聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白課件

1、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白1 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白2電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，發(fā)生定向泳電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，發(fā)生定向泳動(dòng)的現(xiàn)象。動(dòng)的現(xiàn)象。電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析電泳技術(shù)指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。的技術(shù)。電泳基本原理：電泳基本原理：聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白3 coo- coo- cooh + h+ + h+ pr pr pr + oh- + oh- nh2 nh3+ nh3+phpi ph=pi ph 纖維狀纖維狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白6影響電泳速度的因素

2、：影響電泳速度的因素：v樣品本身：帶電量，分子大小，形狀樣品本身：帶電量，分子大小，形狀v電場(chǎng)強(qiáng)度：電壓電場(chǎng)強(qiáng)度：電壓v電泳介質(zhì)的電泳介質(zhì)的phph和離子強(qiáng)度和離子強(qiáng)度v電滲作用電滲作用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白7按凝膠裝置分為盤狀電泳及板狀電泳按凝膠裝置分為盤狀電泳及板狀電泳盤狀電泳通常是盤狀電泳通常是不連續(xù)系統(tǒng)，不連續(xù)系統(tǒng)，利用緩沖液離子成分、利用緩沖液離子成分、phph、凝膠孔徑進(jìn)行電泳，帶電顆粒電泳時(shí)具有、凝膠孔徑進(jìn)行電泳，帶電顆粒電泳時(shí)具有電荷效電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、應(yīng)、分子篩效應(yīng)、 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳分類聚丙烯酰胺凝膠電泳分類聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白8以

3、聚丙烯酰胺作為支持介質(zhì)的一種電泳技術(shù)。凝以聚丙烯酰胺作為支持介質(zhì)的一種電泳技術(shù)。凝膠是膠是單體聚丙烯酰胺（單體聚丙烯酰胺（acr)acr)和和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺酰胺(bis)(bis)交聯(lián)而成的，催化劑為交聯(lián)而成的，催化劑為過硫酸銨過硫酸銨(ap)(ap)，加速劑為四甲基乙二胺加速劑為四甲基乙二胺temedtemed, , 形成形成三維網(wǎng)狀凝膠。三維網(wǎng)狀凝膠。聚丙烯酰胺凝膠（聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel, pag）的聚合反應(yīng)：的聚合反應(yīng)：聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白9 緩沖液離子成分、緩沖液離子成分、phph的不連續(xù)性：的不連續(xù)性：電極緩沖液通常為電

4、極緩沖液通常為ph8.3 tris-ph8.3 tris-甘氨酸甘氨酸緩沖液，樣品及凝膠中緩沖液為緩沖液，樣品及凝膠中緩沖液為ph6.7 tris-hclph6.7 tris-hcl緩沖液。電極緩沖液的緩沖液。電極緩沖液的ph=8.3ph=8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離，甘氨酸的電離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大，稱為快離子；蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于二者之子完全電離，有效遷移率大，稱為快離子；蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于二者之間。電泳開始后，氯離子跑得最快，留下一段低電導(dǎo)區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度間。電泳開始后，氯離子跑得最快，留下一段低電導(dǎo)

5、區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度（電位與電導(dǎo)率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間而（電位與電導(dǎo)率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間而被壓縮。被壓縮。1cm1cm厚樣品層可以壓縮厚樣品層可以壓縮0.250.25m m的厚度。的厚度。三大效應(yīng)：三大效應(yīng)：濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白10成分成分phph值值孔徑孔徑電泳緩沖液電泳緩沖液甘氨酸甘氨酸( (慢離子慢離子) )8.38.3樣品樣品蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)6.76.7濃縮膠濃縮膠clcl- -( (快離子快離子) )6.76.7大大分離膠分離膠clcl- -( (快離子快離子) )8.98.9小小有效遷移率有效遷移率 =

6、 遷移率遷移率 解離度解離度聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白11聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白12分子篩效應(yīng)：分子篩效應(yīng)：分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出通過一定孔徑分離膠時(shí)，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。當(dāng)樣品進(jìn)入分離當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠，凝膠孔徑變小，膠，凝膠孔徑變小，分子量小，阻力小，移動(dòng)快；分分子量小，阻力小，移動(dòng)快；分子量大，阻力大，移動(dòng)慢。子量大，阻力大，移動(dòng)慢。電荷效應(yīng)：電荷效應(yīng)：電荷量不同，遷移率不同。電荷量不同，遷移率不同。聚丙烯酰胺凝膠電泳分

7、離血清蛋白13實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1.制備制備pagepage膠柱膠柱 畫線，封口：在一端取畫線，封口：在一端取7cm7cm和和7.5cm7.5cm兩處畫線，此兩處畫線，此 端管口插入橡皮墊。端管口插入橡皮墊。 制備分離膠：配制好制備分離膠：配制好7.5%7.5%分離膠，緩慢注入玻璃管分離膠，緩慢注入玻璃管 7cm7cm處，加水防止氧化，室溫下聚合處，加水防止氧化，室溫下聚合 聚合聚合20-30min20-30min。 制備濃縮膠：配制好制備濃縮膠：配制好3%3%濃縮膠。將膠上層水傾倒出濃縮膠。將膠上層水傾倒出 去，用濾紙吸干余水。加濃縮膠，封去，用濾紙吸干余水。加濃縮膠，封 水。室溫下聚合水。室

8、溫下聚合20-30min20-30min。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白14 2. 2. 上樣和電泳：上樣和電泳：將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠塞孔中，加入電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入塞孔中，加入電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入凝膠管及上槽，除氣泡凝膠管及上槽，除氣泡, , 加樣品液加樣品液50l50l至濃縮膠至濃縮膠面。加電解液直至裝滿上電泳槽。電泳約面。加電解液直至裝滿上電泳槽。電泳約1.5hr1.5hr。 3. 3. 染色，觀察結(jié)果：染色，觀察結(jié)果：將膠從玻璃管中取出，注將膠從玻璃管中取出，注意不要弄斷凝膠。凝膠考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫意不要弄斷凝膠。凝膠考馬斯亮藍(lán)染色，然后脫色，脫色色，脫色至背景清晰至背景清晰。觀察結(jié)果。觀察結(jié)果。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白15聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白16結(jié)果示意圖：結(jié)果示意圖： 2 1清蛋白清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白171 1丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，對(duì)皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。對(duì)皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。2 2制膠時(shí)，要充分搖勻，加