心臟毒素致小鼠肌損傷的組織形態(tài)學觀察

1、心臟毒素致小鼠肌損傷的組織形態(tài)學觀察【摘要】 目的建立由心臟毒素所致的小鼠肌損傷模型并對其進行形態(tài)學觀察,為進一步研究肌肉變性疾病的發(fā)病機制和治療方法提供參考依據(jù)。方法取C57小鼠12只，隨機分為6組，將心臟毒素按5g/只局部注入C57小鼠股四頭肌中,于注射后1、4天和1、2、4、6周處死小鼠，分離股四頭肌，取材行HE染色。結果注射1天后可見肌細胞變性壞死;1周后壞死加重，出現(xiàn)空泡，吞噬細胞包裹;2周后肌細胞變性壞死加重;4周后變性壞死鈣化依然存在,但已可見部分肌纖維再生;6周后變性壞死已不明顯,鈣化仍存在,肌細胞部分再生。結論成功地建立了心臟毒素所致的肌損傷模型，為研究肌肉變性疾病提供了理論

2、基礎。 【關鍵詞】 心臟毒素;肌損傷骨骼肌占成人體重的40%50%。研究肌損傷的物質(zhì)基礎是建立一種穩(wěn)定簡便的肌損傷模型。過去認為，造成肌肉組織損傷 包括機械性、物理性和化學性肌損傷等。由于這些方法不容易控制、相對復雜和重復性差而難以達到試驗要求。進行性肌營養(yǎng)不良(DMD)是一種X-連鎖隱性遺傳性肌病，起病始于兒童早期，四肢近端無力及萎縮。病人在后期直至死亡的時期內(nèi)主要是股四頭肌、眼外肌和膈肌受累。建立眼外肌與膈肌損傷模型相對比較困難，而且需要考慮的因素很多，股四頭肌損傷模型比較簡便且容易控制。為此筆者做以下實驗。1實驗材料心臟毒素(Sigma),無菌剪刀，75%酒精，甲醛溶液，二甲苯等。2實驗

3、動物46周齡清潔級C57BL/6小鼠(1517g)，雄性，由中國科學院上海實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于四川大學華西醫(yī)學中心公共衛(wèi)生學院IVC動物室并帶有空氣過濾裝置和置于層流柜內(nèi)的塑料籠內(nèi)?；\具、墊料、飼料、飲水均高壓消毒，飲水中加入抗生素：苯唑西林鈉1g/L，鹽酸環(huán)丙沙星0.25g/L，慶大霉素8萬單位。參照文獻1，2，選取C57小鼠，46周齡，稱重，3實驗方法股四頭肌處鼠毛75%酒精皮膚消毒，隨機分為6組，16組左側股四頭肌局部注射心臟毒素5g/只，右側為對照，分別在注射后1天，4天、1周、2周、4周、6周頸椎脫臼處死小鼠，完整分離出股四頭肌,去除筋膜、脂肪、神經(jīng)等。浸入4%甲醛溶液中固定，常

4、規(guī)病理包埋切片染色。4結果HE染色觀察肌肉損傷的病理變化。正常肌纖維在光鏡下呈細長形，肌細胞核為扁橢圓形，每個肌纖維有許多細胞核，位于肌纖維的周邊，緊靠肌膜的內(nèi)表面(圖1)。注射心臟毒素后1天可見肌細胞變性壞死，細胞溶解，肌細胞核聚集(圖2-A);4天后肌纖維發(fā)生明顯斷裂，肌細胞變細、變小，變性壞死加重，脂肪化、纖維化明顯;1周后壞死嚴重，出現(xiàn)空泡，網(wǎng)狀，吞噬細胞包裹并出現(xiàn)鈣化，肌細胞胞體部分形成網(wǎng)狀結構(圖2-B);2周后可見肌細胞壞死加重達到頂峰，可見嗜堿性組織，巨噬細胞包裹吞噬壞死的肌細胞(圖2-C);4周后變性壞死鈣化依然存在，但已可見部分肌纖維再生(圖2-D);6周后變性壞死已不明顯

5、，鈣化仍存在，肌細胞部分再生(圖2-E)。與張勇等3的結果基本符合。5討論肌損傷研究的基礎是建立一種穩(wěn)定簡便的肌損傷模型。造成肌肉組織損傷方法有多種，包括機械、物理和化學損傷等，但這些方法不容易控制，相對復雜，重復性差，難以達到實驗要求。心臟毒素是從眼鏡蛇毒腺中提取的一種毒素，文獻報道注入小鼠骨骼肌后30 min 即可引起肌肉組織的壞死，光鏡下可見損傷區(qū)域肌膜斷裂，肌纖維攣縮，電鏡下可見線粒體損害等病理改變，這是其造成肌膜和肌纖維的快速溶解所致。24h后可見肌細胞胞漿中出現(xiàn)“空袋”，僅包含有殘存的肌纖維和腫脹的線粒體。心臟毒素致使肌肉組織損傷的機制是使骨骼肌發(fā)生壞死，誘導毛細血管通透性增加和組

6、胺的釋放。心臟毒素致肌肉損傷模型的優(yōu)點：穩(wěn)定、簡便、易控制且重復性好;它克服了單純的機械性或者物理性損傷模型難以控制且重復性不好的缺點。本實驗在注射心臟毒素后的不同時間后，進行的組織學分析結果，與文獻35報道基本一致。肌肉在損傷后經(jīng)歷了變性、瘢痕形成、損傷修復再生的過程。通過組織形態(tài)學的觀察，為進一步認識肌肉再生的分子機制，以及在肌肉生長過程中，某些外源性因素對肌肉中某些蛋白質(zhì)表達的影響，為進一步研究某些肌肉變性疾病如進行性肌營養(yǎng)不良(DMD)的分子機制提供參考依據(jù)。(本文彩圖見封三)【參考文獻】 1Andres V, Walsh K. Myogenin expression, cell cy

7、cle withdrawal, and phenotypic ifferentiation are temporally separable events that precede cell fusion upon myogenesis. J Cell Biol,1996, 132(4):657-666.2Ownby CL, Fletcher JE, Colberg TR. Cardiotoxin 1 from cobra (Naja naja atra) venom causes necrosis of skeletal muscle in vivo. Toxicon 1993, 31(6)

8、:697-709.3張勇,鄒仲敏,郭朝華,等. 肌損傷的形態(tài)學觀察.第三軍醫(yī)大學學報,2003, 25(14):1302-1304.4Fletcher J E, Hubert M, Wieland SJ, et al. Similarities and differences in mechanisms of cardiotoxins, melittin and other myotoxins. Toxicon,1996, 34(11-12):1301-1313.5Letcher JE, Tripolitis L, Beech J. Species difference in modulation of calcium release by Naja naja kaouth