過程分子生物學(xué)課件

1、過程分子生物學(xué)張 惠 展分子生物學(xué)是生命科學(xué)的主導(dǎo)性學(xué)科基因的表達(dá)與調(diào)控是分子生物學(xué)的主題思想過程分子生物學(xué)是分子生物學(xué)理論發(fā)展的高級階段1953-1983 基礎(chǔ)分子生物學(xué)階段20世紀(jì)50年代 DNA雙螺旋模型的建立20世紀(jì)60年代 遺傳密碼的破譯20世紀(jì)70年代 DNA重組技術(shù)的誕生1983-？ 過程分子生物學(xué)階段20世紀(jì)80年代 動植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的問世20世紀(jì)90年代 人類基因組計劃的實(shí)施21世紀(jì)00年代 RNA干擾現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)過程分子生物學(xué)523416基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制細(xì)胞通訊的分子機(jī)制免疫多樣性的分子識別胚胎發(fā)育的基因表達(dá)譜腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制基因組學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制BCDA

2、EF原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān)真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用原核生物的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)控真核生物的RNA剪切調(diào)控原核生物反義RNA的調(diào)控真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾G真核生物應(yīng)答元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控1A 原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān) 通過對100多個大腸桿菌啟動子的序列分析，結(jié)果表明：大多數(shù)具有普通生理生化功能的基因所屬的啟動子，具有統(tǒng)一的特征序列。a 大腸桿菌啟動子的多樣性TTGACAAACTGTTATAATATATTA16 - 10 bp5 - 9 bp結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-35區(qū) T82T84G78A65C54A45-10區(qū) T80A95T45A60A50T96啟動子一個典型的大腸桿菌啟動子通常包

3、括下列四個結(jié)構(gòu)要素： 1A 原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān) 絕大多數(shù)原核生物的RNA聚合酶均由五個亞基組成：a a2 2bbbbs s（全酶），其中a a2 2bbbb稱為（核心酶）。各種原核細(xì)菌的a a、b b、b b亞基呈高度的同源性，唯獨(dú)s s因子差別較大。RNA聚合酶核心酶對DNA鏈具有非特異性的親和力（堿性蛋白與酸性DNA之間的靜電引力），但s s因子增強(qiáng)了RNA聚合酶與啟動子區(qū)域的特異性結(jié)合。s s因子幫助RNAa 大腸桿菌啟動子的多樣性聚合酶識別啟動子，同時啟動轉(zhuǎn)錄。大腸桿菌啟動子與s s因子的對應(yīng)關(guān)系 （Lewins GENES X 2010）氨基酸-35區(qū)序列識別數(shù)間隔區(qū)-10區(qū)

4、序列因子/基因TTGACATATAAT100016-18 bp613s 70（rpoD）CTGGNATTGCA56 bp477s 54（rpoN）CCCTTGAACCCGATNT3013-15 bp284s 32（rpoH）TTGACATATAAT10016-18 bp330s S（rpoS）CTAAAGCCGATAA4015 bp239s F（rpoF）GAAYCTGA2016 bp202s E（rpoE）2173s FecI（fecI）TGNCTGCGTCTT15 bp1A 原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān) 枯草桿菌中存在著大約二十類不同的啟動子，其中有些隸屬于正常的生理代謝基因，有些則隸屬于噬

5、菌體感染、孢子生成、次級代謝過程中的相關(guān)基因。 b 枯草桿菌啟動子的多樣性在SPO1噬菌體感染過程中的RNA聚合酶及其s因子 SPO1噬菌體感染枯草桿菌后，早期基因表達(dá)；4-5分鐘后，中期基因表達(dá)，早期基因關(guān)閉；8-12分鐘后，晚期基因表達(dá)，中期基因關(guān)閉。早期基因的啟動子由s s43（即s sA）識別啟動，這是枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)具有廣泛生理生化功能的s s因子，與大腸桿菌中的s s70同源，組成a a2bbbbs s43型RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄中期基因表達(dá)所需的s s因子編碼基因gp28。中期基因的啟動子由s sgp28識別啟動，它與枯草桿菌的核心酶構(gòu)成a a2bbbbs sgp28型RNA聚合酶全酶

6、，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄晚期基因表達(dá)所需的s s因子編碼基因gp33和gp34。晚期基因的啟動子由s sgp33和s sgp34識別啟動，分別構(gòu)成RNA聚合酶全酶a a2bbbbs sgp33和a a2bbbbs sgp34。SPO1噬菌體基因表達(dá)的級聯(lián)調(diào)控模式通過更換不同的s s因子，識別并作用于不同基因的啟動子，最終導(dǎo)致這些基因有次序地級聯(lián)表達(dá)。前一基因編碼后一基因表達(dá)所需的s s因子。s43s28s28s33 / 34 早期基因中期基因晚期基因（Lewins GENES X 2010）枯草桿菌的孢子生成過程 枯草桿菌在對數(shù)生長階段結(jié)束后，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)耗盡，這時便啟動孢子生成過程：先是DNA復(fù)制，隔

7、膜形成，孢衣合成，母體裂解，孢子釋放。最后在細(xì)胞內(nèi)約40%的mRNA是孢子生專一性的。對數(shù)生長期細(xì)菌基因組復(fù)制隔膜形成DNA轉(zhuǎn)位至前孢孢衣形成母細(xì)胞裂解，孢子釋放（Lewins GENES X 2010）枯草桿菌孢子形成過程中的RNA聚合酶及其s因子 當(dāng)環(huán)境壓力（例如營養(yǎng)成份枯竭）時，枯草桿菌細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一連串的磷酸基團(tuán)傳遞反應(yīng)，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Spo0A的磷酸化。磷酸化了的Spo0A同時啟動兩種不同操縱子的轉(zhuǎn)錄，分別表達(dá)出s sproE和s sF。s sF一方面啟動s sG的表達(dá)，另一方面又表達(dá)SpoIIR，后者再激活隔膜結(jié)合型蛋白SpoIIGA，活化了的SpoIIGA將母體細(xì)胞中表達(dá)的s

8、 sproE裂解為有活性的s sE；而在前孢區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生的s sE均被前孢特有的蛋白酶摧毀殆盡。母體細(xì)胞中s sE的活性是激活前孢區(qū)域s sG所必需的（通過SpoIIA和一種未知蛋白因子）；而s sG的活性又能產(chǎn)生一種信號，跨隔膜激活母體細(xì)胞中的s sK。即：s sF s sE s sG s sK ?？莶輻U菌孢子子交叉激活形成過程中兩條途徑的 s因s sFs sEs sGs sK激活表達(dá)前孢區(qū)母細(xì)胞Spo0ASpo0As43s43sFsproEsEsGsproK隔膜SpoIIRSpoIIGASpoIIAsK5 h5 h打開262個基因打開75個基因打開48個基因打開81個基因SpoIVB枯草桿菌

9、各類s因子識別啟動子的序列偏好性 Science 335 2012 19 bpsAsB18 bpsD15 bp15 bpsHsL13 bpsWsF17 bp17 bpsGsE14 bp13 bpsK1A 原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān) 鏈霉菌啟動子的結(jié)構(gòu)具有很大的離散性，通過對100多個啟動子序列的比較，可將鏈霉菌啟動子分成三大類： c 鏈霉菌啟動子的多樣性 具有典型原核生物啟動子-10區(qū)和-35區(qū)特征的啟動子，僅占21% 具有典型原核生物啟動子-10區(qū)而無保守的-35區(qū)的啟動子 既無典型原核生物啟動子-10區(qū)又無保守的-35區(qū)的啟動子1A 原核生物基因表達(dá)的啟動開關(guān) 天藍(lán)色鏈霉菌（Strepto

10、myces coelicolor）的全基因組中存在多達(dá)65種不同的s s因c 鏈霉菌啟動子的多樣性s s66（hrdB） 鏈霉菌最重要的s s因子，hrdB-突變是致死性的。hrdB基因全程表達(dá)，稱為看家基因。s sWhiG（whiG） 鏈霉菌次級代謝基因轉(zhuǎn)錄所需的s s因子。s sF鏈霉菌孢子生成基因轉(zhuǎn)錄所需的s s因子。s sBldN（bldN）鏈霉菌氣生菌絲發(fā)育基因轉(zhuǎn)錄所需的s s因子。s sR（sigR）鏈霉菌響應(yīng)氧化壓力基因轉(zhuǎn)錄所需的s s因子。s sE（sigE）鏈霉菌感應(yīng)細(xì)胞膜完整性功能所需的s s因子。子，其中已被鑒定的有：1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用 真核生物尤其是高等

11、真核生物（哺乳動物）由于其細(xì)胞的高度分化，決定了基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性。 與原核生物不同，哺乳動物細(xì)胞內(nèi)共有三大類RNA聚合酶系統(tǒng)，它們均由多轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成，識別三大類真核生物的啟動子，分別承擔(dān)rRNA、mRNA、tRNA的轉(zhuǎn)錄。所有三種RNA聚合酶均由8-14個亞基組成，500kD，但它們并不能單獨(dú)啟動基因的轉(zhuǎn)錄。1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用啟動子由兩部分元件構(gòu)成。a RNA聚合酶 I 啟動轉(zhuǎn)錄的程序 RNA聚合酶 I 定位于核仁，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄rRNA編碼基因。RNA聚合酶 I 只作用于一種類型的啟動子，這類高等真核生物 I 型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因I 型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游啟動子元件（U

12、PE）核心啟動子GC豐富區(qū)GC豐富區(qū)增強(qiáng)啟動效果啟動基因轉(zhuǎn)錄CTCCGAGTCGNNNNNNNTGGGCCGCCGG 人類的這兩個重復(fù)序列具有85%的同原性I 型啟動子介導(dǎo)rRNA基因轉(zhuǎn)錄的啟動過程RNA聚合酶 I 在 I 型啟動子處的定位需要兩種轉(zhuǎn)錄因子并經(jīng)歷三個階段：UBF1（UPE結(jié)合因子）裝配因子SL1（四聚體核心結(jié)合因子）定位因子其中之一為 TBPUBF1SL1起始位點(diǎn)核心啟動子上游啟動子元件（UPE）Pol IUBF1結(jié)合在啟動子的UPE處SL1結(jié)合在核心啟動子處Pol I 加入TBP1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用 RNA聚合酶 II 定位于核內(nèi)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄mRNA的前體分子hn

13、RNA。 RNA聚合酶 II 及其作用的 II 型啟動子是真核生物細(xì)胞中最廣泛最典型最重要的轉(zhuǎn)錄啟動元件。b RNA聚合酶 II 啟動轉(zhuǎn)錄的程序高等真核生物 II 型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因II 型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動子附加區(qū)TATA BOX轉(zhuǎn)錄的啟動效率轉(zhuǎn)錄因子和RNA pol II 識別位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的時空特異性啟動基因轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄起始子 Inr核心啟動子高等真核生物 II 型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因II 型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動子附加區(qū)TATA BOXInrOCT BOXATTTGCAT單向性O(shè)ct 因子激活GC BOXGGGCGG雙向性SP1 因子激活CAAT BOXGGCCAATCT雙向性CTF/N

14、F1 因子激活上述附加區(qū)元件并不一定同時存在，而且在間隔、排列順序、拷貝數(shù)上均有很大的可變性。高等真核生物 II 型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因II 型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)啟動子附加區(qū)TATA BOXInr TATA BOX 位于 -25區(qū)，普遍存在于所有的真核生物細(xì)胞中，由八對堿基組成，兩側(cè)為GC堿基對。少數(shù)不含TATA BOX 特征結(jié)構(gòu)的啟動子成為 TATA-less 啟動子。RNA聚合酶 II 與轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物裝配因子TF II A B E F H J RNA聚合酶 II 本身由10-12個亞基組成 ，這些亞基具有類似于原核細(xì)菌RNA聚合酶中a a、b b、b b亞基的功能，但同樣不能識別啟動子。

15、對啟動子的專一性識別由若干的一般轉(zhuǎn)錄因子負(fù)責(zé)。這些一般轉(zhuǎn)錄因子分為兩大類：裝配因子和定位因子。 定位因子聚合酶 IITBP TAFa a2bbbbs s 因子真核生物： 原核生物： II 型啟動子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄啟動過程各種一般轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶 II 嚴(yán)格按照既定的順序依次結(jié)合在DNA及其蛋白復(fù)合物上，每種一般轉(zhuǎn)錄因子的加入均使DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物的空間構(gòu)象發(fā)生一次改變，而這種構(gòu)象變化又是下一輪的轉(zhuǎn)錄因TATAStartpointTFII DTAFsTBPTFII ATFII BTFII FPol IITFII JTFII HTFII E子加入所必需的。啟動子校對轉(zhuǎn)錄啟動流產(chǎn)轉(zhuǎn)錄加固II

16、型啟動子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄啟動過程TFIIH是唯一一種具有多重獨(dú)立酶活性的一般轉(zhuǎn)錄因子，其酶活性包括ATP酶、雙向解旋酶以及使RNA聚合酶II尾部CTD結(jié)構(gòu)域磷酸化的磷酸激酶。RNA聚合酶II一旦被磷酸化，所有的一般轉(zhuǎn)錄因子便從轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物上剝落下來，轉(zhuǎn)錄由起始階TFII JTFII HPPPP段轉(zhuǎn)換到延伸階段。TFII F / Pol IIRNA聚合酶 II 在近啟動子處暫停介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控機(jī)制 以RNA聚合酶 II 為核心的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物在 II 型啟動子處裝配完畢后，轉(zhuǎn)錄啟動。但隨后的轉(zhuǎn)錄進(jìn)程并非像人們想象的那么一帆風(fēng)順。事實(shí)上在很多果蠅和哺乳動物的基因中，剛剛啟動轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶 I

17、I 會在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游25-50個堿基處停頓下來。一些蛋白因子促進(jìn)RNA聚合酶 II 快速進(jìn)入停頓位點(diǎn)，而NELF（負(fù)延伸因子）和DSIF因子則起到穩(wěn)定處于停頓狀態(tài)的聚合酶 II 的作用?？焖龠M(jìn)入停頓位點(diǎn)慢速逃離停頓位點(diǎn)RNA聚合酶 II 在近啟動子處暫停介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸調(diào)控機(jī)制RNA聚合酶 II 從停頓位點(diǎn)逃離的先決條件是一些能促進(jìn)其逃離的蛋白因子的出現(xiàn)。這些因子將正轉(zhuǎn)錄延伸因子b（P-TEFb）招募至RNA聚合酶 II 處，并使NELF磷酸化。被磷酸化的NELF從RNA聚合酶II上解離，后者得以逃離，新近的果蠅全基因掃描研究表明，三分之一以上的基因在轉(zhuǎn)錄起始后能產(chǎn)生短小的RNA序列，表明這

18、種啟動子鄰近區(qū)的RNA聚合酶II停頓是控制轉(zhuǎn)錄輸出的普遍戰(zhàn)略。（Science 327，2010）轉(zhuǎn)錄加速；反之轉(zhuǎn)錄將緩慢進(jìn)行。1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用 RNA聚合酶 III 定位于核內(nèi)，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄tRNA和小分子 核內(nèi)RNA（snRNA）。相應(yīng)的 III 型啟動子有兩種類型： tRNA編碼基因所屬的啟動子稱為內(nèi)源型啟動子； snRNA編碼基因所屬的啟動子稱為外源型啟動子；c RNA聚合酶 III 轉(zhuǎn)錄啟動的程序高等真核生物 III 型啟動子的結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)基因III 型內(nèi)源型啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)BOX ABOX CBOX ABOX BPSEOCTPol III 結(jié)合區(qū)結(jié)合區(qū)III 型外源型啟

19、動子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)結(jié)構(gòu)基因III 型啟動子介導(dǎo)的tRNA/snRNA基因轉(zhuǎn)錄啟動過程TFIIIB由TBP和另外兩種蛋白因子組成，其功能相當(dāng)于定位因子；TFIIIA和TFIIIC屬于裝配因子。boxAboxCboxAboxB（1型） 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TFIIIATFIIICTFIIIATFIIICTFIIICTFIIIATFIIICTFIIICTFIIIBTFIIIBRNA Pol IIIRNA Pol IIITFIIIBTFIIIB（2型） 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)1B 真核生物多轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用 由此可見，TBP是所有三種類型的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)所必需的。在含有TATA BOX的啟動子中，TBP特異性地結(jié)

20、合在DNA的相應(yīng)區(qū)域；在TATA less 型啟動子中，TBP與其它蛋白因子協(xié)同作用，結(jié)合在DNA的特定區(qū)域內(nèi)。 1C 原核生物的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)控 RNA的結(jié)構(gòu)調(diào)控是一種轉(zhuǎn)錄啟動后的基因表達(dá)調(diào)控方式，其主要形式表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄的終止與抗終止作用。 a RNA轉(zhuǎn)錄的終止作用 原核細(xì)菌擁有兩種機(jī)制終止RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄，它們分別稱為順式終止和反式終止。 介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄順式終止的內(nèi)源性終止子 內(nèi)源性終止子結(jié)構(gòu)的組成為富含GC堿基的發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及下游的寡聚U鏈（通常是6個U）。它們由DNA上的終止子序列編碼，出現(xiàn)在轉(zhuǎn)5 A U C G CA UA UU AC GC GC GG CA UA UA UC GA GG CU

21、 AU AC UC GG CG CGAGUAG URNA聚合酶U U U U U U 3 錄中的RNA結(jié)構(gòu)中。 真核生物的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制也與順式終止相似。 AGUA U介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄反式終止的Rho因子依賴性終止子 基因轉(zhuǎn)錄的反式終止多見于噬菌體中。終止位點(diǎn)為CUU中的某個堿基，其上游 50-90 bp 的序列中無莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，但堿基組成特殊：C 41%，G 14%，A 25%，U 20%。在這種Rho（r）因子專一性識別的終止子結(jié)構(gòu)內(nèi)，若缺失若干個C，甚至一個C，便會導(dǎo)致不能終止的RNA聚合酶Rho因子識別結(jié)合區(qū)5 AUCGCUACCUCAUAUCCGCACCUCCUCAAACGCUACCUCGAC

22、CAGAAAGGCGUCUCUU 3 現(xiàn)象發(fā)生。反式終止的機(jī)制 Rho因子呈六聚體，具有ATPase活性。當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出富含C的Rho因子識別位點(diǎn)時，Rho因子便與轉(zhuǎn)錄出的RNA鏈結(jié)合； Rho因子沿RNA鏈向RNA聚合酶方向移動，由于其移動速度快于RNA聚合酶，因此當(dāng)RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出終止位點(diǎn)CUU時，Rho因子正好趕上； Rho因子水解ATP釋放能量，拆開DNA-RNA雜合鏈，轉(zhuǎn)錄遂終止。但若在Rho因子與RNA聚合酶之間存在著核糖體，則Rho因子不能終止轉(zhuǎn)錄CUURho因子1C 原核生物的RNA結(jié)構(gòu)調(diào)控b RNA轉(zhuǎn)錄的抗終止作用 在某些特殊條件下，由RNA聚合酶引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄并不能在終

23、止子處順利終止，這種現(xiàn)象稱為“轉(zhuǎn)錄過頭”，其發(fā)生 RNA的結(jié)構(gòu)調(diào)控是一種轉(zhuǎn)錄啟動后的基因表達(dá)調(diào)控方式，其主要形式表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄的終止與抗終止作用。 機(jī)制是細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄抗終止作用。細(xì)菌衰減子依賴性的轉(zhuǎn)錄抗終止作用UGGUGGCGCACUUCCUGAACC5 ACUAUGUGACGGGUCAAU GC GU A AAGCAAUCAGAUACCCAGCCCGCCUCGGGCGGAUUA AU U U U U U U 3 UGGUGGCGCACUUCC5 U G A AACAUGUGACGGUGGAUACCCAGCCCGCCUU ACGAAAGCAAUCAUCCAGCU A A U GAGUCGGGU U

24、 U U U U UC 3 另一個則位于正常的基因編碼區(qū)下游。細(xì)胞內(nèi)條件的變化，可使基因的轉(zhuǎn)錄在兩個順式終止子結(jié)構(gòu)的某一個處終止。這種結(jié)構(gòu)稱某些細(xì)菌的結(jié)構(gòu)基因含有兩個順式終止子，其中一個位于基因上游的編碼 區(qū) 內(nèi) ，為衰減子。相互轉(zhuǎn)換細(xì)菌衰減子的轉(zhuǎn)錄抗終止機(jī)制大腸桿菌的色氨酸操縱子中含有一個衰減子結(jié)構(gòu)。在基因的5端編碼區(qū)有兩個連續(xù)排列的色氨酸密碼子。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸匱乏時核糖體在色氨酸密碼子處暫停翻譯，衰減子的2鏈和3鏈形成雙鏈結(jié)構(gòu)，第一個終止子結(jié)構(gòu)不能形成，轉(zhuǎn)錄繼續(xù)進(jìn)行；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)色氨酸充足時，翻譯不在色氨酸密碼子處停止，結(jié)果產(chǎn)生終止子結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄遂終止。噬菌體抗終止因子依賴性的轉(zhuǎn)錄抗終止作用 大

25、腸桿菌 l 噬菌體早早期基因和早期基因的表達(dá)產(chǎn)物往往是晚期基因表達(dá)的調(diào)控因子。早早期基因表達(dá)產(chǎn)物的調(diào)控機(jī)制有兩種： 一是作為 s 因子識別早期基因和晚期基因啟動子，啟動表達(dá)這兩組基因；二是作為轉(zhuǎn)錄抗終止因子，使宿主細(xì)胞的RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄過頭，導(dǎo)致早期基因和晚期基因的表達(dá)。這兩種方式均為正調(diào)控作用。噬菌體抗終止因子的作用 大腸桿菌l噬菌體感染大腸桿菌后，在PL啟動子的介導(dǎo)下表達(dá)出抗終止因子N蛋白，它以一種獨(dú)特的方式使阻止Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止作用，使早早期基因轉(zhuǎn)錄過頭并轉(zhuǎn)錄出早期基因的mRNA N蛋白的半衰期只有五分鐘，它決定了早期基因表達(dá)周期的長短。tL1tR1PLPRNcro左向轉(zhuǎn)錄單位右向轉(zhuǎn)

26、錄單位抗終止因子 NtL1tR1抗終止因子的工作原理 大腸桿菌 l 噬菌體的抗終止因子N特異性識別早早期基因內(nèi)部的nut位點(diǎn)，并且在RNA聚合酶到達(dá)這里時與之結(jié)合，形成復(fù)合物。這種復(fù)合物能有效抑制Rho因子的結(jié)合作用，從而干擾Rho因子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄終止效應(yīng)，導(dǎo)致早早期基因的轉(zhuǎn)錄過頭 Q因子以類似的機(jī)制使得早期基因轉(zhuǎn)錄過頭。啟動子終止子RNA聚合酶nut 位點(diǎn)r 因子NusB / NusENusA NusGNCGCTCTTANNNNNNNNNAGCCCTGAAPuAAGGGCAGCGAGAATNNNNNNNNNTCGGGACTTPyTTCCCGT1D 真核生物的RNA剪切調(diào)控 真核生物大多數(shù)的分裂

27、基因（即含有內(nèi)含子的基因）在轉(zhuǎn)錄后必須切除內(nèi)含子序列。正常剪切時，外顯子的序列和個數(shù)是恒定不變的；但有些基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物會出現(xiàn)剪切多樣性（另類剪切模式），即一種基因轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生多種不同的mRNA，其中包括外顯子的缺失或內(nèi)含子的保留。甚至在某些細(xì)胞內(nèi)，這些由于剪切多樣性而產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)會同時出現(xiàn)，并且均為細(xì)胞正常生物功能所必需。據(jù)統(tǒng)計，哺乳動物體內(nèi)表達(dá)的基因90%以上是被另類剪切的。1D 真核生物的RNA剪切調(diào)控a RNA前體的正常剪切與另類剪切內(nèi)含子保留5另類剪切3另類剪切外顯子跳越外顯子相互排除外顯子組合選擇啟動子另類剪切多聚尾另類剪切pApA1D 真核生物的RNA剪切調(diào)控b RNA前體的另類

28、剪切導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的多樣化CaMKIId 基因E13E14E15E16E17dA 蛋白dB 蛋白dC 蛋白1D 真核生物的RNA剪切調(diào)控c 黑腹果蠅性別決定與剪切多樣性的關(guān)系 黑腹果蠅的性別決定過程由三個性別特異性的RNA剪切程序支配，涉及到三個與性別決定有關(guān)的基因：Sxltradsx果蠅胚胎性別決定的最初機(jī)制 （PRINCIPLES OF GENETICS，2010）Sxl-RNAXXX 染色體基因常染色體基因XYX 染色體基因常染色體基因XX型胚胎XY型胚胎Sex-lethal gene Sxl X-linked拮抗作用Sxl 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的另類剪切導(dǎo)致雌性細(xì)胞產(chǎn)生SXL蛋白XX型胚胎XY

29、型胚胎Sxl genePMPEE2E3E4 - E8PMPEE2E3E4 - E8含終止密碼子含終止密碼子Pre-mRNASxl-mRNASXL proteinPre-mRNASxl-mRNASXL proteinNo function由最初機(jī)制控制另類剪切隨后由自身控制另類剪切tra 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的另類剪切導(dǎo)致雌性細(xì)胞產(chǎn)生Tra蛋白tra 基因雄性細(xì)胞 正常剪切雌性細(xì)胞 另類剪切E1E2E4E3TRA 200 aaSXL蛋白在XX型胚胎（即未來的雌性個體）中的特異性產(chǎn)生，鞏固了果蠅胚胎發(fā)育性別決定的基礎(chǔ)。最新的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果（2011）也證實(shí)：SXL過量表達(dá)導(dǎo)致原始生殖細(xì)胞分化為卵細(xì)胞；而SX

30、L表達(dá)抑制則使原始生殖細(xì)胞分化為精細(xì)胞。Sxl蛋白含有高比例的Arg和Ser殘基，類似于其它的RNA結(jié)合蛋白，是tra基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物另類剪切的調(diào)控因子：No functionSXL終止密碼子dsx 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多樣性剪切導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生Dsx兩性蛋白與tra不同，另一個tra基因（tra2）的轉(zhuǎn)錄物只有一種剪切模式，因而在XX和XY兩種類型的胚胎中，TRA2蛋白均存在。TRA和TRA2蛋白均含有剪切所必需的Arg-Ser型RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它們共同調(diào)控位于常色體上的兩性基因dsx（doublesex）轉(zhuǎn)錄物的剪切模式：dsx 基因雌性特異性蛋白雄性特異性蛋白E1E5E4E2E3E6TRA2TRA

31、+ TRA2終止密碼子dsx 基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的多樣性剪切導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生Dsx兩性蛋白Sxltratra2dsxSxl RNAtra RNAtra2 RNAdsx RNASxl mRNAtra mRNAtra2 mRNAdsx mRNA轉(zhuǎn)錄剪切翻譯XXXYSXLDSXTRATRA2雌性蛋白雄性蛋白雌性蛋白阻遏雄性發(fā)育基因表達(dá)；雄性蛋白阻遏雌性發(fā)育基因表達(dá)1E 原核生物反義RNA的調(diào)控 反義RNA是指能與mRNA、DNA片段、RNA引物互補(bǔ)的RNA分子。通過與RNA引物、基因DNA片段、mRNA鏈的互補(bǔ)配對，分別抑制基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯過程。原核生物的反義RNA由反義基因編碼，其本身的轉(zhuǎn)錄可為蛋白因

32、子啟動轉(zhuǎn)錄而正調(diào)控；亦可由蛋白因子降解反義RNA而負(fù)調(diào)控。 反義RNA在原核生物中廣泛存在，是一種較為普遍的基因表達(dá)調(diào)控方式。目前，根據(jù)反義RNA原理設(shè)計的各類反義核酸，在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)領(lǐng)域已被廣泛用于基因表達(dá)的特異性阻遏劑；在醫(yī)學(xué)藥學(xué)領(lǐng)域也被用來治療惡性腫瘤及病毒感染等疾病，即反義技術(shù)。1E 原核生物反義RNA的調(diào)控a 反義RNA抑制DNA復(fù)制 直接抑制機(jī)理：反義RNA直接與DNA的復(fù)制起始位點(diǎn)結(jié)合，阻 間接抑制機(jī)理：反義RNA與RNA引物結(jié)合，使之不能與DNA復(fù)制模板互補(bǔ)，從而間接影響DNA的復(fù)制。如大腸桿菌ColE1質(zhì)粒的復(fù)礙復(fù)制起始蛋白的識別與結(jié)合，導(dǎo)致DNA復(fù)制不能啟動。制、金黃色葡萄球

33、pT181質(zhì)粒的復(fù)制均采用這種機(jī)制?？刂茝?fù)制引物與模板的結(jié)合oriE.coli ColE1 plasmid復(fù)制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553反義RNA間接抑制ColEI質(zhì)粒的復(fù)制啟動引物型RNA調(diào)控型RNA1E 原核生物反義RNA的調(diào)控b 反義RNA抑制基因轉(zhuǎn)錄P 1P 2反義RNA能以兩種不同的方式改變編碼在相反鏈上的基因的轉(zhuǎn)錄；即轉(zhuǎn)錄干擾和轉(zhuǎn)錄衰減轉(zhuǎn)錄干擾發(fā)生在從一個啟動子反義RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄干擾效應(yīng)處起始的轉(zhuǎn)錄阻遏第二個啟動子啟動轉(zhuǎn)錄。例如，丙酮丁醇梭菌從S-box反義RNA的啟動子處轉(zhuǎn)錄出的反義RNA能阻斷相反DNA鏈上編碼的操縱子ubiG-mccBA的轉(zhuǎn)錄啟動。

34、轉(zhuǎn)錄干擾1E 原核生物反義RNA的調(diào)控b 反義RNA抑制基因轉(zhuǎn)錄P 1P 2反義RNA也可與靶mRNA的5-端序列互補(bǔ)從而阻止靶mRNA的繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，使之產(chǎn)生非成熟性的轉(zhuǎn)錄物（即轉(zhuǎn)錄衰減效反義RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄衰減效應(yīng)應(yīng)）。例如：大腸桿菌中的tic-RNA（轉(zhuǎn)錄抑制互補(bǔ)性RNA）可與cAMP受體蛋白的5端mRNA區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，形成特殊的空間結(jié)構(gòu)迫使其轉(zhuǎn)錄停止。轉(zhuǎn)錄衰減1E 原核生物反義RNA的調(diào)控c 反義RNA抑制mRNA翻譯 反義RNA主要的調(diào)控功能表現(xiàn)在翻譯水平上。原核生物的研究已經(jīng)確定，反義RNA抑制翻譯有下列三種作用方式：與mRNA的5端非編碼區(qū)（5-UTR）結(jié)合，阻礙其在核糖體上的準(zhǔn)確定

35、位；與mRNA的5端編碼區(qū)（主要是起始密碼子AUG）結(jié)合，抑制翻譯的起始；與mRNA全編碼區(qū)結(jié)合，抑制其翻譯模板的功能。大腸桿菌利用反義基大腸桿菌的ompC和ompF基因編碼外膜蛋白，OmpC使胞內(nèi)滲透壓提高；OmpF使胞內(nèi)滲透壓降低。當(dāng)環(huán)境滲透壓增加時，膜蛋白EnvE激活胞內(nèi)的OmpR蛋白，后者誘導(dǎo)ompC和micF兩個基因轉(zhuǎn)錄。micF轉(zhuǎn)錄物是ompF-mRNA的反義RNA，它能滅活ompF-mRNA，從而降低胞內(nèi)OmpF的濃度。因調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓UUUUUU CUUUAUCCC-CAUUUGUCUGUAAGUCUUUACUUACUGCAUUAUUUAUUACUGACGGGCAGUGG-C

36、AGGUG-UCAUAAA AUGAGGUAAUAAAUAAUGAUUGACAGAACUUAACACAAAUU AAG CG CC GU GU AA UC GG CG CUUUU CAGAGG：SD序列AAUG：起始密碼子EnvEOmpRmicFompFompF mRNAmicF RNA大腸桿菌利用反義基大腸桿菌的R1質(zhì)粒上含有hok和sok基因。hok編碼由52個氨基酸組成的穩(wěn)定的毒素蛋白，能使細(xì)胞膜去極化而殺死細(xì)胞。Sok編碼hok的反義RNA。當(dāng)細(xì)胞分裂時，如果子細(xì)胞沒有分配到R1質(zhì)粒，HoK蛋白就會殺死子細(xì)因維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性細(xì)胞，因?yàn)橛H本細(xì)胞中Sok轉(zhuǎn)錄出來的反義RNA不穩(wěn)定而被降解；

37、如果子細(xì)胞分配到R1質(zhì)粒，則Sok基因就能源源不斷地為子細(xì)胞提供反義RNA，以阻斷半衰期較長的hok mRNA翻譯出HoK毒素蛋白，細(xì)胞得以存活。該hok/sok系統(tǒng)保證了細(xì)菌品系的穩(wěn)定性1E 原核生物反義RNA的調(diào)控d 反義技術(shù)在實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用策略 受反義RNA特異性阻斷基因表達(dá)的原理啟發(fā)，人們利用生物合成甚至化學(xué)合成的方法，制備了一系列針對特定病變基因（如癌基因）或病原體基因的反義試劑或反義藥物，一方面期望通過這些特異性的基因表達(dá)阻斷試劑，體內(nèi)探查特定基因的功能（即所謂的loss-of-function戰(zhàn)略）；另一方面也希望能利用這些反義藥物對付日趨嚴(yán)重的基因分子疾病和病毒感染疾

38、病。由靶基因的反向表達(dá)體內(nèi)生成相應(yīng)的反義RNA將靶基因的編碼序列反向接在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，轉(zhuǎn)錄出來的RNA即為靶基因53535353啟動子終止子target GENEtarget GENEmRNAantisense RNA會降解RNA。這種戰(zhàn)略缺點(diǎn)在于：反義RNA分子量大，容易引起體內(nèi)免疫攻擊另外，核酸酶也的反義RNA。人工設(shè)計合成修飾型的小分子反義RNA鎖核酸 LNA肽核酸 PNAOCH2OOHB核糖核酸 RNA人工設(shè)計合成修飾型的小分子反義RNAPOOOOPOOOOCH2OOHNNNNNH2ACH2OOHGNNONH2CPOOOOCH2OOHNNNNH2NOHPOOOOCH2OOHUOH

39、35NNOOHOOOOCH2OOHNNNNNH2ACH2OOHGNNONH2CCH2OOHNNNNH2NOHCH2OOHUOH35NNOOHSOOOSOOOOSOOOOSORNASNA反義嗎啉寡聚核苷酸 anti-MO oligoPOOOOPOOOOCH2OOHNNNNNH2ACH2OOHGNNONH2CPOOOOCH2OOHNNNNH2NOHPOOOOCH2OOHUOH35NONOHTNNOCH3OGNNNNH2NOH3OPONNONNNNNH2ANNONH2C5ONONOPONOPONNORNA靶分子人工設(shè)計合成修飾型的小分子反義RNA1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾 RNA分子在遺

40、傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程中扮演著重要的角色，但幾十年來有關(guān)RNA的消息只能聽到微弱的聲音。近十幾年來接連不斷的發(fā)現(xiàn)表明，一類被稱為小RNA（small RNAs）的物質(zhì)操縱著很多生命過程。它們能改變基因的表達(dá)水平甚至關(guān)閉基因、編輯基因組、哄騙細(xì)胞形成特定的組織。因此該領(lǐng)域的研究成果被Science雜志連續(xù)兩年（2001-2002）評為年度十大科成就之一。1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾a RNA干擾作用的發(fā)現(xiàn) 1993年，康奈爾大學(xué)的Su Guo在用人工合成的反義RNA阻斷線蟲基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中偶然發(fā)現(xiàn)，反義RNA和正義RNA都能阻斷靶基因的表達(dá)，他對這個結(jié)果百思不得其解。直到19

41、98年，美國卡內(nèi)基研究所的Andrew Fire用確鑿的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，在正義RNA阻斷基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，真正起作用的是小分子的雙鏈RNA，它們是體外轉(zhuǎn)錄正義RNA時生成的。上述雙鏈RNA對基因表達(dá)的阻斷作用稱為RNA干擾（RNAi）。隨后大量的研究發(fā)現(xiàn)，RNAi 現(xiàn)象廣泛存在于線蟲、果蠅、斑馬魚、真菌、植物、哺乳動物乃至人體內(nèi)，它們借助于RNAi 抵御病毒的感染，阻斷轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座作用，以維持其基因組的相對穩(wěn)定性。1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾a RNA干擾作用的發(fā)現(xiàn)RNA干擾與先前所說的轉(zhuǎn)錄后基因沉默、轉(zhuǎn)基因沉默等術(shù)語都是一回事，但常與基因表達(dá)的反義抑制相混淆。反義抑制過程并不涉及mR

42、NA的催化降解，只是單鏈反義RNA物理上與mRNA結(jié)合并阻斷其翻譯。Andrew Fire 和 Craig Mello因他們關(guān)于線蟲RNA干擾的研究（1998）而分享2006年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。b RNA干擾的作用機(jī)理 外源性的雙鏈RNA，不管來自病毒RNA基因組的感染還是人工的導(dǎo)入，均在細(xì)胞質(zhì)中被Dicer酶裁剪成22-24bp的短小雙鏈片段，即 small interfering RNA（siRNA），其3端含有兩個凸出的堿基，負(fù)責(zé)siRNA的遷移和對靶序列的識別。在RISC復(fù)合物的協(xié)助下，雙鏈siRNA拆成單鏈，然后再與具有互補(bǔ)序列的靶mRNA分子結(jié)合，形成局部雙鏈。后者或遭RNa

43、se的降解，或直接阻斷靶mRNA的翻譯。AGO 復(fù)合物AGO 復(fù)合物1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾c 細(xì)胞內(nèi)固有的miRNA 前已述及，siRNA是由體外來源的雙鏈RNA經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶加工的sRNA被命名為：microRNA（miRNA）。 進(jìn)一步的探索發(fā)現(xiàn)：在動物、植物、真菌的細(xì)胞核內(nèi)，從結(jié)構(gòu)致密的異染色質(zhì)中心粒區(qū)域的DNA重復(fù)序列上會轉(zhuǎn)錄出一些特殊的RNA前體大分子，它們同樣在類似蛋白因子的作用下，形成長度為21-23個堿基的單鏈sRNA分子，并發(fā)揮特殊的生物學(xué)功能。這種細(xì)胞內(nèi)編碼的固有而成的。那么細(xì)胞內(nèi)是否也存在著固有的RNA類似物呢？miRNA的形成首先從異染色質(zhì)中心粒

44、區(qū)域的DNA重復(fù)序列上轉(zhuǎn)錄出大分子的非編碼型RNA前體（pri-miRNA），后者在核內(nèi)被微加工器復(fù)合物（由RNaseIII組成）先切成大約70個核苷酸的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（pre-miRNA），然后再被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中由Dicer進(jìn)一步裁剪，形成成熟的miRNA分子，最后再由幾種因子裝配而成。Science 319, 1787, 2008miRNA的生物功能異染色質(zhì)裝配外成性修飾轉(zhuǎn)錄調(diào)控轉(zhuǎn)錄物剪切調(diào)控轉(zhuǎn)錄物穩(wěn)定調(diào)控翻譯抑制結(jié)構(gòu)域構(gòu)成（Lewins GENES X 2010）miRNA介導(dǎo)的翻譯抑制模式AAAAAAAAAAAAAAAAGORISC：AGO + GW182核糖體抑制翻譯延伸AAAAAAAAG

45、OAA降解翻譯產(chǎn)物競爭帽子結(jié)構(gòu)Cap抑制核糖體裝配抑制mRNA環(huán)化AGOGW182mRNA觸發(fā)剪尾脫帽DCP2miRNA1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾d RNA干擾原理的應(yīng)用 如果將外源的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞中，則雙鏈RNA分子一方面在Dicer的作用下裂解成siRNA；另一方面在以RNA為模板的RNA聚合酶RdRP的作用下自身擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物再被Dicer裂解成siRNA。后者解鏈并與RISC復(fù)合物一起作用于靶mRNA上，一方面使其降解，另一方面又以siRNA作為引物，mRNA為模板，在RdRP催化下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈，結(jié)果mRNA也變成了雙鏈RNA。它在Dicer的作用下也同樣被裂解成siRNA。通過這種體內(nèi)的RNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達(dá)的抑制。相關(guān)研究結(jié)果表明，從21-23個堿基的siRNA到幾百堿基對的雙鏈RNA都能誘發(fā)RNA干擾作用，但長的雙鏈RNA阻斷基因表達(dá)的效果明顯優(yōu)于短的雙鏈RNA。需要指出的是，人類和果蠅體內(nèi)不存在RdRP，故無法進(jìn)行上述siRNA擴(kuò)增。1F 真核生物sRNA介導(dǎo)的RNA干擾d RNA干預(yù)原理的應(yīng)用上述RNA干擾原理在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中的用途包括：通過基因表達(dá)的特異性阻斷作用，確定基因的功能通過基因表達(dá)的特異性阻斷作用，實(shí)