板的結(jié)構(gòu)特征，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如板的結(jié)構(gòu)特征，形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，如t7終止子

18、。終止子。 有效的轉(zhuǎn)錄終止子是表達載體必不可少的元件。貫有效的轉(zhuǎn)錄終止子是表達載體必不可少的元件。貫穿啟動子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動子的功能，造成所謂的啟動子穿啟動子的轉(zhuǎn)錄將抑制啟動子的功能，造成所謂的啟動子封堵。封堵。 在編碼序列下游的適當(dāng)位置放置一轉(zhuǎn)錄終止子，可阻在編碼序列下游的適當(dāng)位置放置一轉(zhuǎn)錄終止子，可阻止轉(zhuǎn)錄貫穿別的啟動子。同樣，在目的基因的啟動子上游止轉(zhuǎn)錄貫穿別的啟動子。同樣，在目的基因的啟動子上游放置一轉(zhuǎn)錄終止子，將防止上游轉(zhuǎn)錄貫穿帶來的影響，還放置一轉(zhuǎn)錄終止子，將防止上游轉(zhuǎn)錄貫穿帶來的影響，還可最大限度地減小背景轉(zhuǎn)錄。可最大限度地減小背景轉(zhuǎn)錄。 1. 有效的表達載體有效的表達載體(5)

19、 轉(zhuǎn)錄終止子 由強啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄會使轉(zhuǎn)錄通讀到復(fù)制區(qū)，由強啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄會使轉(zhuǎn)錄通讀到復(fù)制區(qū)，造成控制質(zhì)?？截悢?shù)的造成控制質(zhì)?？截悢?shù)的rop蛋白的過量表達，導(dǎo)致蛋白的過量表達，導(dǎo)致質(zhì)粒的不穩(wěn)定。質(zhì)粒的不穩(wěn)定。 轉(zhuǎn)錄終止子增強轉(zhuǎn)錄終止子增強mrna的穩(wěn)定性并減少了核苷的穩(wěn)定性并減少了核苷酸在細胞中的消耗，從而提高蛋白質(zhì)的表達水平。酸在細胞中的消耗，從而提高蛋白質(zhì)的表達水平。1. 有效的表達載體有效的表達載體(6) mrna的穩(wěn)定性 mrna的快速降解會影響蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，提高mrna穩(wěn)定性有利于提高外源基因的表達。 在e.coli中有兩類保護性元件能夠穩(wěn)定mrna：nmrna的5 utr的序列

20、；n3 utr序列及保護性的發(fā)卡結(jié)構(gòu)，因而能夠阻斷外切核酸酶從3末端對mrna的降解。2. 2. 密碼子偏好性密碼子偏好性 e.coli中密碼子的偏好性表現(xiàn)在：中密碼子的偏好性表現(xiàn)在： （1）對于絕大多數(shù)的簡并密碼子中的一個或兩個具有）對于絕大多數(shù)的簡并密碼子中的一個或兩個具有偏好；偏好； （2）某些密碼子對所有不同的基因都是最常用的，例）某些密碼子對所有不同的基因都是最常用的，例如如ccg是脯氨酸最常用的密碼子；是脯氨酸最常用的密碼子； （3）高度表達的基因比低表達的基因表現(xiàn)更大程度的）高度表達的基因比低表達的基因表現(xiàn)更大程度的密碼子偏好；密碼子偏好； （4 4）同義密碼子的使用頻率與相應(yīng)的

21、）同義密碼子的使用頻率與相應(yīng)的trnatrna含量有高度含量有高度相關(guān)性。相關(guān)性。2. 2. 密碼子偏好性密碼子偏好性 密碼子偏好對蛋白表達的影響密碼子偏好對蛋白表達的影響: （1）富含富含e.coli不常用密碼子的外源基因不常用密碼子的外源基因 ； （2）存在稀有密碼子的群集；）存在稀有密碼子的群集； （3）mrna的的5末端附近存在稀有密碼子。末端附近存在稀有密碼子。 對策：對策： （1）常用密碼子替換稀有密碼子；）常用密碼子替換稀有密碼子； （2）與）與“稀有稀有”trna基因共表達?；蚬脖磉_。 e.coli e.coli中不常用的密碼子中不常用的密碼子 不常用密碼子aga,agg,c

22、ga,cggugu,ugcauacua,cucccc,ccu,ccauca,agu,ucg,uccacaaca氨基酸argcysileleuproserthrthr3. 外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位(1) 胞內(nèi)表達胞內(nèi)表達 外源蛋白在大腸桿菌胞內(nèi)高效表達時通常形成包涵外源蛋白在大腸桿菌胞內(nèi)高效表達時通常形成包涵體。體。 包涵體表達優(yōu)點包涵體表達優(yōu)點：易分離、可免受胞內(nèi)酶降解。：易分離、可免受胞內(nèi)酶降解。 包涵體表達缺點包涵體表達缺點：需要重新折疊復(fù)性。：需要重新折疊復(fù)性。 3. 外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位(1) 胞內(nèi)表達胞內(nèi)表達

23、 幫助蛋白質(zhì)形成天然空間結(jié)構(gòu)的策略幫助蛋白質(zhì)形成天然空間結(jié)構(gòu)的策略：n較低溫度下培養(yǎng)較低溫度下培養(yǎng); ;n降低誘導(dǎo)強度降低誘導(dǎo)強度; ;n選擇不同的選擇不同的表達表達菌株菌株; ;n替換某些氨基酸殘基替換某些氨基酸殘基n與分子伴侶共表達與分子伴侶共表達n與高溶解性的多肽進行融合表達與高溶解性的多肽進行融合表達 胞內(nèi)表達可溶蛋白的缺點：胞內(nèi)表達可溶蛋白的缺點：容易容易被降解被降解，純化目的純化目的蛋白相對比較困難。蛋白相對比較困難。 (2) 周質(zhì)腔表達周質(zhì)腔表達 在周質(zhì)腔中進行蛋白質(zhì)表達有以下優(yōu)點在周質(zhì)腔中進行蛋白質(zhì)表達有以下優(yōu)點：n有利于目的蛋白的純化；有利于目的蛋白的純化；n有利于蛋白質(zhì)的正

24、確折疊；有利于蛋白質(zhì)的正確折疊；n有可能產(chǎn)生目的蛋白的天然有可能產(chǎn)生目的蛋白的天然n-末端；末端；n蛋白質(zhì)降解少蛋白質(zhì)降解少 成功應(yīng)用的信號肽： e.coli的phoa、ompa、ompt、lamb和ompf以及金黃色葡萄球菌的a蛋白，胡蘿卜歐氏桿菌的pelb的信號肽等。 缺點：信號肽的存在并不總能保證有效的蛋白質(zhì)通過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運。(3) 胞外表達胞外表達 胞外表達優(yōu)點：胞外表達優(yōu)點：n可簡化蛋白質(zhì)的純化；可簡化蛋白質(zhì)的純化；n減少蛋白酶對目的蛋白質(zhì)的降解減少蛋白酶對目的蛋白質(zhì)的降解 然而目前還未完全闡明大腸桿菌外分泌的機理，然而目前還未完全闡明大腸桿菌外分泌的機理，迄今為止還未設(shè)計出切實可行的在

25、胞外制備大量外源迄今為止還未設(shè)計出切實可行的在胞外制備大量外源蛋白的方案。蛋白的方案。 4. 蛋白降解蛋白降解 “n-末端規(guī)則末端規(guī)則”： 末端末端arg、lys、leu、phe、tyr和和trp的半衰期為分鐘，除脯氨的半衰期為分鐘，除脯氨酸外的其他氨基酸的半衰期均超過酸外的其他氨基酸的半衰期均超過10小時小時。 小分子量的蛋白（小于小分子量的蛋白（小于1 1萬）容易被降解。萬）容易被降解。 減少重組蛋白裂解的策略：減少重組蛋白裂解的策略：（1 1）將蛋白質(zhì)靶向細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基；）將蛋白質(zhì)靶向細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基；（2 2）選用蛋白酶缺陷的菌株；）選用蛋白酶缺陷的菌株；（3 3）構(gòu)建）構(gòu)建n-n-

26、末端或末端或c-c-末端融合蛋白；末端融合蛋白；（4 4）在較低的溫度下培養(yǎng)細菌；）在較低的溫度下培養(yǎng)細菌；（5 5）替換特定的氨基酸殘基以消除蛋白酶裂解位點；）替換特定的氨基酸殘基以消除蛋白酶裂解位點；（6 6）與分子伴侶共表達；）與分子伴侶共表達；（7 7）優(yōu)化培養(yǎng)條件）優(yōu)化培養(yǎng)條件5. 融合蛋白融合蛋白 融合表達具有多方面的融合表達具有多方面的優(yōu)點：優(yōu)點：能使外源基因得到有效轉(zhuǎn)譯，能使外源基因得到有效轉(zhuǎn)譯，防止包涵體的形成，促進蛋白質(zhì)的正確折疊，限制蛋白酶解，利防止包涵體的形成，促進蛋白質(zhì)的正確折疊，限制蛋白酶解，利于檢測與純化。于檢測與純化。 成功應(yīng)用的融合擔(dān)體蛋白：成功應(yīng)用的融合擔(dān)體

27、蛋白：谷胱甘肽谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶（轉(zhuǎn)移酶（gst）、麥麥芽糖結(jié)合蛋白（芽糖結(jié)合蛋白（mbp）以及以及硫氧還蛋白（硫氧還蛋白（trx）等。等。 融合表達一般都有方便的純化方法（融合表達一般都有方便的純化方法（ gst 融合蛋白融合蛋白可采用可采用谷胱甘肽谷胱甘肽-sepharose-sepharose親和柱進行純化，帶親和柱進行純化，帶組氨酸標簽組氨酸標簽的融合蛋白的融合蛋白采用采用金屬螯合層析金屬螯合層析純化）。純化）。 缺點：缺點：對融合蛋白進行位點特異性裂解。對融合蛋白進行位點特異性裂解。 6. 分子伴侶分子伴侶 有效的蛋白質(zhì)翻譯后折疊是由一種被稱為分子伴有效的蛋白質(zhì)翻譯后折疊是由一種被稱為分子伴侶的專職蛋白來介導(dǎo)的。侶的專職蛋白來介導(dǎo)的。 原核分子伴侶（原核分子伴侶（groesgroes、groelgroel、dnakdnak、htpghtpg）能）能穩(wěn)定表達的蛋白折疊中間體，可提高正確折疊的蛋白穩(wěn)定表達的蛋白折疊中間體，