食源性致病菌及其檢測(cè)技術(shù)的調(diào)查

1、食源性致病菌及微生物檢測(cè)技術(shù)的調(diào)查報(bào)告目錄前言11 食源性致病菌概述21.1 食源性致病菌的定義及種類21.2 食源性致病菌對(duì)人體健康的影響21.3 食源性致病菌引起的食品安全問題31.3.1 國(guó)際情況31.3.2 國(guó)內(nèi)情況31.3.3 食源性疾病不斷上升的原因52 國(guó)內(nèi)外的食品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)體系52.1 國(guó)外主要食品微生物檢測(cè)體系52.2 國(guó)內(nèi)主要食品微生物檢測(cè)體系62.3 常見食源性致病菌檢測(cè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)62.4 國(guó)標(biāo)中致病菌常規(guī)檢測(cè)方法流程73 微生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀83.1 常規(guī)微生物快速檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良法83.2 常規(guī)微生物快速檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀快速檢測(cè)微生物數(shù)量的新方法93.2.1

2、 ATP生物熒光法93.2.2 檢測(cè)微生物產(chǎn)生的CO2量的方法103.2.3 電化學(xué)方法（電導(dǎo)率法或電阻抗法）103.2.4 顏色變化113.2.5 流式細(xì)胞技術(shù)113.2.6 熱量法113.2.7 放射測(cè)量法123.3食源性致病菌快速檢測(cè)方法123.3.1 顯色培養(yǎng)基法123.3.2 免疫學(xué)方法123.3.3分子生物學(xué)檢測(cè)方法154 小結(jié)16前言近年來(lái)我國(guó)食品安全頻頻出現(xiàn)問題，食品安全問題已經(jīng)成為生活中不可不談的話題。同時(shí)食品引發(fā)的中毒事故頻發(fā)，媒體曝光度增加，消費(fèi)者對(duì)食品安全的重視程度與日俱增，國(guó)家也加大了食品安全問題的整頓和監(jiān)管力度。根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)管總局法制司19日發(fā)布的通知，國(guó)務(wù)院

3、已將食品安全法修訂工作列入2013年立法計(jì)劃。影響我國(guó)食品安全的最主要因素是微生物污染和化學(xué)性物質(zhì)污染，而由病原微生物引起的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一。化學(xué)污染監(jiān)管，將進(jìn)入長(zhǎng)期化和制度化；食源性疾病，這一食品安全隱患因微生物性食物中毒事件屢次發(fā)生，它也不會(huì)再繼續(xù)“潛伏”。在由衛(wèi)生部、工業(yè)和信息化部、商務(wù)部、工商總局、質(zhì)檢總局、糧食局和食品藥品監(jiān)管局聯(lián)合制訂的2013年國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)計(jì)劃中，對(duì)食品微生物及其致病因子、食源性疾病監(jiān)測(cè)制定了全面而詳細(xì)的監(jiān)控計(jì)劃。食源性疾病逐漸也引起越來(lái)越多專家、學(xué)者的廣泛關(guān)注，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心的陳君石院士、劉秀梅教授等在多個(gè)場(chǎng)合多次倡議重視

4、微生物引起的食源性疾病。在這樣的社會(huì)背景下，我國(guó)食源性致病菌檢測(cè)鏈條的發(fā)展有著巨大的空間?？焖俣鴾?zhǔn)確檢測(cè)出被稱為“頭號(hào)殺手”的食品致病菌，是確保食品安全的首要任務(wù)。1 食源性致病菌概述1.1 食源性致病菌的定義及種類 我國(guó)食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目包括一般性檢驗(yàn)項(xiàng)目和致病菌兩大類。一般檢驗(yàn)項(xiàng)目包括菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母等指標(biāo)。食源性致病菌，指在食品的加工和流通過(guò)程中引入的病原菌，這些病原菌在食品中存活、生長(zhǎng)代謝引起食物的變質(zhì)和破壞，同時(shí)有些病原菌分泌有毒物質(zhì)，直接或間接導(dǎo)致人患病。常見細(xì)菌性食物中毒的病原微生物有：致病性大腸桿菌（特別是出血性大腸桿菌O157：H7）；沙門氏菌屬；志賀氏菌；

5、致病性弧菌（包括：霍亂弧菌、副溶血性弧菌）；金黃色葡萄球菌及其腸毒素；近年來(lái)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒的微生物越來(lái)越多，包括單核增生李斯特菌、空腸彎曲菌等。我國(guó)對(duì)菌落總數(shù)（包括霉菌酵母菌）和大腸菌群限量標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定最大限量，致病菌規(guī)定“不得檢出”。1.2 食源性致病菌對(duì)人體健康的影響1.2.1 引起急性中毒。v在一般情況下，常引起急性中毒，輕者多以急性胃腸炎癥狀出現(xiàn)，如嘔吐、惡心、腹痛、腹瀉、發(fā)燒等，經(jīng)過(guò)治療可以恢復(fù)健康；但重者可出現(xiàn)呼吸、循環(huán)、神經(jīng)等系統(tǒng)癥狀，搶救及時(shí)可轉(zhuǎn)危為安；如貽誤時(shí)機(jī)還可危及生命，有的急性中毒，雖經(jīng)千方百計(jì)治療，但仍給中毒者留下后遺癥。 2.2 慢性中毒或潛在性危害。有些變質(zhì)

6、食品中的有毒物質(zhì)含量少，或者由于本身毒性作用的特點(diǎn)，并不引起急性中毒，但長(zhǎng)期食用，往往可造成慢性中毒，甚至可以表現(xiàn)有致癌、致畸、致突變的作用。食用腐敗變質(zhì)、霉變食物除了可以引起急性中毒外，還具有極其嚴(yán)重的潛在危害。1.3 食源性致病菌引起的食品安全問題1.3.1 國(guó)際情況食源性疾病并不隨經(jīng)濟(jì)發(fā)展技術(shù)進(jìn)步而減少或消失，世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件接連發(fā)生，食源性疾病未能受到有效控制。近年來(lái)，全球食源性疾病發(fā)病率呈不斷上升的趨勢(shì)。1996年日本發(fā)生了世界上規(guī)模最大的歷時(shí)3 個(gè)月，波及40多個(gè)都府縣，涉及上萬(wàn)人的大腸桿菌O157食物中毒。2000年日本雪印牛奶金黃色葡萄球菌中毒事件，中毒者逾萬(wàn)人。20

7、05年遍及整個(gè)東南亞的禽流感更為各國(guó)的食品安全部門敲響警鐘。2011美國(guó)23個(gè)州爆發(fā)了活禽引發(fā)的沙門氏菌疫情，造成將近100人感染。法國(guó)的多起因食用李斯特菌感染的熟肉制品而引發(fā)的食物中毒事件。WHO統(tǒng)計(jì)，全球每年發(fā)生約15億腹瀉病例，導(dǎo)致約300萬(wàn)5歲以下兒童死亡，其中約70%是因?yàn)樯镌葱晕廴臼称匪?。美?guó)疾病控制和預(yù)防中心（CDC）估計(jì)，美國(guó)每年由食源性致病菌造成大約7600萬(wàn)例疾病，3215萬(wàn)例住院治療，5200例死亡；其中由已知致病菌引起的食源性疾病大約1400萬(wàn)例，6萬(wàn)例住院治療和1800例死亡。澳大利亞每年因食源性疾病帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)26億澳元。英格蘭和威爾士每年約有2,366,

8、000 例病人，每年的醫(yī)療費(fèi)和損失約為 3-7億英鎊。1.3.2 國(guó)內(nèi)情況1.3.2.1 2010年-2013年第一季度，我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的全國(guó)食物中毒事件情況的通報(bào)2010年食物中毒原因分類數(shù)據(jù)匯總中毒原因報(bào)告起數(shù)中毒人數(shù)死亡人數(shù)微生物性81458516化學(xué)性4068248有毒動(dòng)植物及毒蘑菇771151112不明原因229658合 計(jì)22073831842011年食物中毒原因分類數(shù)據(jù)匯總中毒原因報(bào)告起數(shù)中毒人數(shù)死亡人數(shù)微生物性78513314化學(xué)性3073057有毒動(dòng)植物及毒蘑菇53154351不明原因2891815合 計(jì)18983241372012年食物中毒原因分類數(shù)據(jù)匯

9、總中毒原因報(bào)告起數(shù)中毒人數(shù)死亡人數(shù)微生物性56374916化 學(xué) 性2139519有毒動(dòng)植物及毒蘑菇7299099不明原因25155112合計(jì)17466851462013年第一季度食物中毒原因分類數(shù)據(jù)匯總中毒原因報(bào)告起數(shù)中毒人數(shù)死亡人數(shù)微生物性62981化 學(xué) 性5757有毒動(dòng)植物91759不明原因或尚未查明原因42071合計(jì)2475518匯總2010年-2013年第一季度，我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的全國(guó)食物中毒事件情況的通報(bào)，得到的數(shù)據(jù)如下：2010年-2013年第一季度食物中毒原因分類數(shù)據(jù)匯總中毒原因報(bào)告起數(shù)中毒人數(shù)死亡人數(shù)微生物性2211376547化學(xué)性961882131有毒動(dòng)植物及毒蘑菇211

10、3859271不明原因79364136合 計(jì)60723147485由上述監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)得出，從食物中毒原因來(lái)看，每年均為微生物性食物中毒事件報(bào)告中毒人數(shù)最多。主要是由沙門氏菌、蠟樣芽胞桿菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、肉毒毒素、葡萄球菌腸毒素、變形桿菌、氣單胞菌、志賀氏菌、肺炎克雷伯桿菌、椰毒假單胞菌等引起的細(xì)菌性食物中毒。1.3.2.2我國(guó)最近一項(xiàng)食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)情況中國(guó)最新一項(xiàng)食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)顯示，我國(guó)平均6.5人中就有1人次罹患食源性疾病。致病微生物引起的食品安全問題在我國(guó)屢見不鮮，一旦發(fā)生，對(duì)公眾的健康危害是明確而廣泛的。正如中國(guó)工程院院士、國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心研究員陳君石所述

11、，我國(guó)食品安全問題的三大敵人依次是微生物引起的食源性疾病，農(nóng)殘、獸殘、重金屬、天然毒素、有機(jī)污染物等化學(xué)性污染以及非法使用食品添加劑，但我國(guó)對(duì)致病微生物引起的食源性食品安全問題尚重視不足。1.3.3 食源性疾病不斷上升的原因飲食模式的改變，例如對(duì)生鮮食品和未徹底加熱食品的偏愛、從食品的加工至消費(fèi)間隔時(shí)間的延長(zhǎng)、不在家中進(jìn)餐時(shí)尚的流行等均是微生物性食源性疾病發(fā)病率上升的原因。新的致病微生物和那些以前與食品無(wú)關(guān)的致病性微生物也是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。近期發(fā)生的多起因食源性致病菌造成的食品安全事件如下：（1）6月10日徐福記隔夜蛋炒飯毒倒百余員工，確定為由腸炎沙門氏菌引起；（2）眉山“6.13”公

12、共衛(wèi)生事件（四川眉山300多名學(xué)生感染性腹瀉）病因查明為沙門氏菌污染；（3）6月17日廣州76名夜班工人集體食物中毒事件，確定為沙門氏菌感染引起。沙門氏菌是世界最常見引發(fā)食源性疾病爆發(fā)的病原菌。沙門氏菌是全球報(bào)道最多的、各國(guó)公認(rèn)的食源性疾病首要病原菌，廣泛發(fā)生于家庭、學(xué)校、公共餐飲單 位及醫(yī)院。沙門氏菌主要感染禽類，人們食用了被沙門氏菌感染的禽肉而發(fā)生食源性疾患。世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織微生物危險(xiǎn)性評(píng)估專家根據(jù)大量資料，通過(guò)數(shù)學(xué)模型對(duì)雞的感染與人的患病率的關(guān)系進(jìn)行了預(yù)測(cè)評(píng)估，如宰殺后雞感染率為20，預(yù)測(cè)每餐危險(xiǎn)性為1.13人/10萬(wàn)餐次，預(yù)測(cè)年發(fā)病的危險(xiǎn)性為2.94人/1萬(wàn)餐次。2 國(guó)內(nèi)外

13、的食品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)體系所有為檢測(cè)食源性病原菌或毒素而研制的新的檢測(cè)方法在常規(guī)用于食品檢測(cè)之前都必須與標(biāo)準(zhǔn)化的微生物檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)其有效性。在美國(guó)，用于檢測(cè)臨床標(biāo)本的檢測(cè)方法都需要經(jīng)過(guò)美國(guó)食品藥品管理局（FDA）的評(píng)價(jià)和批準(zhǔn)。然而，在食品檢測(cè)中卻沒有類似的政府認(rèn)證批準(zhǔn)的要求。雖然 FDA 的食品安全和應(yīng)用營(yíng)養(yǎng)中心和美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）等管理食品安全的聯(lián)邦機(jī)構(gòu)的確擁有評(píng)估食品檢測(cè)方法的內(nèi)在程序，單對(duì)有關(guān)這類檢測(cè)方法的認(rèn)證卻大多來(lái)自外部的獨(dú)立機(jī)構(gòu)。目前已有許多國(guó)內(nèi)和國(guó)際組織可以對(duì)食品檢測(cè)方法進(jìn)行認(rèn)證。在美國(guó)，主要機(jī)構(gòu)是 AOAC，通過(guò) AOAC 認(rèn)證的方法一般都被視為是“權(quán)威或標(biāo)準(zhǔn)”

14、的方法。2.1 國(guó)外主要食品微生物檢測(cè)體系（1）國(guó)際食品法典委員會(huì)（CAC）（2）國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（ICMSF）（3）國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)（4）美國(guó)食品藥品監(jiān)督局（FDA）（5）美國(guó)官方分析化學(xué)師協(xié)會(huì)(AOAC)（6）美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）（7）加拿大健康署(HPB)（8）美國(guó)公共衛(wèi)生協(xié)會(huì)(APHA)（9）北歐食品分析委員會(huì)（NMKL）（10）法國(guó)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(AFNOR)標(biāo)準(zhǔn)（11）英國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(BS)（12）日本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(JIS)（13）韓國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（KS）等2.2 國(guó)內(nèi)主要食品微生物檢測(cè)體系（1）國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB)（2）檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN)、檢驗(yàn)檢疫行業(yè)推薦標(biāo)準(zhǔn)（SN/T）（3

15、）衛(wèi)生行標(biāo)(WS) （4）農(nóng)業(yè)行標(biāo)(NY) 等2.3 常見食源性致病菌檢測(cè)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)菌參照標(biāo)準(zhǔn)備注大腸埃希氏菌O157：H7（1）GBT 4789.36-2008 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌O157：H7NM檢驗(yàn)（2）GBT 22429-2008 食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗(yàn) 酶聯(lián)免疫法（3）SNT 1869-2007 食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法 PCR法培養(yǎng)法，酶聯(lián)免疫法、PCR法沙門氏菌（1）GB 4789.4-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)（2）GBT 22429-2008 食品中沙門氏菌、腸出血性

16、大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗(yàn) 酶聯(lián)免疫法（3）SNT 1869-2007 食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法 PCR法培養(yǎng)法，酶聯(lián)免疫法、PCR法志賀氏菌（1）GB 4789.5-2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 志賀氏菌檢驗(yàn)（2）SNT 1869-2007 食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法 PCR法培養(yǎng)法，酶聯(lián)免疫法、PCR法副溶血性弧菌（1）GBT 4789.7-2008 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)副溶血性弧菌檢驗(yàn)（2）SNT 1869-2007 食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法 PCR法培養(yǎng)法，酶聯(lián)免疫法、PCR法金黃色葡萄球菌（1）GB 4789.10-2010

17、食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)（2）SNT 1869-2007 食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法 PCR法培養(yǎng)法，酶聯(lián)免疫法、PCR法單增生李斯特氏菌（1）GB 4789.30-2010 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)（2）GBT 22429-2008 食品中沙門氏菌、腸出血性大腸埃希氏菌O157及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的快速篩選檢驗(yàn) 酶聯(lián)免疫法（3）SNT 1869-2007 食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法 PCR法培養(yǎng)法，酶聯(lián)免疫法、PCR法空腸彎曲菌（1）GBT 4789.9-2008 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)空腸彎曲菌檢驗(yàn)（2）SNT 186

18、9-2007 食品中多種致病菌快速檢測(cè)方法 PCR法培養(yǎng)法，酶聯(lián)免疫法、PCR法2.4 國(guó)標(biāo)中致病菌常規(guī)檢測(cè)方法流程致病菌常規(guī)檢驗(yàn)方法大致是：食品標(biāo)本或臨床標(biāo)本單個(gè)可疑菌落選擇性分離培養(yǎng)（過(guò)夜）選擇性增菌（過(guò)夜）細(xì)菌生化鑒定（23天） 純培養(yǎng)（過(guò)夜）檢驗(yàn)報(bào)告血清凝集試驗(yàn) 微生物生化反應(yīng)是指用化學(xué)反應(yīng)來(lái)測(cè)定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應(yīng)常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物。因此微生物生化反應(yīng)是微生物分類鑒定中的重要依據(jù)之一。微生物檢驗(yàn)中常用的生化反應(yīng)有：糖酵解試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn) 、靛基質(zhì)試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、三糖鐵瓊

19、脂試驗(yàn)、硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力瓊脂試驗(yàn)。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的方法固然是最穩(wěn)定最成熟的方法，但因其復(fù)雜費(fèi)時(shí)，當(dāng)某種致病菌的檢測(cè)需要快速出具結(jié)果時(shí)，國(guó)標(biāo)方法的弊端就會(huì)顯現(xiàn)出來(lái)。為此，人們?cè)趥鹘y(tǒng)的鑒定方法的基礎(chǔ)上，不斷地嘗試研制和改進(jìn)檢測(cè)設(shè)備，研究和創(chuàng)新檢測(cè)技術(shù)，以求快速準(zhǔn)確地檢測(cè)食品中的微生物含量。3 微生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀隨著食品、藥品、化妝品等工業(yè)和醫(yī)學(xué)診斷等對(duì)微生物的控制和檢驗(yàn)要求越來(lái)越嚴(yán)格，近年來(lái)出現(xiàn)了不少快速檢測(cè)的方法及相應(yīng)的自動(dòng)化儀器，以達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量的實(shí)時(shí)控制，縮短生產(chǎn)和發(fā)貨的遲滯時(shí)間，優(yōu)化庫(kù)存管理等目的。3.1 常規(guī)微生物快速檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀傳統(tǒng)計(jì)數(shù)改良法（1）紙片法：培養(yǎng)基固體在載體上。省去制

20、作培養(yǎng)基的時(shí)間。1>原理試紙片將選擇性培養(yǎng)基和吸水凝膠進(jìn)行組合，二片塑料膜構(gòu)成，上薄為蓋，下厚為培養(yǎng)基。2>操作方法：檢樣稀釋取1ml滴于下膜正中央蓋上膜擴(kuò)展器壓成20cm2圓圈 37培養(yǎng)24h 計(jì)數(shù)(顯色的斑點(diǎn))3>優(yōu)點(diǎn)：（1）可節(jié)約玻璃儀器、培養(yǎng)基；（2）可節(jié)省培養(yǎng)基等試劑的配置滅菌和玻璃儀器滅菌和清洗的時(shí)間、人力和費(fèi)用；（3）因?yàn)橛酗@色劑和小方格，計(jì)數(shù)方便；（4）節(jié)約稀釋的繁瑣動(dòng)作；（5）可快速測(cè)試致病菌，節(jié)省大量的實(shí)驗(yàn)步驟；4>缺點(diǎn)（1）成本比傳統(tǒng)方法要稍高些；（2）測(cè)試細(xì)菌總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌時(shí)不能節(jié)約培養(yǎng)時(shí)間；（3）大腸菌群紙片存在與MPN法無(wú)法對(duì)應(yīng)

21、的問題，金黃色葡萄球菌紙片存在取樣量太低的問題。目前僅細(xì)菌總數(shù)紙片有一些用戶。5>代表廠家3M、美國(guó)IDEXX、綠洲生化、北京陸橋、廣東環(huán)凱等；（2）螺旋平板計(jì)數(shù)法：螺旋接種儀菌落計(jì)數(shù)1>原理自動(dòng)旋轉(zhuǎn)平板技術(shù)是在瓊脂培養(yǎng)基表面倒一薄層樣品，該儀器可使液體樣品以螺旋轉(zhuǎn)動(dòng)方式分布。液體慢速流出后。隨著平板的旋轉(zhuǎn)從中心向邊緣分布，樣品分布非常均勻。這種方法可廣泛用于細(xì)菌、酵母、霉菌及乳類樣品中。樣品倒入平板后，菌落數(shù)可以用激光菌落計(jì)數(shù)器來(lái)計(jì)數(shù)，即將光檢測(cè)儀放置在儀器的底部，激光儀從上面自動(dòng)掃描平板，當(dāng)激光束通過(guò)菌落時(shí)，可以降低光的強(qiáng)度，從而檢測(cè)出菌落的存在。2>優(yōu)點(diǎn)與傳統(tǒng)方法相比，

22、無(wú)需稀釋梯度，每個(gè)梯度倒2個(gè)平板，節(jié)省了大量人力物力。3>缺點(diǎn)（1）檢測(cè)時(shí)間并沒有縮短，菌落總數(shù)仍需要培養(yǎng)48小時(shí)；（2）需要配合自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，否則人工計(jì)數(shù)更麻煩。4>代表廠家英國(guó)DWS（WASP2螺旋接種儀），杭州迅數(shù)（全自動(dòng)菌落技術(shù)儀）（3）濾膜法：常用于一些可過(guò)濾樣品的檢測(cè)1>原理濾膜法常用于可過(guò)濾樣品的微生物檢測(cè)。是將樣品通過(guò)一定孔徑的濾膜,使微生物截留在濾膜上,再進(jìn)行培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。2>優(yōu)點(diǎn)靈敏度增大，菌落無(wú)擴(kuò)散情況，便于計(jì)數(shù)。3>缺點(diǎn)需要額外的支出購(gòu)買真空泵，多聯(lián)支架及一次性濾膜；如果抽濾過(guò)程空氣潔凈度不夠，有可能造成二次污染，尤其是對(duì)菌數(shù)要求特別嚴(yán)格的

23、產(chǎn)品，如啤酒，澄清果汁，桶裝飲用水等。4>代表廠家德國(guó)密理博、賽多利斯、國(guó)內(nèi)（天津恒奧、天津奧特賽恩斯、杭州泰林）多為高仿進(jìn)口產(chǎn)品3.2 常規(guī)微生物快速檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀快速檢測(cè)微生物數(shù)量的新方法3.2.1 ATP生物熒光法1>原理所有的生物體中都含有能夠傳達(dá)能量的ATP，檢驗(yàn)ATP就可知道細(xì)菌數(shù)量及活性。而在微生物中，所含ATP量很少。如在熒光素酶、熒光物質(zhì)與氧及鎂離子存在的條件下，其光量與樣品中ATP量成正比，憑此光量來(lái)檢驗(yàn)食品中的微生物量。2>優(yōu)點(diǎn)通常用于進(jìn)行商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)?？纱蟠罂s短庫(kù)存時(shí)間，減少物流壓力和成本。3>缺點(diǎn)（1）ATP方法需要消耗大量的較昂貴的試劑，對(duì)儀器

24、的清洗保養(yǎng)要求特別高；（2）客戶通常懷疑假陰性的可能，特別是用ATP單個(gè)檢測(cè)代替常規(guī)微生物和致病微生物檢測(cè)，其風(fēng)險(xiǎn)是一定存在的。(如保溫增菌時(shí)間不夠，菌數(shù)未達(dá)到一定數(shù)量，取樣量太小，由于培養(yǎng)基原因，目標(biāo)致病菌未大量增菌等原因)4>代表廠家美國(guó)CHARM（Lum-T ATP衛(wèi)生檢測(cè)儀、）、美國(guó)Hygiena（System SURE Plus ATP熒光儀）、3M（Clean-Trace ATP熒光檢測(cè)儀）、美國(guó)BioControl（ATP熒光檢測(cè)儀）、德國(guó)Millipore（MicroStar快速微生物檢驗(yàn)系統(tǒng)）、沈陽(yáng)中科靚馬；3.2.2 檢測(cè)微生物產(chǎn)生的CO2量的方法1>原理由于二

25、氧化碳(CO2)是微生物生長(zhǎng)過(guò)程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，因而通過(guò)檢測(cè)CO2濃度的變化可以判定微生物的生長(zhǎng)狀況。在此基礎(chǔ)上，結(jié)合染色技術(shù)、新的光源和光傳感器等技術(shù)，來(lái)檢測(cè)微生物生長(zhǎng)過(guò)程中所釋放的CO2來(lái)達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)微生物的目的。2>代表廠家美國(guó)Biolumix（實(shí)時(shí)快速微生物檢測(cè)系統(tǒng)）、法國(guó)梅里埃（BacT/Alert微生物檢測(cè)系統(tǒng)）3.2.3 電化學(xué)方法（電導(dǎo)率法或電阻抗法）1>原理當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖時(shí)，將蛋白質(zhì)、糖類等大分子物質(zhì)分解成氨基酸、有機(jī)酸等帶電荷的小分子物質(zhì)，改變培養(yǎng)液的導(dǎo)電度。這樣，測(cè)量電阻和導(dǎo)電度的變化，就可推算出樣品原來(lái)的含菌數(shù)。2>代表廠家奧地利Sylab（Bac

26、trac4300自動(dòng)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)）、英國(guó)DWS（Rabit自動(dòng)微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)）、法國(guó)梅里埃（Bactometer微生物檢測(cè)系統(tǒng)）3.2.4 顏色變化1>原理微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，培養(yǎng)基中加入因pH值變化而變色的指示劑，由光學(xué)檢測(cè)器檢測(cè)指示劑的顏色變化，記錄達(dá)到突變點(diǎn)的時(shí)間。2>代表廠家美國(guó)Foss（MicroFoss微生物自動(dòng)監(jiān)測(cè)儀-原產(chǎn)商是美國(guó)biosys公司)，此儀器原理與上述的電化學(xué)方法相似，每種樣品都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線。最致使的弱點(diǎn)是培養(yǎng)基必須從國(guó)外進(jìn)口，需要購(gòu)買原廠的預(yù)裝培養(yǎng)基，一個(gè)檢測(cè)成本高達(dá)20元以上，應(yīng)用范圍受限制，成本高昂。因此在我國(guó)目前還沒有

27、用戶。3.2.5 流式細(xì)胞技術(shù)1>原理流式細(xì)胞技術(shù)是一種以光學(xué)為基礎(chǔ)的在復(fù)雜的基質(zhì)中分析單個(gè)細(xì)胞的方法。懸浮在液體中的微生物通過(guò)激光束，光被散射并被微生物吸收，散射的寬度和自然特性作為微生物的固有特性，可以利用透鏡和光電元件收集散射光，進(jìn)而評(píng)估微生物的數(shù)量、大小和性狀。2>代表廠家美國(guó)Foss（Bactoscan FC牛奶中總菌數(shù)快速檢測(cè)儀）、法國(guó)AES（Bactiflow流式細(xì)胞分析儀）及美國(guó)Chemunex（ScanRDI和D-count微生物快速檢測(cè)儀）。Bactoscan FC采用核酸熒光標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀，所以檢測(cè)的是死菌和活菌，死活細(xì)胞一起檢測(cè)，消耗成本較高，儀器比較難

28、保養(yǎng)，靈敏度不夠高。適合牛奶企業(yè)檢測(cè)原奶中細(xì)菌總數(shù)，檢測(cè)原奶曾經(jīng)被多少菌污染過(guò)；法國(guó)AES、美國(guó)Chemunex公司采用的是活細(xì)胞熒光探針技術(shù)，活細(xì)胞經(jīng)標(biāo)記后上流式細(xì)胞儀被檢出，檢測(cè)的是活細(xì)胞，與國(guó)標(biāo)的要求吻合，但比國(guó)標(biāo)嚴(yán)格，此方法可以檢測(cè)嗜冷菌、嗜溫菌和嗜熱菌，而國(guó)標(biāo)法通常只檢測(cè)嗜溫需氧菌。是目前國(guó)際上正在認(rèn)可的生物熒光定量檢測(cè)微生物數(shù)量的兩種方法之一。另一種是Millipore的MicroStar（基于ATP檢測(cè)原理）。3.2.6 熱量法1>原理測(cè)定培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的微量熱量，從而求得微生物量。2>代表廠家無(wú)商品化儀器3.2.7 放射測(cè)量法1>原理在放射性培養(yǎng)基中檢測(cè)對(duì)放射

29、性底物的吸收。2>代表廠家無(wú)商品化儀器3.3食源性致病菌快速檢測(cè)方法3.3.1 顯色培養(yǎng)基法檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較快，結(jié)果準(zhǔn)確，技術(shù)成熟，產(chǎn)品很多。1>原理在培養(yǎng)基中分別加入某種特定的無(wú)色合成底物，經(jīng)微生物特異性酶的作用而釋放出色原，呈各種顏色或熒光。2>優(yōu)點(diǎn)（1）快速、簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間-大多數(shù)顯色培養(yǎng)基只需在樣品增菌后，分離培養(yǎng)18-24h，即可根據(jù)菌落的顏色作出初步的鑒定。（陰性-棄去；陽(yáng)性-進(jìn)一步鑒定）。（2）結(jié)果直觀，一目了然（根據(jù)顏色判定結(jié)果）；（3）靈敏度高、特異性強(qiáng)，大大減少了后續(xù)的鑒定步驟（確證試驗(yàn)）；3>缺點(diǎn)存在一定的假陽(yáng)性和假陰：97%的大腸埃希氏菌含有-葡萄

30、糖苷酶，約10%的沙門氏菌屬中也含有此酶；不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培養(yǎng)基中陽(yáng)性反應(yīng)。提示：這是任何選擇性培養(yǎng)基都無(wú)法避免的問題。與普通選擇性培養(yǎng)基比較，顯色培養(yǎng)基的假陽(yáng)性、假陰性的機(jī)率相對(duì)要低得多。4>代表廠家法國(guó)科瑪嘉、Thermo Fisher、北京陸橋、廣東環(huán)凱、北京奧博星等。3.3.2 免疫學(xué)方法免疫學(xué)方法的基本原理是抗原和抗體的特異性反應(yīng)?？贵w技術(shù)比較易于自動(dòng)化和降低成本。為了檢測(cè)特異性微生物和微生物毒素，越來(lái)越多的抗體被應(yīng)用于各種類型的免疫學(xué)反應(yīng)。3.3.2.1 酶聯(lián)免疫法（ELISA)1>原理酶聯(lián)免疫法是一種固相免疫分析方法，它是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特

31、異性和酶的高效催化作用有機(jī)的結(jié)合起來(lái)的一種檢測(cè)技術(shù)，它既可以測(cè)抗原，也可以可抗體。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。 ELISA最常用的固相載體為微孔板，但其

32、他一些固相載體如試管、微孔濾膜等也在不同的ELISA中得以使用。ELISA對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)靈敏度為104-105CFU/ml,對(duì)毒素或蛋白質(zhì)為ng/ml或是更低，所以在檢測(cè)之前必須進(jìn)行增菌培養(yǎng)或萃取。有些ELISA方法經(jīng)過(guò)信號(hào)放大等改進(jìn)后提高了靈敏度，如酶聯(lián)熒光（ELFA）技術(shù)，經(jīng)改進(jìn)后使用熒光底物來(lái)增強(qiáng)敏感性。增菌后，自動(dòng)化分析系統(tǒng)可在45分鐘內(nèi)完成一次酶免分析，而手工操作完成一次酶免分析一般需要幾個(gè)小時(shí)。又如酶聯(lián)凝集技術(shù)（ELISA ELCA），通過(guò)凝集放大來(lái)檢測(cè)結(jié)合后的抗原-抗體復(fù)合物。2>優(yōu)點(diǎn)（1）特異性強(qiáng)、靈敏度高；（2）檢測(cè)結(jié)果迅速準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，廣泛應(yīng)用于各種分析領(lǐng)域。3>

33、;缺點(diǎn)酶聯(lián)免疫的缺點(diǎn)在于對(duì)試劑的選擇性高，很難同時(shí)分析多種成分，且對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定的交叉反應(yīng)。4>代表廠家ELISA微生物檢測(cè)試劑盒一直由歐美幾家家大公司壟斷了全球95%以上的市場(chǎng)，如法國(guó)梅里埃、3M、, 美國(guó)Neogen、美國(guó)Biocontrol等。一個(gè)96孔試劑盒，售價(jià)高達(dá)5000-6000元，非常無(wú)奈，但是ELISA是國(guó)外最流行的快速篩選技術(shù)，檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)周期都比較理想，不過(guò)國(guó)內(nèi)現(xiàn)在有公司專業(yè)在做這方面的試劑盒了。梅里埃的mini VIDAS快速篩檢致病微生物的原理應(yīng)用酶聯(lián)熒光免疫法，最后測(cè)藍(lán)色熒光（ELFA）?？乖?xì)菌、蛋白）的檢測(cè)是應(yīng)用夾心的技術(shù)，包被針上有抗體包

34、被，所測(cè)得的熒光與標(biāo)本中抗原的含量成正比。3.3.2.2 免疫膠體金技術(shù)（GLISA）1>原理免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。當(dāng)抗原抗體反應(yīng)發(fā)生時(shí)，待檢測(cè)的抗原（抗體）就會(huì)吸附到膠體金顆粒表面形成包被而被膠體金標(biāo)記，顯色程度與抗原含量成正比，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中。膠體金檢測(cè)條在臨床診斷中廣泛使用。方法成熟，使用簡(jiǎn)便。2>優(yōu)點(diǎn)（1）檢測(cè)方法簡(jiǎn)單而快速，增菌后的檢測(cè)非常簡(jiǎn)單，約10分鐘一般能完成；（

35、2）不需儀器設(shè)備，操作人員不需特殊訓(xùn)練；（3）單一試劑，一步操作。小型實(shí)驗(yàn)室即有條件開發(fā)生產(chǎn)。3>缺點(diǎn)（1）一般只能用于定性試驗(yàn)。其定量檢測(cè)和靈敏度的提高還有賴于新原料和新材料的開發(fā)與應(yīng)用；（2）肉眼判讀存在誤差；（3）進(jìn)口的檢測(cè)條的價(jià)格比較高，通常要3090元。4>代表廠家膠體金微生物檢測(cè)條在國(guó)內(nèi)已經(jīng)有不少產(chǎn)品，但用戶并不多，主要是質(zhì)量不穩(wěn)定。外來(lái)的膠體金微生物檢測(cè)產(chǎn)品比較多。國(guó)外品牌：美國(guó)杜邦（沙門氏菌、李斯特、O157快速檢測(cè)試劑條）、美國(guó)Neogen（沙門氏菌和李斯特菌）；德國(guó)r-biopharm（沙門氏菌和李斯特菌）；國(guó)內(nèi)廠家：上?？祆`（沙門氏菌）3.3.2.3 免疫磁分

36、離技術(shù)（IMS）免疫磁性分離技術(shù)是將特異性抗體偶聯(lián)在磁性顆粒表面，與樣品中被檢致病菌發(fā)生特異性的結(jié)合，載有致病菌的磁性顆粒在外加磁場(chǎng)的作用下，向磁極方向聚集，棄去檢樣混合液，使致病菌不斷得到分離、濃縮。IMS的原理類似于選擇性培養(yǎng)基，即只允許目標(biāo)菌生長(zhǎng)，而其他細(xì)菌的生長(zhǎng)受到抑制。但兩者的不同之處在于選擇性增菌培養(yǎng)基需要添加化學(xué)劑或抗生素來(lái)選擇病原菌，而IMS采用抗體對(duì)細(xì)菌進(jìn)行有選擇的捕獲。由于試劑本身帶有一定的刺激性，因此可能對(duì)細(xì)胞造成損害，IMS對(duì)目標(biāo)菌而言則較為溫和；同時(shí)，選擇性增菌步驟的減少也縮短了樣品分析的時(shí)間。IMS已經(jīng)被用于李斯特菌屬、O157：H7、沙門氏菌屬以及其他來(lái)自于食品、

37、環(huán)境和臨床標(biāo)本中的病原菌的選擇。如美國(guó)ABI公司的BeadRetriever全自動(dòng)微生物磁珠分選平臺(tái)。3.3.2.4 乳膠凝集（LA）最簡(jiǎn)單的抗體檢測(cè)方法是乳膠凝集（LA）。在乳膠凝集實(shí)驗(yàn)中，采用包被有抗體的彩色乳膠顆粒當(dāng)與目標(biāo)菌菌懸液混合后，如果懸液中有特異性抗原存在，就可以形成肉眼可見的凝集或沉淀。雖然凝集反應(yīng)簡(jiǎn)便迅速，但靈敏度不高，反應(yīng)約需要107CFU。但即便如此，它的靈敏度也比傳統(tǒng)的血凝或細(xì)胞凝集試驗(yàn)提高了10-100倍。目前也有比較多的廠家在做此類產(chǎn)品用于致病菌的初篩，國(guó)外廠家：美國(guó)BD、美國(guó)Microgen；國(guó)內(nèi)廠家：廣州健侖、廣東環(huán)凱。3.3.3分子生物學(xué)檢測(cè)方法 3.3.3.1 PCR技術(shù)聚合酶鏈反應(yīng)(P