Lowrys法Folin酚試劑法PPT課件

1、怎樣測(cè)定血清中怎樣測(cè)定血清中蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的含量的含量第1頁/共24頁蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法比較蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法比較方方 法法 靈敏度靈敏度 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)缺點(diǎn)凱氏定氮法凱氏定氮法0.2 1.0mg氮氮 干擾少，干擾少，準(zhǔn)確準(zhǔn)確操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí) 紫外吸收法紫外吸收法50100mg 快速簡(jiǎn)便快速簡(jiǎn)便無損樣品無損樣品靈敏度低靈敏度低干擾物較多干擾物較多考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）法）法15ug 靈敏、簡(jiǎn)靈敏、簡(jiǎn)便、快速便、快速不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差有較大的偏差 雙縮脲法雙縮脲法 120mg 干擾相對(duì)干擾相對(duì)少，較快少，較快靈敏度低靈敏度低L

2、owry法法20250ug 靈敏度高靈敏度高干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)第2頁/共24頁選擇測(cè)定方法時(shí)應(yīng)考慮 1、實(shí)驗(yàn)對(duì)測(cè)定所要求的靈敏度和精確度； 2、蛋白質(zhì)的性質(zhì)； 3、溶液中存在的干擾物質(zhì)； 4、測(cè)定所花費(fèi)的時(shí)間等。第3頁/共24頁蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法比較蛋白質(zhì)含量測(cè)定的常用方法比較方方 法法 靈敏度靈敏度 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)缺點(diǎn)凱氏定氮法凱氏定氮法0.2 1.0mg氮氮 干擾少，干擾少，準(zhǔn)確準(zhǔn)確操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí) 紫外吸收法紫外吸收法50100mg 快速簡(jiǎn)便快速簡(jiǎn)便無損樣品無損樣品靈敏度低靈敏度低干擾物較多干擾物較多考馬斯亮藍(lán)法考馬斯亮藍(lán)法（B

3、radford）法）法15ug 靈敏、簡(jiǎn)靈敏、簡(jiǎn)便、快速便、快速不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差有較大的偏差 雙縮脲法雙縮脲法 120mg 干擾相對(duì)干擾相對(duì)少，較快少，較快靈敏度低靈敏度低Lowry法法20250ug 靈敏度高靈敏度高干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)第4頁/共24頁實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?1、掌握Folin-酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理 及其實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。 2、掌握制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的要領(lǐng)和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線 求樣品溶液中待測(cè)定物質(zhì)含量的方法 。第5頁/共24頁原理原理1921年，F(xiàn)olin 首創(chuàng)，利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢

4、酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。1951年，Lowry對(duì)此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度。第6頁/共24頁原理原理 第一步：雙縮脲反應(yīng)第一步：雙縮脲反應(yīng) 在堿性溶液中,雙縮脲(H2NOCNHCONH2)能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物,這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個(gè)肽鍵, 因此有雙縮脲反應(yīng)。 即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的CuCu2+2+作用生成紫紅色的作用生成紫紅色的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)- Cu- Cu2+2+復(fù)合物。復(fù)合物。第7頁/共24頁原理原理 第二步：

5、第二步：Folin-Folin-酚顯色反應(yīng)酚顯色反應(yīng) Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)(鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物)。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此顯色反應(yīng)。 即蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)- Cu- Cu2+2+復(fù)合物復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化藍(lán)色的化合物合物。第8頁/共24頁 在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出蛋白質(zhì)的含量。 即根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中蛋白

6、質(zhì)的含量。原理原理第9頁/共24頁樣品樣品 健康人血清 正常人血清蛋白質(zhì)含量：6080g/L第10頁/共24頁試劑試劑 1、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（200g/ml） 2、堿性硫酸銅溶液（當(dāng)日有效） 3、Folin-酚試劑第11頁/共24頁儀器和器材儀器和器材 1、722型分光光度計(jì) 2、恒溫水浴箱 3、試管6支、試管架 4、加樣槍、加樣槍架 5、坐標(biāo)紙第12頁/共24頁操作操作試劑（試劑（ml)123456牛血清白蛋白牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)液-0.200.400.600.80-樣品液樣品液（稀釋（稀釋300倍）倍）-0.50蒸餾水蒸餾水1.00.800.600.400.200.50堿性硫酸銅堿性硫

7、酸銅2.02.02.02.02.02.0l各管混勻，室溫放置各管混勻，室溫放置10min。 l向各管內(nèi)加入向各管內(nèi)加入Folin-酚試劑酚試劑, 2s內(nèi)迅速混勻內(nèi)迅速混勻！ 40放置放置10min。l冷卻至室溫后，以冷卻至室溫后，以500nm波長(zhǎng)比色，用波長(zhǎng)比色，用1號(hào)管號(hào)管作空白，讀取各管吸光度。作空白，讀取各管吸光度。蛋白質(zhì)濃度（g/ml）04080120160未知第13頁/共24頁注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) Folin-酚試劑在酸性條件下較穩(wěn)定，而堿性硫酸銅試劑是在堿性條件下與蛋白質(zhì)作用生成堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液。 故當(dāng)Folin-酚試劑加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中后，必須立即混勻（加一管混勻一管），

8、使還原反應(yīng)發(fā)生在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前。第14頁/共24頁注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。 即第1支試管加入堿性硫酸銅試劑堿性硫酸銅試劑后，開始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入堿性硫酸銅試劑堿性硫酸銅試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。 如試管加完堿性硫酸銅試劑后若已到10分鐘，則第1支試管可立即加入0.20mL Folin-Folin-酚試劑酚試劑，1分鐘后第2支試管加入0.20mL Folin-Folin-酚試劑酚試劑，2分鐘后加第3支試管，以此類推。 水浴10min，冷卻后，每一分鐘測(cè)一管。蛋白樣品堿性銅試劑混勻，放10min加

9、酚試劑2s混勻水浴10min放至室溫比色第15頁/共24頁數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 2345測(cè)定次數(shù)1236各管平均A值各 管 A 值第16頁/共24頁繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟 1、選擇合適的坐標(biāo)紙 2、畫坐標(biāo)軸 3、根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)描點(diǎn) 4、連線 5、求實(shí)驗(yàn)結(jié)果第17頁/共24頁繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 以A500值為縱坐標(biāo)，牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，用鉛筆繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度A蛋白質(zhì)濃度C（g/ml）0.20.40.6.4080120160第18頁/共24頁繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 根據(jù)所描點(diǎn)的分布情況，作直線或光滑連續(xù)的曲線，該線表示實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的平均變動(dòng)情況，因此該線不需全部通過各點(diǎn)，但

10、應(yīng)盡量使未經(jīng)過線上的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)均勻分布在曲線或直線兩側(cè)。第19頁/共24頁計(jì)算計(jì)算 根據(jù)未知樣品溶液的吸光度值，在繪制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖中查出樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量。 然后乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)(g/ml)。血清蛋白濃度(g/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度2300第20頁/共24頁本方法的特點(diǎn)：本方法的特點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：1.靈敏度高，比雙縮脲法靈敏約100倍。 2.操作簡(jiǎn)單，不需特殊儀器設(shè)備。 缺點(diǎn)：1.費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間 2.標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式 3.專一性較差，干擾物質(zhì)較多。 第21頁/共24頁722型分光光度計(jì)操作步驟 1.靈敏度旋鈕調(diào)至”1”檔,選擇開關(guān)置于”T”,旋轉(zhuǎn)波長(zhǎng)調(diào)節(jié)旋鈕()至所需波長(zhǎng); 2.接通電源,打開電源開關(guān),預(yù)熱510分鐘; 3.打開樣品室蓋,調(diào)節(jié)旋鈕”0”,使透光度(T)讀數(shù)為0; 4.裝有空白溶液和待測(cè)試樣溶液的比色杯依次入比色槽架中,置入樣品室; 5.拉動(dòng)比色架拉桿,裝空白溶液的比色杯移入光路中,蓋上樣品室蓋,調(diào)節(jié)旋鈕”100” ,使透光度(T)讀數(shù)為100.若達(dá)不到100,可適當(dāng)增加靈敏度的檔數(shù); 6.調(diào)節(jié)開關(guān)撥到”A”,選擇旋鈕”消光零”,使數(shù)字顯示為0; 7.重復(fù)”3”,”