全人源炭疽保護(hù)性抗原中和抗體的研究

1、全人源炭疽保護(hù)性抗原中和抗體的研究炭疽芽胞桿菌 (Bacillus anthracis) 致死率極高 , 是人畜共患烈性傳染病 - 炭疽病(Anthrax)的病原體。并且炭疽芽胞桿菌來(lái)源廣泛、易于培養(yǎng),被作為一種 A類(lèi)生物戰(zhàn)劑進(jìn)行管理，其防生和反恐一直以來(lái)都具有重要的軍事意義和社會(huì)意 義。炭疽的防控手段包括預(yù)防和治療 , 二者分別主要依賴(lài)于炭疽疫苗和抗菌素 , 但是這兩種藥物均需在感染前或感染初期立即使用。 而炭疽毒素中和抗體在宿主 感染后 , 能快速有效中和體內(nèi)產(chǎn)生的炭疽毒素 , 同時(shí)發(fā)揮補(bǔ)體依賴(lài)細(xì)胞毒性作用 和抗體依賴(lài)細(xì)胞毒性作用 , 是目前最有前景的炭疽治療藥物。自從1975年雜交瘤技術(shù)

2、出現(xiàn)后 ,多年來(lái)單抗治療主要依賴(lài)于鼠源單抗。 但是 鼠源單抗半衰期短、毒副作用明顯 , 大大制約了其臨床應(yīng)用。全人源單克隆抗體應(yīng)用于人體時(shí)具有無(wú)免疫原性、半衰期長(zhǎng) , 國(guó)外大多數(shù)新 開(kāi)發(fā)工程現(xiàn)已轉(zhuǎn)向全人源單抗的研發(fā)。 目前全人源單抗制備的方法主要是通過(guò)人 人雜交瘤技術(shù)、轉(zhuǎn)基因鼠技術(shù)、抗體庫(kù)技術(shù)和單細(xì)胞PCF技術(shù),其中通過(guò)單細(xì)胞PCF技術(shù)可直接從人單個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增抗體基因，無(wú)需細(xì)胞融合培養(yǎng)和抗體多輪 篩選的過(guò)程,能夠在最短 7天內(nèi)篩選獲得有效的全人源單抗 ,而其他幾種抗體制 備方法均需要數(shù)周甚至數(shù)月 , 建立這種快速高通量抗體篩選平臺(tái) , 將有助于提升 我國(guó)新發(fā)突發(fā)傳染病的應(yīng)對(duì)能力；并且，單細(xì)胞

3、PCF技術(shù)完整保存了抗體重鏈輕 鏈在人體內(nèi)的天然配對(duì)方式 , 因此可在獲得治療抗體的同時(shí)更加直觀、深入地研 究人體免疫機(jī)制。但是,由于單個(gè)細(xì)胞內(nèi)基因拷貝數(shù)非常低,單細(xì)胞PCF技術(shù)的實(shí)現(xiàn)難度大,目 前國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)成功通過(guò)該技術(shù)獲得單抗的研究團(tuán)隊(duì)。 目前大局部炭疽單抗仍然是鼠 源單抗,少數(shù)研究者從大猩猩、 轉(zhuǎn)基因鼠和人體中篩選獲得了炭疽單抗 ,而我國(guó)仍 未見(jiàn)全人源的抗炭疽毒素單抗報(bào)道。鑒于炭疽毒素作用機(jī)制的復(fù)雜性 , 研發(fā)更多的針對(duì)不同中和表位的炭疽全人 源單抗,能夠有效防止炭疽毒素被人為突變帶來(lái)的生物恐怖威脅 , 為炭疽的治療 提供更多項(xiàng)選擇擇。鑒于此,本文目的在于建立流式分選-單細(xì)胞PCR快速高通

4、量的抗 體篩選技術(shù)平臺(tái) , 并通過(guò)該技術(shù)平臺(tái)從重組炭疽保護(hù)性抗原 (protective antigen,PA)疫苗免疫的志愿者體內(nèi)，篩選獲得全人源PA中和抗體,并對(duì)單抗的 親和力、抗原結(jié)合表位、毒素中和機(jī)制、單抗聯(lián)合用藥效果等進(jìn)行深入研究。首先對(duì)一名男性志愿者在第0天和28天兩次免疫了重組PA疫苗,并在第0、 28、35 天采集志愿者血液樣品。為確保能夠在適宜的時(shí)間點(diǎn)采集志愿者陽(yáng)性的 血液樣品,從而提高后續(xù)PA抗體篩選的陽(yáng)性率，本文通過(guò)ELISA和TNA的方法， 對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)血清中PA結(jié)合和中和抗體滴度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果說(shuō)明,免疫第35天血清中PA結(jié)合抗體和中和抗體滴度均明顯升高。同 時(shí), 通過(guò)

5、 ELISpot 的方法, 對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)血液中抗體分泌細(xì)胞的數(shù)量變化進(jìn)行檢 測(cè)。結(jié)果顯示抗PA抗體陽(yáng)性的抗體分泌細(xì)胞占總Ig G陽(yáng)性的抗體分泌細(xì)胞的比 例,從免疫后第28天的0.8%上升至免疫后第35天的23.8%,可見(jiàn)抗PA抗體陽(yáng)性 的抗體分泌細(xì)胞個(gè)數(shù)大幅升高。說(shuō)明重組PA疫苗在志愿者體內(nèi)有效激發(fā)了體液免疫反響 , 在免疫后第 35 天時(shí)體液免疫水平顯著升高 , 為后續(xù)抗體的分選提供保 證。為了實(shí)現(xiàn)單個(gè)B細(xì)胞的分選和抗體基因的單細(xì)胞 PCFT增，我們嘗試了多種細(xì)胞分選和單細(xì)胞PCM方法,在經(jīng)歷屢次失敗后，最終采用流式細(xì)胞分選抗體 分泌細(xì)胞,以及多重引物組合的單細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄-巢式兩步PCR勺方法

6、,成功從人單 個(gè)B細(xì)胞中擴(kuò)增獲得抗體基因。在單細(xì)胞 PCR條件優(yōu)化的過(guò)程中,我們發(fā)現(xiàn)引物 設(shè)計(jì)、酶的種類(lèi)和模板量對(duì)于擴(kuò)增效率的影響較大 , 而退火溫度對(duì)于擴(kuò)增效果影 響甚微。在成功實(shí)現(xiàn)研究中抗體分選的關(guān)鍵性技術(shù) -流式分選單個(gè)抗體分泌細(xì)胞和單 細(xì)胞PCR技術(shù)后,采集了志愿者免疫后第35天的血液樣品,通過(guò)密度梯度沉降法 從血液樣品中別離外周血單個(gè)核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cell,PBMC), 在對(duì)一組抗體分泌細(xì)胞外表特異的白細(xì)胞分化抗原簇 (cluster of differentiation,CD)分子進(jìn)行熒光染色后,通過(guò)流式細(xì)胞分選儀從PBMC中分

7、選獲得2112個(gè)單個(gè)抗體分泌細(xì)胞克隆,通過(guò)單細(xì)胞PCRT增單個(gè)細(xì)胞中的抗體基因。 結(jié)果顯示，529個(gè)單細(xì)胞克隆重鏈和輕鏈同時(shí)擴(kuò)增成功的比率,即單細(xì)胞PCM陽(yáng)性率約為 25%。在硬件條件滿足的情況下 ，僅需 12天即可完成以上單細(xì)胞的分選和抗體基 因擴(kuò)增的過(guò)程。 如果采用傳統(tǒng)的克隆方法 ，構(gòu)建529對(duì)抗體基因的表達(dá)質(zhì)粒 ，非常 耗時(shí)費(fèi)力。為了快速、高通量表達(dá)抗體基因，我們?cè)O(shè)計(jì)了可直接通過(guò)PCF融合啟動(dòng)子、 前導(dǎo)序列、抗體全長(zhǎng)基因、多聚 A尾(poly(A)tail)的線性表達(dá)框。我們對(duì)線性表達(dá)框PCF條件進(jìn)行優(yōu)化，并使用一株對(duì)照抗體驗(yàn)證線性表達(dá)框所表達(dá)抗體的表 達(dá)量和功能。結(jié)果顯示,經(jīng)線性表達(dá)框

8、方法表達(dá)的抗體濃度可達(dá) 0.4卩g/m L,且良好保持 了抗體中和效果 ，能夠滿足后續(xù)抗體篩選實(shí)驗(yàn)的要求 ，通過(guò)我們?cè)O(shè)計(jì)的線性表達(dá)框可在最短 3天內(nèi)表達(dá)供后續(xù)篩選用的抗體。在確保方法的可行性后 ，我們按照 優(yōu)化的重疊延伸PCR條件,構(gòu)建了 529對(duì)抗體重鏈和輕鏈線性表達(dá)框,并將配對(duì)的基因共轉(zhuǎn)染至HEK 293T細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。繼而,通過(guò)ELISA和TNA勺方法對(duì)529株全人源單抗進(jìn)行PA吉合和中和活性 的檢測(cè),并鑒定了單抗的特異結(jié)合的PA結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，我們成功通過(guò)建立的 抗體篩選平臺(tái)技術(shù)獲得34株P(guān)A結(jié)合單抗，其中4株單抗(2A6、4A3 8H6 22F1) 具有PA中和活性。中和單抗22

9、F1與PA不結(jié)合,而是通過(guò)與PA的變構(gòu)體PA63結(jié)合發(fā)揮作用。 另外,研究發(fā)現(xiàn)PA結(jié)合單抗中有一種能夠加速細(xì)胞死亡的毒素增強(qiáng)抗體 (Toxin enhancing m Ab),占PA結(jié)合單抗的比例達(dá) 55.9%之多。為了進(jìn)一步探究PA中和抗體和毒素增強(qiáng)抗體的特性，構(gòu)建4株P(guān)A中和抗體 和1株毒素增強(qiáng)抗體8A7的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染并純化抗體蛋白；并從以下幾個(gè)方面對(duì) 抗體的功能進(jìn)行研究:1)通過(guò)BLI技術(shù)測(cè)定了 5株重點(diǎn)研究的單抗的親和力，結(jié)果 顯示除22F1外單抗親和力均在納摩爾級(jí)；2)測(cè)定4株中和單抗在體內(nèi)和體外的中 和活性, 結(jié)果顯示 4株中和單抗中 22F1 單抗中和活性最強(qiáng) , 其體外保護(hù)效

10、果較上 市PA單抗報(bào)道結(jié)果高出近一個(gè)數(shù)量級(jí)，而單抗2A6僅在體外具有保護(hù)活性；3)鑒 定中和單抗的中和機(jī)制，結(jié)果說(shuō)明8H6單抗對(duì)PA呈現(xiàn)抗體濃度依賴(lài)的酶切抑制作 用,4A3單抗通過(guò)促進(jìn)PA63的降解而抑制PA七聚體形成，4A3這種類(lèi)似酶活作用 的毒素中和機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道，提示本研究可能發(fā)現(xiàn)了一株新中和機(jī)制的 PA中和 單抗。毒素增強(qiáng)單抗8A7能促進(jìn)PA七聚體的形成，并與PA七聚體結(jié)合，提示其毒 素增強(qiáng)作用的可能機(jī)制；4)分析單抗的聯(lián)合用藥效果，結(jié)果說(shuō)明2A6和4A3 8H6 和22F1表現(xiàn)出較弱的協(xié)同作用;2A6和8H6 2A6和22F1表現(xiàn)出無(wú)關(guān)作用；4A3 和8H6 4A3和22F1表現(xiàn)出拮抗作用。而單抗聯(lián)合用藥協(xié)同效果最為顯著的，是毒素增強(qiáng)單抗8A7與僅在體外具有 中和活性的單抗2A6,二者聯(lián)合用藥能夠在體內(nèi)發(fā)揮高水平的毒素中和效果。結(jié) 果提示我們,在人體內(nèi)之所以大量產(chǎn)生毒素增強(qiáng)抗體的可能原因是 ,這種抗體在 血液中能夠輔助其他抗體發(fā)揮良好的機(jī)體保護(hù)效果。并且,8A7單抗針對(duì)的PA結(jié)構(gòu)域3是目前普遍認(rèn)為的PA非中和位點(diǎn)，根據(jù)本 文所得結(jié)果推測(cè)針對(duì)PA結(jié)構(gòu)域3表位的單抗,在人體內(nèi)能夠通過(guò)與其他抗體協(xié)同 發(fā)揮重要的生物學(xué)功能 , 這種輔助性單抗在抗體篩選過(guò)程中容易被遺漏 , 但是其 在“雞尾酒治療中發(fā)揮的重要作用不容無(wú)視。綜上所述 , 本文建立了基于流式