枯草芽孢桿菌芽孢中的芽孢衣

1、枯草芽孢桿菌芽孢中的芽孢衣 · 108 · 文章編號：10001336(2005)02-0108-03 生命 2oo5年25卷2期 CHEMISTRY OF LIFE 2005，25(2) Mini Reviews 枯草芽孢桿菌芽孢中的芽孢衣 劉燕秦玉昌 (中國農業(yè)科學學院飼料研究所，北京100081) 摘要： 芽孢衣是賦予芽孢對有機溶劑和溶菌酶的抗性，以及對外界出芽誘導物的感應能力的保護性結構。該文 主要介紹由枯草芽孢桿菌(bacillus subtilis)所形成的芽孢的芽孢衣中已鑒定的主要蛋白質，及其基因表達調控和 應用等方面的研究進展。 關鍵詞：芽孢衣：形態(tài)建成蛋白

2、質(morphogenetic protein)；表面展示蛋白質 中圖分類號：Q934 芽孢是某些革蘭氏陽性細菌用于抵抗不良環(huán) 境的休眠結構。從開始形成到結束大約需要810 h。在芽孢形成的初期，首先是經歷不對稱分裂 形成大小不等的兩個細胞。大的為母細胞 (mother cel1)， 小的為前芽孢(forespore)。各自包 裹一部分染色體。然后前芽孢內陷進入母細胞， 形成大細胞中包裹小細胞的形式。大小細胞經歷 不同的發(fā)育過程，前芽孢最終發(fā)育為芽孢，而母 細胞則為前芽孢的發(fā)育提供營養(yǎng)和結構成分。 收稿日期：2004一l130 作者簡介：劉燕(1982一)，女，碩士生，Email：liuyan

3、llhyahoo Com Cn 芽孢的高度抗性主要依賴于高度脫水的核心 (core)及包裹芽孢的兩層結構：皮層(the cortex) 和芽孢衣(the spore coat)。在芽孢衣的組裝過程中 基因表達的調控無疑是不可缺少的，但存儲于蛋 白質本身或輔助蛋白質的結構信息對蛋白質的正 確定位也起到很重要的作用。已分離出幾種指導 其他蛋白質正確定位的形態(tài)建成蛋白質：并提出 了芽孢衣的初步組裝模型。芽孢衣蛋白質的自我 組裝已經成為研究生物大分子自我組裝的模型。 芽孢還被用作載體，利用其芽孢衣蛋白質來展示 其他外源蛋白質。 1芽孢衣的形態(tài)和蛋白質組成 病毒載體，即新構建的CRAd、作為陽性對照的

4、含巨細胞病毒啟動子的腺病毒(AdCMVE1A)及 作為陰性對照的復制缺陷型腺病毒，以比較新構 建CRAd的效力：還需設定檢測時間及設定病毒 不同的感染復數(multiplicity of infection，MOI)， 以綜合評價其復制水平和溶瘤能力：此外。還要 構建體內實驗的動物模型。 臨床前評價應包括體外和體內實驗兩部分。 體外實驗在細胞培養(yǎng)基礎上進行如感染病毒后 正常及靶腫瘤細胞成活率分析： 而病毒復制能力 分析則可采用Western 印跡法、空斑測定(plaque assay)及逆轉錄酶聚合酶鏈反應技術fRTPCR) 等。體內實驗在構建動物模型后，瘤內注射一定 量的病毒監(jiān)測異種移植瘤生

5、長情況并跟蹤小鼠 成活期；還需小鼠尾靜 脈注射病毒，一定時間 后，取小鼠肝、脾等器官進行組織病理分析以評 價新構建CRAd載體的毒性 m1。 近幾年來，CRAd已成為有前途的新型癌癥 基因治療載體。尤其它在臨床前實驗階段所顯示 出的強有力的溶瘤作用為實體瘤的治療帶來了 新的希望。而且， 隨著對病毒生物學方面知識不 斷深入的了解，將引導我們在增強病毒靶向型、 基因轉移效率、腫瘤特異性復制的調控及在人體 內的穩(wěn)定性方面進行更為深入的研究，從而構建 出復制效率更高、特異性更強、應用范圍更廣的 CRAd載體 參 考 文 獻 Kirn D et a1Nat Med20017：78l一787 Doroni

6、n K et af、J Wm 2ooO74：6l47 6l55 Kanerva A et a1nt J Cancer,20o41l0：475 480 Nettelbeck DM et a1Cancer Res，2002，62：4663- 4670 Hallenbeck PL ef afHum Gene Ther,l9991O：l72l l733 Yu DC ef afCan cer Res20o16l：5l7 525 akubczak JL et aCancer Res，20O363：1490- 1499 Yamamoto M et a1Gastroenterology2003125：l203

7、一l2l8 Kancl'va A et afC,ene Ther,20o41l：552 559 Huang Q et a1c 抽Cancer Res200410：l4391445 Irving J et a1Can cer Gene Ther,20o41l：l74一l85 Song JSBiosci Biotechnol Biochem20048：l634 1639 小綜述 A 生命的化學>2005年25卷2期 CHEMISTRY OF LIFE 2005，25(2) 外膜 內膜 皮層 外膜 內膜 皮層 B C D 圖l 芽孢衣組裝模型【11 MC，母細胞；FS，

8、前芽孢；JA，CotjA；jc，CotjC；A，CotA；M，CotM；H，CotH；D，CotD；S，CotS；T，CotT；G，CotG；B，CotB 芽孢衣是由富含酪氨酸和半胱氨酸的多肽組 成的層狀結構。不同菌種形成的芽孢的組成芽孢 衣的多肽數目差別很大，從蠟樣芽孢桿菌中僅以 一種為主到枯草桿菌中達25種之多。在電鏡下觀 察，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)所形成的芽孢 的芽孢衣分為三層：不定型的底層(undercoat)、片 狀的內層及密電子具殼紋的外層。內層大約寬75 nm主要由CotD、CotH、CotS和CotT等蛋白質 組成。外層比內層寬些，大概從70 nm

9、到200 nm 左右，主要由CotB、CotC、CotG和CotF等蛋白質 組成。此外，還有一些重要的協(xié)調其他蛋白質組 裝的形態(tài)建成蛋白質，如Spo1VA、CotE、SpoVID和 SafA等。 2構成芽孢衣的各種蛋白質 21主要的形態(tài)建成蛋白質 (1)SpoIVA：當編碼 SpoiVA的基因缺失，前芽孢衣(precoat)能形成， 但游離在母細胞的細胞質當中， 而不是包裹著前 芽孢，并且前芽孢的雙層膜當中沒有皮層的形成。 對正常的芽孢進行免疫熒光分析，發(fā)現SpoIVA在 前芽孢的表面構成環(huán)， 與前芽孢的外膜直接相 連。其作用是將基質層固定于前芽孢上，并參與 皮層的形成， 以及協(xié)調 芽孢衣和皮

10、層二者的形 成。(2)CotE：如缺失，則芽孢衣不能形成。用免 疫電鏡觀察發(fā)現該蛋白質定位于芽孢衣的內外 層之間。在指導外層蛋白質的組裝中起重要作用。 (3)SpoVID：SpoVID缺失如同SpoIVA缺失一樣， 能形成游離的芽孢衣，但不同的是皮層可以正常 的形成。說明SpoD與SpoIVA一起參與基質層 的固定，但前者不參與皮層的形成。 22 起輕度調節(jié)作用的形態(tài)建成蛋白質 (1) CotT：該基因缺失，則芽孢表現為在葡萄糖和果 糖為誘導物時出芽速度變慢，芽孢衣的內層變 薄， 但抗性很正常。CotT 蛋白質分子量為78 kD，由101 kD的前體切割而來，并且其C末端 無一例外是由酪氨酸和

11、甘氨酸組成的。(2)CotG： 該基因缺失對芽孢的抗性和出芽能力均無明顯影 響只是芽孢衣外層的形態(tài)非常的不正常。該蛋 白質分子量為24 kD， 半數以上的氨基酸都帶正 電荷 (3)Corm：缺失可導致芽孢衣的外層組成蛋 白質如CotC含量的顯著下降，并且芽孢衣的表面 不再光滑，而是出現一些突起。 23功能不明確的蛋白質 主要指一些其基因被剔 除之后對芽孢無論是形態(tài)抗性還是出芽能力都 無顯著影響的蛋白質， 如CotB、CotC。(1)CotC： 在芽孢衣中由CotC基因編碼的蛋白質至少有四種 形式，在芽孢形成大概8 h左右出現兩種，分子量 分別為12 kD和21 kD2 h之后又出現兩種分子 量

12、分別為125 kD和30 kD的蛋白質。后兩種是由 前兩種修飾的產物【l】。(2)CotB：該基因的編碼產物 應是46 kD，但廣泛存在于芽孢衣中的是66 kD的 CotB蛋白質，后者是由前者轉化來的【2。 3芽孢衣蛋白質合成的基因調控與組裝的模型 芽孢衣的組成蛋白質都是在母細胞中合成的， 接受o-E、SpoHID、盯x及GerE等母細胞中特殊的 盯因子或DNA結合蛋白質的調控。芽孢衣的組裝 人為的可以劃分為4步：(1)不對稱分裂完成，盯E 活化 由之轉錄出的SpoIVA和SpoVID結合到母 細胞的側隔膜上。二者形成一個球狀的外殼。Spo D定位依賴于Spo1VA而SpoIVA的定位則依 賴

13、于SpoVM。(2)前芽孢衣(precoat)的形成。Spo · 110 · 生命的化學)2005年25卷2期 CHEMISTRY OF LIFE 2005，25(2) A指導cotE在距離由SpoIVA 和Spo1VD形成的 球狀外殼75 nm處形成環(huán)狀結構。中間75 nm 的 空隙由多孔的基質(matrix)組成，是其他內層芽 孢衣蛋白質組裝的位點。CotE 由E一0rE轉錄，并 受到SpoD的調控。(3)依賴于0rK的內外層芽孢 衣的組裝。裹吞完成之后， 在E一0rK的轉錄作用 之下 一些內層芽孢衣蛋白質如CotD、CotH、 CotS和CotT等被合成并填充到75

14、nm的基質中， 另一些構成外層芽孢衣的蛋白質如CotB、Cot C、 CotG和CotF等以依賴于CotE的方式在由CotE形 成的環(huán)狀結構的外側進行組裝。(4)由13" 和GerE 雙重調控的內外層芽孢衣蛋白質的組裝階段。例 如CotG指導CotB進行組裝，以及一些組裝后修 飾。組裝模型圖解見圖131。在整個組裝過程中， 前兩步是在裹吞之前， 由盯因子0rE進行轉錄， 部分蛋白質受到SpoII1D 的調控， 而后兩步是在 裹吞完成之后，由0rK因子進行轉錄，部分蛋白 質受到GerE的調控。在基因順序表達的過程中， 也存在著反饋抑制，如0rK對編碼0rE的基因的轉 錄起抑制作

15、用SpoII1 D對E一0rE轉錄的基因部分 起激活作用，部分起抑制作用，GerE抑制部分由 E一0rK轉錄的基因。與芽孢衣形成相關的蛋白質的 基因除了CotB、CotG和CotH是緊密連鎖的之外 其他基因都是分散地存在于整個基因組當中。 4芽孢衣蛋白質合成后修飾 盡管芽孢衣蛋白質的合成是受到基因調控的 但芽孢衣的正確組裝和定位還需依賴于特定蛋白 質之間的聯(lián)系， 以及各種轉錄后修飾，包括交 聯(lián)、糖基化和蛋白質酶水解等等。(1)交聯(lián)：構成 芽孢衣的蛋白質富含半胱氨酸和酪氨酸使芽孢 衣中存在著大量的二硫鍵及二酪氨酸之間形成的 鍵，增加了芽孢衣的強度。CotE具有過氧化物酶 活性，可以催化二酪氨酸交

16、聯(lián)， 該活性可能在 CotE指導外層芽孢衣蛋白質組裝時起作用。由基 因糾編碼的蛋白質具有轉谷氨酰氨酶的活性，可 以形成s一賴氨酸交聯(lián)。(2)糖基化： 由GerE調控 的cge和sps基因的編碼產物是糖基轉移酶芽 孢表面蛋白質的糖基化與否可以決定芽孢的疏水 性和黏附能力。(3)蛋白質酶的作用，至少一種 GerE依賴的與芽孢衣相連的蛋白質水解酶已經被 鑒定。除了上述幾種調節(jié)方式外，還有其他方 式， 例如：SarA基因編碼一個45 kD 的蛋白質。 但還存在一種只具有SarA基因C末端編碼的大小 為30 kD 的蛋白質，并且該蛋白質的N末端是由 Mini Reviews SarA基因第164個密碼子

17、編碼的甲硫氨酸。研究 表明，這兩種蛋白質是由同一基因進行選擇性剪 接造成的【4J。 5芽孢衣蛋白質在表面展示技術中的應用 表面展示技術用于生物吸附劑和生物催化劑 的開發(fā)；抗菌素和抗原的鑒定；疫苗和藥物的靶 向定位等。該技術一般是通過將乘客蛋白質 (passenger protein)的基因與具有膜定位區(qū)的裝載 蛋白質(carrier protein)基因進行融合，表達出定 位于宿主表面的融合蛋白質。目前應用作為裝載 蛋白質的芽孢衣蛋白質主要是CotB和CotC。選擇 CotB是因為其已經確定定位于芽孢衣的外表面， 而CotC則是芽孢衣中較豐富的蛋白質。并且二者 的缺 失不會影響到芽孢的正常形成

18、和正常的出芽。 利用CotB已經成功地展示了破傷風毒素的含459 個氨基酸殘基的C末端(1TrFC)ts。與其他的表面 展示系統(tǒng)相比，利用芽孢衣蛋白質作為裝載蛋白 質有很多優(yōu)點，其中最重要的是后者具有較高的 穩(wěn)定性。試驗證明，新制備的與儲存l2周的 CotBTI'FC展示芽孢具有相似的抗原性t6。利用芽 孢作為表面展示系統(tǒng)的載體具有廣闊的前景。 目前對芽孢衣蛋白質的研究主要是通過將化 學提取法和聚丙烯酰胺凝膠電泳相結合對芽孢 衣蛋白質組分進行分離，再利用反遺傳技術(re verse genetics approach)獲取基因。或對測序得到 的未知功能的基因，通過獲得缺失突變體來確 定該基因的功能。通過這些方法對芽孢衣蛋白質 的組成以及組裝過程已經有一定了解，但還有很 多待解決的問題。如cotE是怎樣組織外層蛋白質 進行組裝的，芽孢衣蛋白質什么區(qū)域的特點決定 了其是定位于內膜還是外膜各種蛋白質之間如 Cotja和Cotjc之間的關系等等。芽孢衣蛋白質的 組裝過程如同E coli的T4噬菌體組裝過程一樣 已經成為了解復雜形態(tài)發(fā)生過程中自我組裝的研 究模型。對芽孢衣的研究無論從理論上還是實際 的應用都具有重要的意義。 參 考 文 獻 【1 I