熒光定量PCR在臨床醫(yī)學中的應用

1、熒光定量PCR在臨床醫(yī)學中的應用內容提要一、基因診斷技術簡介一、基因診斷技術簡介二、乙型肝炎的病原檢測二、乙型肝炎的病原檢測三、丙型肝炎的病原檢測三、丙型肝炎的病原檢測四、性病相關病原體的檢測四、性病相關病原體的檢測基因診斷技術簡介4 基因診斷3 免疫學診斷臨床診斷細胞膜細胞核DNA轉錄 mRNA翻譯蛋白質1 形態(tài)學診斷2 生化診斷概念PCR與基因診斷技術l基因診斷即通過核酸的分子生物學檢測直接檢測基因的存在狀態(tài)或缺陷對疾病作出診斷的方法。lPolymerase chain reaction(PCR)，聚合酶鏈式反應，是一種DNA的快速擴增技術。PCR技術通過兩個短的稱為引物的DNA小片段和一

2、種耐熱酶的作用，可在3個小時內把特定的DNA片段擴增1000萬倍。 l九十年代中期PCR臨床應用在國內全面開展，1998年，熒光定量PCR技術開始在中國應用于臨床檢測。熒光定量PCR技術l實時熒光定量PCR技術，是指在反應體系中加入熒光標記，利用熒光信號積累實時檢測整個PCR過程，通過標準曲線對PCR終產(chǎn)物的分析，最終實現(xiàn)對未知的起始模版進行定量分析的一種技術，是迄今對已知基因序列的核酸測定中最靈敏的方法。熒光染料：SYBR Green I、EVA Green熒光探針：TaqMan、 Hybridization Probes 、Molecular Beacon熒光定量PCR技術的優(yōu)點l特異性強

3、：直接擴增病原體的特異DNA或異常基因片段l靈敏度高：可檢測到極少量的DNA，有效降低漏診率l高效省時：擴增周期短，有利于快速診斷l(xiāng)取材范圍廣：血清、痰液、體液、毛發(fā)等多種樣本l全封閉反應：無需PCR后處理，降低污染l定量準確：利用標準曲線法，采用對數(shù)期分析l自動化程度高：操作安全，避免人為判斷RocheLightCycler熒光定量PCR技術的臨床應用l病毒性肝炎（HBV、HBV-YMDD、HCV）的基因檢測l性病相關病原體（CT、NG、UU、HPV）的基因檢測l優(yōu)生優(yōu)育項目診斷：人巨細胞病毒（HCMV）、單純皰疹病毒II型（HSV）、弓形蟲（TOX）、風疹病毒l其它病原體檢測：結核桿菌、肺

4、炎支原體、EB病毒、傷寒桿菌、幽門螺旋桿菌等乙型肝炎的病原檢測乙肝病毒乙肝病毒 HBV的感染過程的感染過程乙肝如何傳染？慢性HBV感染病毒持續(xù)病毒持續(xù)6個月未被清除者個月未被清除者l免疫耐受期：HBV復制活躍l免疫清除期l非活動或低復制期慢性乙型肝炎lHBeAg陽性慢性乙型肝炎lHBeAg陰性慢性乙型肝炎乙型肝炎肝硬化l代償期肝硬化l失代償期肝硬化HBsAg與抗HBslHBsAg在感染在感染HBV兩周后即可陽性。只要兩周后即可陽性。只要HBsAg陽陽性就可診斷性就可診斷HBV感染，陰性則不能排除感染，陰性則不能排除HBV感染。感染。l抗抗HBs為保護性抗體，陽性表示對為保護性抗體，陽性表示對H

5、BV有免疫力。有免疫力。HBsAg和抗和抗HBs同時陰性：同時陰性： 即所謂窗口期，此時即所謂窗口期，此時HBsAg和抗和抗HBs都未產(chǎn)生。都未產(chǎn)生。HBsAg和抗和抗HBs同時陽性：同時陽性： HBV感染恢復期，此時感染恢復期，此時HBsAg未消失，抗未消失，抗HBs已已產(chǎn)生?；蛘呤莵喰透腥?。產(chǎn)生?；蛘呤莵喰透腥尽?為什么HBsAg陰性不能排除HBV感染？l窗口期窗口期l檢測試劑不夠靈敏檢測試劑不夠靈敏l隱匿性慢性乙肝（隱匿性慢性乙肝（S S基因變異）基因變異）l重疊重疊HCVHCV感染（干擾感染（干擾HBsAgHBsAg合成）合成）抗HBs陽性就萬無一失了嗎？單一抗單一抗HBsHBs陽性陽

6、性HBV DNAHBV DNA檢出率檢出率0-11.8%0-11.8%l先后感染了不同的先后感染了不同的HBVHBV亞型亞型lHBVHBV病毒病毒S S基因變異基因變異如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染？l提高提高檢測敏感性檢測敏感性l采用針對變異抗原的檢測試劑采用針對變異抗原的檢測試劑lHBV DNAHBV DNA的檢測！的檢測！HBeAg與抗HBelHBeAg的存在表示病毒復制活躍且有較強的的存在表示病毒復制活躍且有較強的傳染性。傳染性。HBeAg消失而抗消失而抗HBe產(chǎn)生稱為血清產(chǎn)生稱為血清轉換。抗轉換?？笻Be陽轉后，病毒復制水平低，傳染陽轉后，病毒復制水平低，傳染性降低。性降低。

7、l但長期抗但長期抗HBe陽性者并不代表病毒復制停止或陽性者并不代表病毒復制停止或無傳染性，研究顯示無傳染性，研究顯示20%50%仍可檢測到仍可檢測到HBV DNA，部分可能由于前，部分可能由于前C區(qū)基因變異，區(qū)基因變異，導致不能形成導致不能形成HBeAg。HBeAg與抗HBe共存？l處于血清轉換過程中處于血清轉換過程中l(wèi)野生株與變異株同時存在野生株與變異株同時存在HBeAg水平與HBV DNA的關系lHBeAgHBeAg陽性標本陽性標本HBV DNAHBV DNA檢出率檢出率9090左右左右lHBeAgHBeAg與與HBV DNAHBV DNA有著良好的相關性有著良好的相關性HBeAg陰性/抗

8、HBe陽性/HBV DNA陽性HBV DNA水平一般較低水平一般較低lHBVHBV低水平復制低水平復制lHBVHBV病毒前病毒前C C區(qū)基因變異區(qū)基因變異l重疊重疊HCVHCV感染感染“兩對半”缺陷l“兩對半”是HBV DNA 是病毒復制和傳染性的直接標志。是病毒復制和傳染性的直接標志。HBV DNA定量對于判斷病毒復制程度、傳染性大定量對于判斷病毒復制程度、傳染性大小、病毒藥物療效等有重要意義。小、病毒藥物療效等有重要意義。HBV DNA拷貝數(shù)乙肝病毒載量拷貝數(shù)乙肝病毒載量HBV DNA檢測的臨床意義lHBV DNAHBV DNA是是HBVHBV存在最直接的依據(jù)存在最直接的依據(jù)lHBV DN

9、AHBV DNA是是HBVHBV復制的標志復制的標志lHBV DNAHBV DNA是患者具有傳染性的標志是患者具有傳染性的標志lHBV DNAHBV DNA對乙肝兩對半起補充作用對乙肝兩對半起補充作用lHBV DNAHBV DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標lHBV DNAHBV DNA可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎可檢測出隱匿性慢性乙型肝炎提供直接證據(jù)縮短提供直接證據(jù)縮短“窗口期窗口期”PCRPCR檢測檢測“窗口期窗口期”核酸檢測縮短的核酸檢測縮短的“窗口期窗口期”的天數(shù)的天數(shù)HBVHBV56566-156-15HCVHCV707041-604

10、1-60HIVHIV222210-1510-15有利于獻血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷有利于獻血員窗口期病毒核酸的篩查和早期診斷HBV DNA檢測的臨床意義HBV DNA檢測的臨床意義 調查表明并不是所有調查表明并不是所有“大三陽大三陽”的病人的病人都處于都處于HBV復制期，具有傳染性；也不是所復制期，具有傳染性；也不是所有有“小三陽小三陽”的病人的病人HBV都無復制。因此，都無復制。因此，要準確知道要準確知道HBV是否處于復制狀態(tài)，最準確是否處于復制狀態(tài)，最準確的方法還是通過檢測的方法還是通過檢測HBV DNA來決定。來決定。HBV DNA檢測方法l斑點雜交（基本淘汰）斑點雜交（基本淘汰

11、）l定性定性PCR（基本淘汰）（基本淘汰）l熒光定量熒光定量PCR（主流）（主流）l基因芯片（將來？）基因芯片（將來？）為什么建議病人要進行HBV DNA檢測？熒光定量PCR方法檢測HBV感染的各期血清標本Copies/mlHBeAg陽性慢性乙型肝炎病人8.3 x 108經(jīng)干擾素治療后HBeAg轉陰6.2 x 103非活動性HBsAg攜帶者血清5.6 x 103原先血中HBV DNA陽性，已痊愈超過12個月的血清103HBsAg和HBeAg均陽性而HBV DNA陰性？l干擾素或拉米夫定等治療后病毒復制受抑制。干擾素或拉米夫定等治療后病毒復制受抑制。lPCR所用引物相應的所用引物相應的DNA序列

12、發(fā)生突變，此序列發(fā)生突變，此引物與突變引物與突變DNA不能配對結合。不能配對結合。l病毒病毒DNA整合于宿主肝細胞染色體而血中游整合于宿主肝細胞染色體而血中游離離HBV DNA很少或缺乏。很少或缺乏。乙肝的治療l目前尚無一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，目前尚無一種能迅速、直接殺死清除乙肝病毒的藥物，最好的抗病毒藥物療效也僅能達到最好的抗病毒藥物療效也僅能達到5050左右。左右。l目前國際醫(yī)學界公認的治療慢性乙肝有確切療效的抗目前國際醫(yī)學界公認的治療慢性乙肝有確切療效的抗病毒藥物主要有兩大類：病毒藥物主要有兩大類： 干擾素：重組人干擾素：重組人-1b-1b干擾素、干擾素、- 2a- 2a

13、、 -2b-2b干擾素等。干擾素等。核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。核苷類似物：拉米夫定、阿德福韋。乙肝的治療主要包括抗病毒、免疫調節(jié)、抗炎保肝、抗纖維化等對于HBV DNA105的患者應進行抗病毒治療拉米夫定l可迅速降低HBV DNAHBV DNA的濃度，改善肝臟組織的病變，還可能阻斷肝纖維化的進程，終止肝硬化的發(fā)展。l尤其是拉米夫定不受病毒感染的模式、野生型或基因組前C區(qū)突變的影響。l此外拉米夫定還能抑制肝移植受體和AIDSAIDS病人體內的HBVHBV復制。拉米夫定治療人群l有明顯HBV DNA復制者l前C區(qū)變異的慢性乙型肝炎l代償期的慢性乙型肝炎l接受肝臟移植的患者l干擾素治療失敗拉米

14、夫定治療效果l絕大多數(shù)患者絕大多數(shù)患者HBV DNAHBV DNA水平顯著下降。水平顯著下降。l用藥用藥4 4周開始下降，周開始下降，1212至至1616周約半數(shù)以上的病周約半數(shù)以上的病例血清例血清HBV DNAHBV DNA降到可檢測水平以下。降到可檢測水平以下。l治療治療1 1年后年后HBeAgHBeAg陰轉率約為陰轉率約為20%20%。l病毒學應答：HBV DNA低于檢測下限l血清學應答l生化學應答l組織學應答應用抗病毒藥物后如何判斷療效？應用抗病毒藥物后如何判斷療效？l治療結束時治療結束時完全應答完全應答l隨訪隨訪1 1年年持續(xù)應答持續(xù)應答l無應答無應答YMDD變異lYMDDYMDD：

15、酪氨酸蛋氨酸天門冬氨酸天：酪氨酸蛋氨酸天門冬氨酸天 門冬氨酸門冬氨酸l蛋氨酸（蛋氨酸（M M）突變?yōu)楫惲涟保ǎ┩蛔優(yōu)楫惲涟保↖ I）或纈氨酸（）或纈氨酸（V V）形成形成YIDDYIDD變異株或變異株或YVDDYVDD變異株變異株 。抗病毒治療中存在的問題HBV-YMDD變異檢測的臨床意義l動態(tài)檢測動態(tài)檢測：服用拉米夫定：服用拉米夫定3個月開始，每月個月開始，每月 檢測檢測1次次l提前發(fā)現(xiàn)提前發(fā)現(xiàn)：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前：可在耐藥臨床表現(xiàn)發(fā)生前1-4個個 月檢測出突變株月檢測出突變株l及時調整及時調整：適時調整用藥方案，防止因耐：適時調整用藥方案，防止因耐 藥而導致病情惡化藥而導致病情惡化丙型

16、肝炎的病原檢測丙肝病毒lHCV是單鏈RNA病毒l主要通過血液和血制品傳播l感染后易轉變?yōu)槁愿窝谆虬l(fā)展為肝硬化、肝癌l呈全球性分布，約1%普通人群感染抗HCV IgM和抗HCV IgGlHCV抗體不是保護性抗體，是存在HCV感染的標志。l抗HCV IgM在發(fā)病后即可檢測到，一般持續(xù)13個月。l如果抗HCV IgM持續(xù)陽性，提示病毒持續(xù)復制，易轉為慢性。l低滴度抗HCV IgG提示病毒處于靜止狀態(tài)，高滴度提示病毒復制活躍。HCV抗原檢測的困難lHCVHCV在血液中含量極低，僅為在血液中含量極低，僅為HBVHBV的的1%1%lHCVHCV病毒顆粒很難有效地分離純化、人工合成抗原病毒顆粒很難有效地分

17、離純化、人工合成抗原l丙型肝炎的窗口期很長，血清學檢測無法早期診斷丙型肝炎的窗口期很長，血清學檢測無法早期診斷l(xiāng)抗體持續(xù)性存在，無法提示正確的病毒載量抗體持續(xù)性存在，無法提示正確的病毒載量lHCVHCV的型別復雜，高突變率的型別復雜，高突變率lHCVHCV核心抗原檢測試劑盒敏感性差：核心抗原檢測試劑盒敏感性差：45.68%45.68%HCV RNA HCV RNA陽性是病毒感染和復制的直接標志。陽性是病毒感染和復制的直接標志。HCV RNA的定量測定有助于了解病毒復制程度、抗的定量測定有助于了解病毒復制程度、抗病毒治療的選擇及療效評估等。病毒治療的選擇及療效評估等。HCV RNA熒光定量PCR

18、檢測的臨床意義l早期診斷：在免疫學檢測的“窗口期”或一部分不產(chǎn)生抗體的丙肝病毒攜帶者，都可出現(xiàn)HCV RNA陽性，抗HCV陰性的檢測結果。l彌補ELISA方法的高漏檢率,HCV RNA可作為HCV感染診斷的指標。lHCV RNA定量可指導用藥，為療效觀察及預后判斷提供客觀指標?？笻CV不能作為抗病毒療效的指標。l慢性丙型肝炎長期抗HCV陽性，這只表示曾經(jīng)感染了丙肝病毒并出現(xiàn)了相應的免疫應答，并不代表體內仍有丙肝病毒的存在或復制，這時只能通過HCV RNA定量檢測鑒別丙肝病毒的活動性和復制程度。lHCV主要通過輸血和血制品傳播，對獻血員及血制品進行檢測，以減少醫(yī)源性丙型肝炎的發(fā)生和傳播。核酸檢測

19、在核酸檢測在HCV感染的診斷中要比感染的診斷中要比HBV感染的診斷重要得多！感染的診斷重要得多！性病相關病原體的檢測 性病在我國已成為性病在我國已成為一個重要的公共衛(wèi)生問一個重要的公共衛(wèi)生問題，自題，自9999年以來，性病年以來，性病的發(fā)生率居高不下，其的發(fā)生率居高不下，其發(fā)病率在傳染性疾病中發(fā)病率在傳染性疾病中位居第位居第3 3位，位，0303年我國累年我國累計報道性病病例數(shù)（計報道性病病例數(shù)（HIV除外）除外）7373萬。浙江省為萬。浙江省為高發(fā)區(qū)，位居全國第三。高發(fā)區(qū)，位居全國第三。常見性傳播疾病病原體l淋病雙球菌(NG)l沙眼衣原體(CT)l解脲支原體(UU)l人類乳頭瘤病毒(HPV)

20、l人類免疫缺陷病毒(HIV)淋病雙球菌的傳統(tǒng)檢測方法l涂片染色：對于女性患者檢出率低，易出現(xiàn)假陰性l分離培養(yǎng)：培養(yǎng)較困難，生化鑒定復雜，時間長lELISA抗原檢測法：存在交叉反應，非特異反應較嚴重熒光定量PCR檢測NG的優(yōu)勢l可在短時間內快速、準確地直接從臨床各種標本中檢出含量極低的病原菌l對女性疑似淋球菌引起的各種炎癥的診斷及鑒別診斷起決定性作用l對癥狀輕者或無癥狀的淋球菌感染者做到早期診斷和鑒別診斷l(xiāng)可用于療效考核沙眼衣原體沙眼衣原體感染與致病l近年來在歐美等國，沙眼衣原體的感染率和危害性已超過淋球菌l在我國，在非淋球菌性尿道炎中居首位在我國，在非淋球菌性尿道炎中居首位l泌尿生殖道感染，妨礙妊娠l盆腔感染，可致生殖能力損害傳統(tǒng)方法檢測沙眼衣原體的缺陷l“窗口期”檢測不出l不能判定是現(xiàn)癥感染還是既往感染熒光定量PCR檢測衣原體的優(yōu)勢l靈敏度98%以上、特異性100%l提高陽性檢出率l適用于感染的早期診斷和無癥狀攜帶者的檢查解脲支原體lUU難以分離，需特殊培養(yǎng)基培養(yǎng)，操作費時，需1-3天才能得到初步結果。l血清學檢查，僅10%UU尿道炎患者在病程中特異性抗體滴度升高4倍，使其