mRNA提取注意事項(xiàng)

1、q異硫氰酸胍異硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 原理：原理：細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變細(xì)胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時(shí)核蛋白體上的蛋白變性，核酸釋放；性，核酸釋放；釋放出來(lái)的釋放出來(lái)的dnadna和和rnarna由于在特定由于在特定phph下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體下溶解度的不同而分別位于整個(gè)體系中的中間相和水相，從而得以分離；系中的中間相和水相，從而得以分離；有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈有機(jī)溶劑抽提，沉淀，得到純凈rnarna。 q異硫氰酸胍異硫氰酸胍/ /苯酚法苯酚法 步驟步驟: :材料準(zhǔn)備：材料準(zhǔn)備：盡量新鮮。盡量新鮮。裂解變性裂解變性：異硫氰酸

2、胍異硫氰酸胍（亞硫氫胍，巰基乙醇，亞硫氫胍，巰基乙醇，n-n-月桂肌氨酸等）。月桂肌氨酸等）。 使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放使細(xì)胞及核蛋白復(fù)合物變性，釋放rnarna，有效抑制核酸酶。，有效抑制核酸酶。純化分離：純化分離：苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚苯酚，氯仿，異戊醇。苯酚/ /氯仿可抽提去除雜物。氯仿可抽提去除雜物。洗滌：洗滌：7070乙醇。乙醇。沉淀：沉淀：異丙醇、無(wú)水乙醇。異丙醇、無(wú)水乙醇。 乙酸鈉（乙酸鈉（ph4.0ph4.0）：維持變性的細(xì)胞裂解液的）：維持變性的細(xì)胞裂解液的phph值，沉淀值，沉淀rnarna。 此外還常用氯化鋰選擇沉淀此外還常用氯化鋰選擇沉淀rnarna。rna提取

3、的通用方法q 材料材料：新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料新鮮，切忌使用反復(fù)凍融的材料如若材料來(lái)源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘⒉牧先缛舨牧蟻?lái)源困難，且實(shí)驗(yàn)需要一定的時(shí)間間隔?？梢韵葘⒉牧腺A存在貯存在trizoltrizol或樣品貯存液中，于或樣品貯存液中，于7070或或2020保存保存如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存如要多次提取，請(qǐng)分成多份保存液氮長(zhǎng)期保存，液氮長(zhǎng)期保存，7070短期保存短期保存q 樣品破碎及裂解樣品破碎及裂解：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：根據(jù)不同材料選擇不同的處理方法：培養(yǎng)細(xì)胞：培養(yǎng)細(xì)胞：通?？芍苯蛹恿呀庖毫呀馔ǔ？芍苯蛹恿呀庖毫呀饨湍负图?xì)菌：酵母和細(xì)菌：一般一般tri

4、zoltrizol可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先可直接裂解，對(duì)于一些特殊的材料可先用酶或者機(jī)械方法破壁用酶或者機(jī)械方法破壁動(dòng)植物組織：動(dòng)植物組織：先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快先液氮研磨和勻漿，后加裂解液裂解。期間動(dòng)作快速，樣品保持冷凍速，樣品保持冷凍樣品量適當(dāng)，保證充分裂解樣品量適當(dāng)，保證充分裂解為減少為減少dnadna污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量污染，可適當(dāng)加大裂解液的用量q 純化：純化：在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；在使用氯仿抽提純化時(shí)，一定要充分混勻，且動(dòng)作快速；經(jīng)典的純化方法，如經(jīng)典的純化方法，如 licl licl 沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間

5、長(zhǎng)，沉淀等，雖然經(jīng)濟(jì)，但操作時(shí)間長(zhǎng)，易造成易造成 rna rna 降解；降解；柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響柱離心式純化方法：抽提速度快，能有效去除影響 rna rna 后續(xù)酶反后續(xù)酶反應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。應(yīng)的雜質(zhì)，是目前較為理想的選擇。影響rna提取的因素rna提取常見(jiàn)問(wèn)題q rna rna 的降解的降解 q odod260260 /od /od280280 比值偏低比值偏低q 電泳帶型異常電泳帶型異常q 下游實(shí)驗(yàn)效果不佳下游實(shí)驗(yàn)效果不佳rna降解q 新鮮細(xì)胞或組織：新鮮細(xì)胞或組織： 裂解液的質(zhì)量裂解液的質(zhì)量 外源外源rnasernase的污染的污染 裂解液的用量不

6、足裂解液的用量不足 組織裂解不充分組織裂解不充分 另外某些富含內(nèi)源酶的樣品另外某些富含內(nèi)源酶的樣品 ( (如脾臟，胸腺等如脾臟，胸腺等) )，很，很難避免難避免 rna rna 的降解。的降解。 建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更建議在液氮條件下將組織碾碎，并且勻漿時(shí)使用更多裂解液多裂解液。rna降解q 冷凍樣品：冷凍樣品： 樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至-70-70冰箱保存。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)；冰箱保存。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)； 先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；先用液氮研磨，再加裂解液勻漿； 樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必

7、須樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。預(yù)冷，碾磨過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。od260 /od280 比值偏低q 蛋白質(zhì)污染：蛋白質(zhì)污染：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。層的離心力和時(shí)間要足夠。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底解決辦法解決辦法: :重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。q 苯酚殘留：苯酚殘留：不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心分不要吸入中間層及有機(jī)相，加入氯仿后首先混勻，并且離心

8、分層的離心力和時(shí)間要足夠。層的離心力和時(shí)間要足夠。解決辦法解決辦法: :重新抽提一次，再沉淀，溶解。重新抽提一次，再沉淀，溶解。od260 /od280 比值偏低q 抽提試劑殘留：抽提試劑殘留：確保洗滌時(shí)要徹底懸浮確保洗滌時(shí)要徹底懸浮 rnarna，并且徹底去掉，并且徹底去掉 75% 75% 乙醇。乙醇。解決辦法解決辦法: :再沉淀一次后，溶解。再沉淀一次后，溶解。q 設(shè)備限制：設(shè)備限制：測(cè)定測(cè)定od260 od260 及及od280 od280 數(shù)值時(shí)，要使數(shù)值時(shí)，要使od260 od260 讀數(shù)在讀數(shù)在 0.10 - 0.50 0.10 - 0.50 之間。此范圍線性最好。之間。此范圍線性

9、最好。q 用水稀釋樣品：用水稀釋樣品：測(cè)測(cè) od od 時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用 10 mm tris10 mm tris，ph 7.5ph 7.5。用。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。水作為稀釋液將導(dǎo)致比值的降低。 電泳帶型異常q 非變性電泳：非變性電泳： 上樣量超過(guò)上樣量超過(guò) 3ug，電壓超過(guò)，電壓超過(guò) 6v/cm，電泳緩沖液陳舊，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致均可能導(dǎo)致 28s 和和 18s 條帶分不開。條帶分不開。q 變性電泳條帶變淡：變性電泳條帶變淡： eb 與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電

10、泳要淡一些；變性電泳比非變性電泳要淡一些； 甲醛的質(zhì)量不高甲醛的質(zhì)量不高 。下游實(shí)驗(yàn)效果不佳q rna rna 降解降解 q 抽提試劑的殘留抽提試劑的殘留 75% 75% 乙醇洗滌乙醇洗滌 q 樣品中雜質(zhì)的殘留樣品中雜質(zhì)的殘留 多糖等雜質(zhì)，再次沉淀多糖等雜質(zhì)，再次沉淀 q dna dna 污染污染 使用使用rnase-free rnase-free 的的 dnase i dnase i 消化抽提消化抽提rna rna rt常見(jiàn)問(wèn)題分析和解決方案問(wèn)題一：?jiǎn)栴}一：少量或沒(méi)有少量或沒(méi)有rt-pcr產(chǎn)物產(chǎn)物rnarna降解降解分離無(wú)污染，高質(zhì)量的分離無(wú)污染，高質(zhì)量的rnarna；防止；防止rnarna

11、降解降解rnarna中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑中含逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑7070（v/vv/v）乙醇清洗）乙醇清洗rnarna沉淀，除去抑制劑沉淀，除去抑制劑起始起始rnarna量太低量太低增加增加rnarna的量的量 多糖同多糖同rnarna共沉淀共沉淀用氯化鋰沉淀用氯化鋰沉淀rnarna以除去多糖以除去多糖合成合成cdnacdna第一鏈合成的引第一鏈合成的引物退火失敗物退火失敗確定退火溫度適合所用的引物確定退火溫度適合所用的引物rnarna模板存在較多二級(jí)結(jié)模板存在較多二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)將將rnarna和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性和引物在不含鹽及緩沖液條件下變性/ /退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溫度退火，提高逆轉(zhuǎn)錄反

12、應(yīng)溫度反轉(zhuǎn)錄成功，反轉(zhuǎn)錄成功，pcrpcr失敗失敗pcrpcr步驟中使用超過(guò)步驟中使用超過(guò)1/51/5的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物可能原因可能原因解決方案解決方案rt常見(jiàn)問(wèn)題分析和解決方案問(wèn)題二：?jiǎn)栴}二：有非特異性帶有非特異性帶q 引物和模板的非特異性退火引物和模板的非特異性退火 q 基因特異性引物設(shè)計(jì)較差基因特異性引物設(shè)計(jì)較差 q rna中有基因組中有基因組dna的污染的污染 q 形成引物二聚體形成引物二聚體 q 鎂離子濃度太高鎂離子濃度太高 提高反應(yīng)的溫度和特異性提高反應(yīng)的溫度和特異性 提高引物的特異性提高引物的特異性 使用擴(kuò)增級(jí)使用擴(kuò)增級(jí)dnasednase處理處理rna rna 設(shè)計(jì)在設(shè)計(jì)在33端沒(méi)有互補(bǔ)序列的引物端沒(méi)有互補(bǔ)序列的引物 優(yōu)化鎂離子濃度優(yōu)化鎂離子濃度 可能原因可能原因解決方案解決方案rt常見(jiàn)問(wèn)題分析和解決方案問(wèn)題三：?jiǎn)栴}三：產(chǎn)生彌散（產(chǎn)生彌散（smear）條帶）條帶 q 第一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高第一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高 q pcrpcr反應(yīng)中引物過(guò)多反應(yīng)中