免疫熒光技術(shù)2

1、免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence technique,IFA)immunofluorescence technique,IFA) 實驗實驗1301班班 楊小玉楊小玉主要內(nèi)容一.免疫熒光技術(shù)概念 原理二.免疫熒光技術(shù)的基本條件三.經(jīng)典熒光抗體染色法四.現(xiàn)代免疫熒光技術(shù)一一. .免疫熒光技術(shù)的概念及原理免疫熒光技術(shù)的概念及原理 概念：免疫熒光技術(shù)是將熒光素的敏感可測性,抗原抗體反應(yīng)的可測性以及顯微技術(shù)高度精確性相結(jié)合的一種免疫標(biāo)記測定技術(shù)。 免疫熒光技術(shù)原理 免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原

2、）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。 在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。二二. .免疫熒光技術(shù)的基本條件免疫熒光技術(shù)的基本條件（一）熒光素（二）待標(biāo)記抗體的標(biāo)準(zhǔn)（三）熒光標(biāo)記抗體的制備（四）熒光標(biāo)記抗體的純化與鑒定（一）熒光素（一）熒光素:一種有機(jī)或無機(jī)的化學(xué)物質(zhì)，其接受激發(fā)光的光能以后，能夠以發(fā)射光形式產(chǎn)生明亮的熒光而作為染料使用。各種熒光素都有各自的激發(fā)波長和發(fā)射波長。因發(fā)射波長不同，熒光顏

3、色各異。熒光素及其性質(zhì)：熒光素具有共軛雙鍵體系的化學(xué)結(jié)構(gòu)。熒光素通常處于最低的能量狀態(tài)，稱為基態(tài)（ground state)。當(dāng)熒光素受到紫外光或可見光的短波部分（紫光和藍(lán)光）作為激發(fā)光照射時，會吸收合適波長的電磁波，其外層 電子即進(jìn)入更高能量的軌道，從而處于激發(fā)態(tài)（excited state)。熒光素的熒光特性： （1）停止供能，熒光現(xiàn)象隨即終止 （2）對光的吸收和熒光的發(fā)射具高度選擇性入射光波長發(fā)射光波長 （3）熒光效率：熒光效率=發(fā)射熒光的光量子數(shù) /吸收光的光量子數(shù) （4）熒光猝滅現(xiàn)象：熒光素的輻射能力減弱常見熒光素： 1）異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocya

4、nate, FITC) ：FITC純品為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水和酒精溶劑。有兩種異構(gòu)體，其中異構(gòu)體型在效率、穩(wěn)定性與蛋白質(zhì)結(jié)合力等方面都更優(yōu)良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長為520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗干燥處可保存多年，是目前應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。 （2）四乙基羅丹明 (rhodamine, RB200) ：RB200為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮，性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。最大吸收光波長為 570nm，最大發(fā)射光波長為595600nm，呈現(xiàn)

5、橘紅色熒光。 （3）四甲基異硫氰酸羅丹明 (tetramethyl rhodamine isothiocynate, TRITC)：TRITC為羅丹明的衍生物，呈紫紅色粉末，較穩(wěn)定。最大吸收光波長為 550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈現(xiàn)橙紅色熒光，與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。因其熒光淬滅慢，也可用于單獨?biāo)記染色。 （5）藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）：PE是在紅藻中所發(fā)現(xiàn)的一種可進(jìn)行光合作用的自然熒光色素，分子量為240kD的蛋白，最大吸收峰為564 nm，當(dāng)使用488 nm激光激發(fā)時其發(fā)射熒光峰值約為576 nm，對于單激光器的流式

6、細(xì)胞儀來說，推薦使用58521nm的帶通濾光片，雙激光器的流式細(xì)胞儀推薦使用57513nm的帶通濾光片。FL2探測器檢測PE。 常見熒光素的特性： FITC：黃色結(jié)晶粉末，吸收光：490495nm，發(fā)射光520530nm，明亮的黃綠色熒光。 RB200：橘紅色粉末, 吸收光570nm，發(fā)射光595600nm，橘紅色熒光。 TRITC：紫紅色粉末，吸收550nm，發(fā)射光620nm，橙紅色熒光。 PE：吸收光490560nm，發(fā)射光595nm，紅色熒光。FITC 呈黃綠色熒光RB200 呈橘紅色熒光色FITC+RB200 雙標(biāo)記染色法合適熒光素的選擇： （1）具有與蛋白質(zhì)形成共價鍵的化學(xué)基團(tuán)。 （

7、2）熒光效率高，標(biāo)記后下降不明顯。 （3）熒光色澤與背景色澤對比鮮明。 （4）標(biāo)記后能保持生物學(xué)活性和免疫活性 （5）標(biāo)記方法簡單、快速。 （6）安全無毒（二）待標(biāo)記抗體的標(biāo)準(zhǔn) 用于標(biāo)記的抗體須特異性強(qiáng)，純度高，效價高，經(jīng)熒光素標(biāo)記后抗體活性損失少。標(biāo)記前，可用梅花狀瓊脂雙向擴(kuò)散法測定抗體效價，即中央孔加抗原（1mg/ml),周圍孔加倍比稀釋的抗體（1：21：64），抗體效價在1：32以上較為理想。熒光標(biāo)記的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體，亦可以是SPA，后者可作為熒光二抗的通用試劑。（三）熒光標(biāo)記抗體的制備1.FITC標(biāo)記抗體2.RB200標(biāo)記抗體3.TRITC標(biāo)記抗體4.PE標(biāo)記抗體（1

8、）攪拌標(biāo)記法）攪拌標(biāo)記法（2）半透膜透析標(biāo)記法）半透膜透析標(biāo)記法（1）PE巰基化巰基化（2）IgG與與PE交聯(lián)交聯(lián)（3）殘余巰基的封閉）殘余巰基的封閉（4）透析平衡）透析平衡（四）熒光標(biāo)記抗體的純化與鑒定 熒光標(biāo)記抗體的純化 熒光標(biāo)記抗體的鑒定 熒光標(biāo)記物的保存（1）去除游離熒光素）去除游離熒光素（2）去除未標(biāo)記和過度標(biāo)記的抗體）去除未標(biāo)記和過度標(biāo)記的抗體（1）抗體和）抗體和熒光的活性鑒定熒光的活性鑒定（2）熒光素與蛋白質(zhì)的摩爾比值）熒光素與蛋白質(zhì)的摩爾比值（F/P）（3）熒光抗體濃度的測定）熒光抗體濃度的測定（4）熒光抗體特異性的鑒定）熒光抗體特異性的鑒定（1）經(jīng)鑒定合格的熒光抗體，可過濾除

9、菌，也）經(jīng)鑒定合格的熒光抗體，可過濾除菌，也可加入防腐劑（可加入防腐劑（0.01%硫柳汞或硫柳汞或0.1%NaN3）或抗）或抗生素防腐生素防腐（2）熒光抗體經(jīng)無菌，小量分裝后置）熒光抗體經(jīng)無菌，小量分裝后置04可?？杀４娲?年左右，年左右，-20可保存可保存23年，冷凍干燥后可保年，冷凍干燥后可保存較長時間。存較長時間。（3）冷凍取出后應(yīng)快速融化，并避免反復(fù)凍融）冷凍取出后應(yīng)快速融化，并避免反復(fù)凍融。三三. .經(jīng)典熒光抗體染色法經(jīng)典熒光抗體染色法一.直接熒光抗體染色法二.間接熒光抗體染色法三.補(bǔ)體熒光染色法四.特殊染色法一.直接熒光抗體染色法 概念：將熒光素標(biāo)記的特異性抗體直接滴加于待檢標(biāo)本片

10、上，避光反應(yīng)和洗滌以后，在熒光顯微鏡下觀察標(biāo)本中是否有相應(yīng)抗原存在。這是熒光抗體技術(shù)最簡單，最基本的方法。二.間接熒光抗體染色法 概念：將熒光素標(biāo)記于抗抗體（熒光二抗）或標(biāo)記葡萄球菌A蛋白（SPA），以熒光二抗檢測與抗原結(jié)合的特異性抗體。 檢測過程： 第一步：將第一抗體加在含有抗原的標(biāo)本上，避光孵育一定時間以后，洗去未結(jié)合的抗體。 第二步：將熒光二抗加在標(biāo)本上，與結(jié)合在抗原上的抗體（一抗）結(jié)合，形成“抗原抗體熒光二抗”的復(fù)合物三.補(bǔ)體熒光染色法 概念：將熒光素標(biāo)記在抗補(bǔ)體抗體（抗C3抗體），檢測抗原抗體復(fù)合物。此法是間接法的一種改良，利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理，在抗原抗體反應(yīng)時加入補(bǔ)體（多用豚鼠補(bǔ)體），再用熒光素標(biāo)記的抗C3抗體進(jìn)行示蹤。主要用于檢測抗體。 檢測過程分兩步： 第一步：將待測抗體和補(bǔ)體加在已知抗原的玻片上，作用一段時間后，洗去未結(jié)合的抗體和補(bǔ)體。 第二步：滴加熒光標(biāo)記抗C3抗體。如果在第一步中抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，則補(bǔ)體被固定，此時加入的標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體即與補(bǔ)體發(fā)生結(jié)合，形成“抗原抗體