第二張基因工程制藥目的基因的分離

1、1目的基因的分離目的基因的分離2q分離目的基因的方法及原理分離目的基因的方法及原理q目的基因分離方法的選擇原則目的基因分離方法的選擇原則q目的基因的序列測(cè)定目的基因的序列測(cè)定3 cloned dna in vitro第一節(jié)第一節(jié) 分離目的基因的方法及原理分離目的基因的方法及原理145目的基因的來(lái)源目的基因的來(lái)源 7891011121315方法：合成cdna第一鏈 5aaaaaa 3 mrna ttttttt 5 cdna 1 oligo(dt)，反轉(zhuǎn)錄酶 d ntp, 合成cdna第二鏈 aaaaaa 3 cdna 2 ttttttt 5 rnase h，dna聚合酶, dntp 5 aaaa

2、aa 3 雙鏈 cdna 3 ttttttt 51920212223242526232728 293031 （見(jiàn)pcr章）432差示文庫(kù)構(gòu)建流程f細(xì)胞mrna。 f細(xì)胞中特異表達(dá)的cdna文庫(kù)（即差示文庫(kù)）（f細(xì)胞cdna第一鏈）代表f細(xì)胞特異表達(dá)的基因（h細(xì)胞mrna） 。 。 。343536一、根據(jù)獲得目的基因的目的選擇方法一、根據(jù)獲得目的基因的目的選擇方法37二、根據(jù)目的基因的特點(diǎn)選擇方法二、根據(jù)目的基因的特點(diǎn)選擇方法38三、根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和條件選擇方法三、根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備和條件選擇方法39第三節(jié)第三節(jié) 目的基因序列測(cè)定目的基因序列測(cè)定40一、雙脫氧鏈終止法（一、雙脫氧鏈終止法（san

3、gersanger法）法） 41425gagtcacacttgac 3待測(cè)單鏈dna 3ctg 5引物、klenow酶、datp、dgtp、dctp、dttp和少量-32p-datp 加ddatp反應(yīng)3actg 53aactg 53agtgtgaactg 5加ddctp反應(yīng)3cagtgtgaactg 53ctcagtgtgaactg5加ddttp反應(yīng)3tgaactg 53tgtgaactg 53tcagtgtgaactg5加ddgtp反應(yīng)3gaactg 53gtgaactg 53gtgtgaactg5gagtcacactt變性凝膠電泳、放射自顯影 a c t g 5444546n 47 484

4、950二、化學(xué)裂解法（二、化學(xué)裂解法（maxam-gilbertmaxam-gilbert法）法） 原理原理 使特定的堿基首先被化學(xué)修飾，然后再經(jīng)化學(xué)使特定的堿基首先被化學(xué)修飾，然后再經(jīng)化學(xué)處理。如：用硫酸二甲酯使鳥(niǎo)嘌呤甲基化，然處理。如：用硫酸二甲酯使鳥(niǎo)嘌呤甲基化，然后再加哌啶，使甲基化的鳥(niǎo)嘌呤丟失，后再加哌啶，使甲基化的鳥(niǎo)嘌呤丟失，dnadna鏈鏈從鳥(niǎo)嘌呤修飾處后的從鳥(niǎo)嘌呤修飾處后的33，5-5-磷酸二酯鍵斷裂。磷酸二酯鍵斷裂。51 自動(dòng)測(cè)序儀基于自動(dòng)測(cè)序儀基于2 2，3-3-雙脫氧末端終止法的原理，雙脫氧末端終止法的原理，標(biāo)記系統(tǒng)由放射性核素改為發(fā)特定熒光信號(hào)的熒光標(biāo)記系統(tǒng)由放射性核素改為發(fā)特定熒光信號(hào)的熒光染料，預(yù)先將四種熒光染料與四種雙脫氧核苷三磷染料，預(yù)先將四種熒光染料與四種雙脫氧核苷三磷酸共價(jià)相連，使其帶有不同的熒光標(biāo)記。當(dāng)某一種酸共價(jià)相連，使其帶有不同的熒光標(biāo)記。當(dāng)某一種ddntpddntp摻入到正在合成的摻入到正在合成的dnadna單鏈分子中時(shí)，該單鏈分子中時(shí)，該鏈的延伸便終止并帶有相應(yīng)的熒光染料。鏈的延伸便終止并帶有相應(yīng)的熒光染料。 自動(dòng)測(cè)序系統(tǒng)包括電泳分離系統(tǒng)、熒光檢測(cè)裝自動(dòng)測(cè)序系統(tǒng)包括電泳分離系統(tǒng)、熒光檢測(cè)裝置、計(jì)算機(jī)