生化藥物和基因工程藥物分析概念

1、第十三章 生化藥物和基因工程藥物分析概念第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 生物藥物（生物藥物（biopharmaceuticsbiopharmaceutics或或biopharmaceuticalsbiopharmaceuticals）是利用生物體、生）是利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運用生物學、物組織或器官等成分，綜合運用生物學、生物化學等學科的原理與方法制得的天然生物化學等學科的原理與方法制得的天然生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天生物活性物質(zhì)以及人工合成或半合成的天然物質(zhì)類似物。然物質(zhì)類似物。 生物藥物主要包括生化藥物生物藥物主要包括生化藥物（biochemical drugsbioch

2、emical drugs）、生物技術藥物）、生物技術藥物（bio-technology drugs)bio-technology drugs)和生物制品和生物制品（biological products)biological products)等。等。 生化藥物是從動物、植物及微生生化藥物是從動物、植物及微生物等生物體分離純化制得的生化基本物等生物體分離純化制得的生化基本物質(zhì)，以及用化學合成、微生物合成物質(zhì)，以及用化學合成、微生物合成或現(xiàn)代生物技術制得的生命基本物質(zhì)或現(xiàn)代生物技術制得的生命基本物質(zhì)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)及其衍生物、降解物以及大分子的結(jié)構(gòu)修飾物等，如氨基酸、多膚、蛋白構(gòu)

3、修飾物等，如氨基酸、多膚、蛋白質(zhì)、酶、多糖、脂質(zhì)、核昔酸類等。質(zhì)、酶、多糖、脂質(zhì)、核昔酸類等。 生物技術是利用生物體或其組生物技術是利用生物體或其組成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術體系，用現(xiàn)成部分發(fā)展產(chǎn)品的技術體系，用現(xiàn)代生物技術研制的藥物稱為生物技代生物技術研制的藥物稱為生物技術藥物（或生物工程藥物）。術藥物（或生物工程藥物）。 基因工程藥物（基因工程藥物（Genetic Genetic engineering drugsengineering drugs）：系指先確定）：系指先確定對某種疾病具有預防和治療作用的蛋對某種疾病具有預防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白合成過程的白質(zhì)，然后將控制該蛋白合成

4、過程的基因分離、純化或進行人工合成，利基因分離、純化或進行人工合成，利用重組用重組DNADNA技術加以改造，最后將該技術加以改造，最后將該基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細胞中基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細胞中不斷繁殖，并能進行大規(guī)模生產(chǎn)具有不斷繁殖，并能進行大規(guī)模生產(chǎn)具有預防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過預防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過這種方法生產(chǎn)的新型藥物稱為基因工這種方法生產(chǎn)的新型藥物稱為基因工程藥物。程藥物。 生物制品是應用普通的或以生物制品是應用普通的或以基因工程、細胞工程、蛋白質(zhì)工基因工程、細胞工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術獲得的程、發(fā)酵工程等生物技術獲得的微生物、細胞及各種動物和人源

5、微生物、細胞及各種動物和人源的組織和體液等生物材料制備，的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預防、治療和診斷用于人類疾病預防、治療和診斷的藥品。的藥品。一生化藥物和基因工程藥物的定義一生化藥物和基因工程藥物的定義 1.1.生化藥物生化藥物 2.2.基因工程藥物基因工程藥物二、生化藥物和基因工程藥物的種類二、生化藥物和基因工程藥物的種類（一）生化藥物的種類（一）生化藥物的種類1.1.氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類藥物：單氨基酸、多肽與蛋白質(zhì)類藥物：單氨基酸、氨基酸衍生物和復合氨基酸氨基酸、氨基酸衍生物和復合氨基酸類，消化道多肽、下丘腦多肽、腦多類，消化道多肽、下丘腦多肽、腦多肽、激肽等；動、植物蛋白

6、。肽、激肽等；動、植物蛋白。2.2.酶類與輔酶類藥物：蛋白水解酶類、酶類與輔酶類藥物：蛋白水解酶類、凝血酶及抗栓酶，輔酶凝血酶及抗栓酶，輔酶Q10Q10等。等。3.3.多糖類藥物多糖類藥物: :肝素、硫酸軟骨素肝素、硫酸軟骨素A A和和C;C;靈芝多糖、人參多糖、海藻靈芝多糖、人參多糖、海藻多糖、多糖等類肝素。多糖、多糖等類肝素。4.4.脂質(zhì)類藥物脂質(zhì)類藥物: :多價不飽和脂肪多價不飽和脂肪酸（酸（PUFAPUFA）、磷脂類、固醇類類）、磷脂類、固醇類類等。等。5.5.核酸及其降解物和衍生物類藥核酸及其降解物和衍生物類藥物物:RNA:RNA、DNADNA、多聚胞昔酸、琉、多聚胞昔酸、琉基聚胞昔

7、酸、基聚胞昔酸、ATPATP和和cAMPcAMP等。等。（二）基因工程藥物的種類（二）基因工程藥物的種類 基因工程基因工程DNADNA重組藥物主要成重組藥物主要成分為多膚或蛋白質(zhì)類，大致可分分為多膚或蛋白質(zhì)類，大致可分為以下三大類：為以下三大類： 1.1.激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：激素類及神經(jīng)遞質(zhì)類藥物：人生長激素釋放抑制因子（人生長激素釋放抑制因子（human human somatotin )somatotin )，人胰島素（，人胰島素（human human insulin)insulin)，人生長激素（，人生長激素（human human growth hormonegrowth hor

8、mone）2.2.細胞因子類藥物：人干擾素細胞因子類藥物：人干擾素（human interferonshuman interferons），人白細胞），人白細胞介素（介素（human interleukina)human interleukina)，集落，集落刺激因子（刺激因子（colony-stimulating colony-stimulating factorsfactors，CSF)CSF)，促紅細胞生成素，促紅細胞生成素（erythropoietinerythropoietin，EPOEPO）3.3.酶類及凝血因子類藥物：單克酶類及凝血因子類藥物：單克隆抗體、疫苗、基因治療藥物、隆抗

9、體、疫苗、基因治療藥物、白介素、生長因子、內(nèi)啡肽、反白介素、生長因子、內(nèi)啡肽、反義藥物、人生長激素、促紅細胞義藥物、人生長激素、促紅細胞生成素、腫瘤壞死因子等。生成素、腫瘤壞死因子等。三、生化藥物和基因工程藥物的特點 1.基因工程藥物具有細胞和組織特異性，形成受體一配體復合物；多數(shù)細胞因子具有多功能性，具有廣泛的藥理活性；細胞因子間存在復雜的相互作用，臨床使用有時需要幾種生長因子配合使用；具有低免疫活性。許多基因工程藥物是參與人體一些生理功能所必需的蛋白質(zhì)，極微量產(chǎn)生顯著的效應。2.2.分子量大分子量大 大部分為蛋白質(zhì)、多膚、大部分為蛋白質(zhì)、多膚、多糖、核酸類等大分子的化合物，有多糖、核酸類等

10、大分子的化合物，有的化學結(jié)構(gòu)不確定，分析時需進行純的化學結(jié)構(gòu)不確定，分析時需進行純度檢查和分子量的測定。對大分子的度檢查和分子量的測定。對大分子的藥物而言，即使組分相同，由于分子藥物而言，即使組分相同，由于分子量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。量不同而產(chǎn)生不同的生理活性。3.3.結(jié)構(gòu)確證難結(jié)構(gòu)確證難 4.4.全過程的質(zhì)量控制全過程的質(zhì)量控制 原材料、生原材料、生產(chǎn)過程和產(chǎn)品的質(zhì)量控制。產(chǎn)過程和產(chǎn)品的質(zhì)量控制。5.生物活性檢查 生物檢定法6.安全性檢查 例如熱原檢查、過敏試驗、異常毒性試驗、致突變試驗和生殖毒性試驗等。7.效價（含量）測定 通過理化分析進行含量測定，但酶類需進行效價測定或酶活力測定，以

11、表明其有效成分的生物活性。8.8.生化藥物和基因工程藥物生物活性質(zhì)量控生化藥物和基因工程藥物生物活性質(zhì)量控制特點。制特點。 生化藥物和甚因工程藥物生物活性質(zhì)量生化藥物和甚因工程藥物生物活性質(zhì)量控制對比控制對比生物測定生物測定 理化測定理化測定 傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)傳統(tǒng)工藝生產(chǎn) DNADNA重組技術生產(chǎn)重組技術生產(chǎn) 結(jié)構(gòu)不明、組分變異、結(jié)構(gòu)不明、組分變異、產(chǎn)品不純產(chǎn)品不純 結(jié)構(gòu)明確、組分單一、結(jié)構(gòu)明確、組分單一、產(chǎn)品高純產(chǎn)品高純 生物測定法檢測活性生物測定法檢測活性 上市前的生物活性檢測上市前的生物活性檢測 常規(guī)質(zhì)控常規(guī)質(zhì)控 生物測定生物測定 常規(guī)質(zhì)控常規(guī)質(zhì)控 理化測定理化測定 第二節(jié)質(zhì)量檢驗的基本程序

12、與方法第二節(jié)質(zhì)量檢驗的基本程序與方法一、鑒別試驗一、鑒別試驗（一）理化鑒別法（一）理化鑒別法 1.1.化學鑒別法化學鑒別法 利用藥物與某些利用藥物與某些試劑在一定條件下的呈色反應、沉試劑在一定條件下的呈色反應、沉淀反應等，生成具有顏色的產(chǎn)物或淀反應等，生成具有顏色的產(chǎn)物或沉淀進行鑒別。沉淀進行鑒別。2.2.紫外分光光度法紫外分光光度法 利用藥物利用藥物中的共扼系統(tǒng)在紫外區(qū)有特征中的共扼系統(tǒng)在紫外區(qū)有特征吸收用于鑒別。蛋白或多肽分吸收用于鑒別。蛋白或多肽分子的最大吸收波長是固定的。子的最大吸收波長是固定的。3.3.高效液相色譜法高效液相色譜法 利用對照品溶利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時

13、間和液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。凡有紫外肽圖譜的一致性進行鑒別。凡有紫外吸收的物質(zhì)均能在圖譜上顯示出來，吸收的物質(zhì)均能在圖譜上顯示出來，一般要求純度要達一般要求純度要達95%95%以上。肽圖分以上。肽圖分析、氨基酸成分和序列分析合并研究，析、氨基酸成分和序列分析合并研究，可作為蛋白質(zhì)等天然產(chǎn)品精密比較的可作為蛋白質(zhì)等天然產(chǎn)品精密比較的手段。手段。（二）生化鑒別法（二）生化鑒別法 酶法酶法 、電泳法、樣品脫鹽后、電泳法、樣品脫鹽后用等電點聚焦法測定用等電點聚焦法測定（三）生物鑒別法（三）生物鑒別法 利用生物體進行試驗來鑒別利用生物體進行試驗來鑒別藥物，家兔驚厥試驗藥物

14、，家兔驚厥試驗 二、雜質(zhì)檢查二、雜質(zhì)檢查（一）一般雜質(zhì)檢查（一）一般雜質(zhì)檢查（二）特殊雜質(zhì)檢查（二）特殊雜質(zhì)檢查 1.1.原料藥的純度分析原料藥的純度分析 多糖類，酶類藥物純度分析多糖類，酶類藥物純度分析 2.2.生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查生產(chǎn)過程中雜質(zhì)的檢查 基因基因工程藥物的生產(chǎn)過程更為復雜，質(zhì)工程藥物的生產(chǎn)過程更為復雜，質(zhì)量須全面控制。量須全面控制。三、安全性檢查三、安全性檢查（一）熱原檢查法和細菌內(nèi)毒素檢（一）熱原檢查法和細菌內(nèi)毒素檢查法查法（二）異常毒性試驗（二）異常毒性試驗 異常毒性試驗是用一定劑量的異常毒性試驗是用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑藥物按指定的操作方法和給藥途徑給

15、予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀給予規(guī)定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應。反應的判斷以察其急性毒性反應。反應的判斷以試驗動物死亡與否為終點。試驗動物死亡與否為終點。 是限度試驗是限度試驗（三）過敏試驗（三）過敏試驗 過敏試驗是檢查異性蛋白的試過敏試驗是檢查異性蛋白的試驗。驗。（四）降壓物質(zhì)試驗（四）降壓物質(zhì)試驗 降壓物質(zhì)試驗是指某些藥物中降壓物質(zhì)試驗是指某些藥物中含有的能導致血壓降低的雜質(zhì)，包含有的能導致血壓降低的雜質(zhì)，包括組胺、類組胺或其它導致血壓降括組胺、類組胺或其它導致血壓降低的物質(zhì)。中國藥典采用貓（或狗）低的物質(zhì)。中國藥典采用貓（或狗）血壓法檢查藥物中所含有的降壓物血壓法檢查藥物中所

16、含有的降壓物質(zhì)。質(zhì)。（五）無菌試驗（五）無菌試驗 無菌試驗是檢查藥品及敷料是否無菌試驗是檢查藥品及敷料是否染有活菌的一種方法。染有活菌的一種方法。（六）基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污（六）基因工程藥物中可能雜質(zhì)與污染物檢查染物檢查 基因工程藥物中可能的雜質(zhì)有殘基因工程藥物中可能的雜質(zhì)有殘留留DNADNA、宿主細胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、蛋、宿主細胞蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、蛋白質(zhì)突變體和蛋白質(zhì)裂解物等。主要白質(zhì)突變體和蛋白質(zhì)裂解物等。主要污染物有微生物、熱原和病毒等。主污染物有微生物、熱原和病毒等。主要檢查項目有外源性要檢查項目有外源性DNADNA、宿主細胞蛋、宿主細胞蛋白質(zhì)、其它有關雜質(zhì)和細菌內(nèi)毒素檢白質(zhì)、其它有

17、關雜質(zhì)和細菌內(nèi)毒素檢查。查。（七）致突變試驗（七）致突變試驗（八）生殖毒性試驗（八）生殖毒性試驗四、含量（效價）測定四、含量（效價）測定 生化藥物和基因工程藥物的含量生化藥物和基因工程藥物的含量表示方法通常有兩種，一種用百分含表示方法通常有兩種，一種用百分含量表示，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥量表示，適用于結(jié)構(gòu)明確的小分子藥物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。另物或經(jīng)水解后變成小分子的藥物。另一種用生物效價或酶活力單位表示，一種用生物效價或酶活力單位表示，適用于酶類和蛋白質(zhì)類等藥物的測定。適用于酶類和蛋白質(zhì)類等藥物的測定。（一）含量測定：（一）含量測定：HPLCHPLC法、十二烷基法、十二烷基硫酸鈉一聚

18、丙烯酞胺凝膠電泳法硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳法（SDS-PAGESDS-PAGE法）法）（二）效價測定（二）效價測定 效價測定均采用國際或國家參考效價測定均采用國際或國家參考品，或經(jīng)過國家檢定機構(gòu)認可的參考品，或經(jīng)過國家檢定機構(gòu)認可的參考品，以體內(nèi)或體外法（細胞法）測定品，以體內(nèi)或體外法（細胞法）測定其生物學活性，并標明其活性單位。其生物學活性，并標明其活性單位。一般用免疫學方法測定的效價不能代一般用免疫學方法測定的效價不能代替生物學效價，只能作為中間品的質(zhì)替生物學效價，只能作為中間品的質(zhì)量控制。在測定效價的同時，應測定量控制。在測定效價的同時，應測定蛋白質(zhì)含量，計算出特異比活性，活蛋白質(zhì)含量

19、，計算出特異比活性，活性以單位數(shù)毫克蛋白（性以單位數(shù)毫克蛋白（IU/mgIU/mg）表）表示。示。第三節(jié)常用定量分析方法及其應第三節(jié)常用定量分析方法及其應用用一、理化分析法一、理化分析法 包括化學分析包括化學分析法（重量法、滴定分析法）、電法（重量法、滴定分析法）、電化學分析法、光譜分析法（比色化學分析法、光譜分析法（比色法、紫外分光光度法、熒光分光法、紫外分光光度法、熒光分光光度法）和色譜法（高效液相色光度法）和色譜法（高效液相色譜法、灌注色譜法和高效毛細管譜法、灌注色譜法和高效毛細管電泳法）等。電泳法）等。（一）化學分析法（一）化學分析法 1.1.重量法根據(jù)樣品中分離出的重量法根據(jù)樣品中分

20、離出的單質(zhì)或化合物的重量測定所含成分單質(zhì)或化合物的重量測定所含成分的含量。根據(jù)被測組分分離方法的的含量。根據(jù)被測組分分離方法的不同，可分為提取法、揮發(fā)法和沉不同，可分為提取法、揮發(fā)法和沉淀法等。淀法等。 2.2.滴定分析法滴定分析法（二）電化學分析法（二）電化學分析法（三）光譜分析法（三）光譜分析法 比色法、紫外分光光度法、熒比色法、紫外分光光度法、熒光分光光度法光分光光度法（四）色譜分析法（四）色譜分析法 1.1.高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLCHPLC）具有在）具有在分離過程中不破壞樣品的特點，特別分離過程中不破壞樣品的特點，特別適合于對高沸點、大分子、強極性和適合于對高沸點、大分

21、子、強極性和熱穩(wěn)定性差的生化藥物的分析。熱穩(wěn)定性差的生化藥物的分析。 （1 1）反相高效液相色譜法（）反相高效液相色譜法（RP-RP-HPLCHPLC）固定相：）固定相：C C8 8、C C1818烷基硅烷鍵合烷基硅烷鍵合相流動相：甲醇、水或乙腈，紫外、相流動相：甲醇、水或乙腈，紫外、熒光檢測器。熒光檢測器。 (2) (2)高效離子交換色譜法高效離子交換色譜法（HPIEC )HPIEC )具有以下特點：具有以下特點： 1)1)根據(jù)相應的離子化程度對蛋根據(jù)相應的離子化程度對蛋白質(zhì)、多肽進行分離白質(zhì)、多肽進行分離 2)2)鹽濃度梯度洗脫法鹽濃度梯度洗脫法 3)3)柱效中等并具有較高質(zhì)量的柱效中等并

22、具有較高質(zhì)量的活性回收活性回收（3 3）高效凝膠過濾色譜法）高效凝膠過濾色譜法（HPGFCHPGFC） HPGFCHPGFC可用于多肽和蛋白質(zhì)可用于多肽和蛋白質(zhì)等生物藥物的分離及其分子量的等生物藥物的分離及其分子量的測定。測定。HPGFCHPGFC具有如下特點：具有如下特點： 1)1)活性蛋白質(zhì)可以回收活性蛋白質(zhì)可以回收 2)2)在固定比例的水溶液中進行的在固定比例的水溶液中進行的分離分離 3)3)是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中是根據(jù)蛋白質(zhì)或多肽在溶液中相應的有效粒徑而進行的分離。當?shù)跋鄳挠行Я蕉M行的分離。當?shù)鞍踪|(zhì)具有相同形狀（如球狀或纖維狀）白質(zhì)具有相同形狀（如球狀或纖維狀）時，通?？梢愿?/p>

23、據(jù)分子量來預示組分時，通常可以根據(jù)分子量來預示組分的洗脫順序，故可用來測定蛋白類藥的洗脫順序，故可用來測定蛋白類藥物的分子量。物的分子量。2.2.灌注色譜法灌注色譜法 1.1.基本理論基本理論 2.2.灌注色譜法主要用于基因工程灌注色譜法主要用于基因工程藥物和其它大分子藥物的分離純化和藥物和其它大分子藥物的分離純化和分析。分析。3.3.高效毛細管電泳法（高效毛細管電泳法（HPCEHPCE） 毛細管電泳法是根據(jù)帶電組分在毛細管電泳法是根據(jù)帶電組分在管中由于其所帶電荷和分子量的大小，管中由于其所帶電荷和分子量的大小，即荷質(zhì)比不同產(chǎn)生不同的遷移速度而即荷質(zhì)比不同產(chǎn)生不同的遷移速度而進行分離。進行分離

24、。二、酶法二、酶法 酶法包括兩種類型：酶法包括兩種類型：“酶活力酶活力測定法測定法”；“酶分析法酶分析法”。二者檢。二者檢測的對象雖有所不同，但原理和方測的對象雖有所不同，但原理和方法都是以酶能專一而高效地催化案法都是以酶能專一而高效地催化案些化學反應為基礎，通過對酶反應些化學反應為基礎，通過對酶反應速度的測定或生成物等濃度的測定速度的測定或生成物等濃度的測定而檢測相應物質(zhì)的含量。而檢測相應物質(zhì)的含量。（一）酶活力測定法（一）酶活力測定法 1.1.基本概念基本概念 所謂酶活力所謂酶活力是指酶催化一定化學反應的能力。是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力測定實質(zhì)上是測定一個被酶活力測定實質(zhì)上是測定

25、一個被酶所催化的化學反應速度。酶反酶所催化的化學反應速度。酶反應速度可以用單位時間反應底物應速度可以用單位時間反應底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示，酶的減少或產(chǎn)物的增加來表示，酶反應速度越快所表示的酶活力越反應速度越快所表示的酶活力越高。高。 國際理論化學和應用化學協(xié)會國際理論化學和應用化學協(xié)會（IUPACIUPAC）和國際生物化學協(xié)會）和國際生物化學協(xié)會（IBUIBU）推薦的）推薦的 酶單位定義：任何一種酶，系酶單位定義：任何一種酶，系指在指在2525以最適當?shù)牡孜餄舛?、最以最適當?shù)牡孜餄舛取⒆钸m當?shù)木彌_液離子強度以及最適當適當?shù)木彌_液離子強度以及最適當?shù)牡膒HpH等條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微等條

26、件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一微摩爾底物的酶量定為一個活性單位摩爾底物的酶量定為一個活性單位（國際單位，（國際單位，IUIU）。）。 酶活力測定可采用物理法、酶活力測定可采用物理法、化學法或酶分析法等。常用的方化學法或酶分析法等。常用的方法有終點法、動力學法或反應速法有終點法、動力學法或反應速率法。率法。2.2.酶促反應的條件及影響因素酶促反應的條件及影響因素 選擇反應條件的基本要求是選擇反應條件的基本要求是所有待測定的酶分子都應該正常所有待測定的酶分子都應該正常地發(fā)揮其作用。確定反應條件時地發(fā)揮其作用。確定反應條件時應考慮底物濃度、應考慮底物濃度、pHpH、溫度、輔、溫度、輔助因子、空白和對照試驗等因素，助因子、空白和對照試驗等因素，使其都處于最適于酶發(fā)揮催化作使其都處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平。用的水平。 3. 3.測定方法測定方法 測定方法有取樣測定和連續(xù)測測定方法有取樣測定和連續(xù)測定法。定法。 檢測方法：常用的有紫外一可檢測方法：常用的有紫外一可見分光光度法和熒光分光光度法、見分光光度法和熒光分光光度法、旋光度法、酶偶聯(lián)測定法。旋光度法、酶偶聯(lián)測定法。（二）酶分析法（二）酶