實(shí)時(shí)熒光定量pcr原理及引物設(shè)計(jì)

1、逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-）qRT-PCR （RT-）qRT-PCR（Reverse transcription） quantitative real time PCR RT-PCRReverse transcription-PCRReal-time PCR樣品處理RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄qPCR數(shù)據(jù)分析樣品處理樣品處理 細(xì)菌樣品收集1-5*109細(xì)菌，置于液氮研磨，加入1mL Trizon，混勻，高溫（55） 細(xì)胞樣品收集1-5*107細(xì)胞，加入1mL Trizol，混勻，進(jìn)行RNA提取或者放置于-80冰箱 動(dòng)物樣品取50-100mg組織（新鮮或-70及液氮中保存的組織均

2、可）置1.5 mL離心管中，加入1ml Trizol充分勻漿。RNA提取及反轉(zhuǎn)錄提取及反轉(zhuǎn)錄 將處理好的樣品置于室溫，靜置5 min 加入0.2mL氯仿，振蕩15s，靜置5 min 4離心，12000g15min，取上清 加入等體積異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min 4離心，12000g10min，棄上清 加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4，7500g5min，棄上清 晾干，加入適量的DEPC H2O溶解（65促溶10-15min）。RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄提取及逆轉(zhuǎn)錄 注意事項(xiàng) 樣品量和Trizol的加入量一定要按比例，不能隨意增加樣品量或減少Trizol量，否則會(huì)使內(nèi)源性RNa

3、se的抑制不完全，導(dǎo)致RNA降解。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程必須嚴(yán)格防止RNase的污染。 DNase （RNase-free） RRI （Recombination RNase Inhibitor）RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄提取及逆轉(zhuǎn)錄 RNA質(zhì)量檢測(cè)（完整性與純度）RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄提取及逆轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄注意事項(xiàng) RT Primer的選擇Oligo dT，隨機(jī)引物，基因特異性引物 gDNA污染RNA提取提取及逆轉(zhuǎn)錄及逆轉(zhuǎn)錄qRT-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）化學(xué)原理數(shù)學(xué)原理標(biāo)記方法定量分析方法與常規(guī)PCR技術(shù)比較 常規(guī)PCR對(duì)擴(kuò)增終產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析，無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)

4、。 qRT-PCR的化學(xué)原理的化學(xué)原理qRT-PCR的化學(xué)原理的化學(xué)原理 起點(diǎn)定量：起點(diǎn)定量：起始DNA量是樣本中原來(lái)的DNA量，更有意義，重現(xiàn)性好，誤差小。 終點(diǎn)定量：終點(diǎn)定量：終點(diǎn)DNA的量是經(jīng)過(guò)PCR放大的量，存在部分“失真”，并非研究所期望的數(shù)據(jù)，誤差大。qRT-PCR的化學(xué)原理的化學(xué)原理 典型的PCR擴(kuò)增四個(gè)階段qRT-PCR的化學(xué)原理的化學(xué)原理 三個(gè)概念基線基線（Baseline）：是指在PCR擴(kuò)增反應(yīng)的最初數(shù)個(gè)循環(huán)里，熒光信號(hào)變化不大。接近一條直線，這樣的直線即是基線。熒光域值熒光域值（threshold）的設(shè)定：一般將 PCR反應(yīng)前 15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào)，熒光域

5、值是PCR 3-15個(gè)循環(huán)熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的10倍，熒光域值設(shè)定在 PCR擴(kuò)增的指數(shù)期。qRT-PCR的化學(xué)原理的化學(xué)原理三個(gè)概念Ct值值：C(Cycle)，t（threshold）表示每個(gè)PCR反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，各模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。反之亦然。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。qRT-PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí): XCt=X0 (1+Ex)Ct

6、 =M (1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3)log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4)Ct= -log X0 + log M (5) log(1+Ex) Log（x0的初始模板量）與到達(dá)閾值時(shí)的循環(huán)數(shù)（Ct值）呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量qRT-PCR的數(shù)學(xué)原理的數(shù)學(xué)原理qRT-PCR的標(biāo)記方

7、法的標(biāo)記方法非特異性熒光標(biāo)記 SYBR Green I Ethidium Bromide特異性熒光標(biāo)記 Taqman探針 Taqman MGB探針?lè)肿有艠?biāo)qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 非特異性熒光標(biāo)記 SYBR Green 是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的原料。qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 非特異性熒光標(biāo)記 SYBR Green I作用原理qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 非特異性熒光標(biāo)記 SYBR Green I標(biāo)記注意事項(xiàng) SYBR Green I與任何dsDNA進(jìn)行結(jié)合后散發(fā)熒光，因此如果反應(yīng)體系中有非特異性擴(kuò)增或者引物二聚體的生成，也將同時(shí)被檢

8、測(cè)，從而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。 設(shè)計(jì)合適引物，防止非特異性擴(kuò)增。 反應(yīng)結(jié)束后必須做熔解曲線分析。qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 非特異性熒光標(biāo)記 熔解曲線 對(duì)PCR產(chǎn)物加熱，隨著溫度的升高，雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸解鏈，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降，到達(dá)某一溫度時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大量的產(chǎn)物解鏈，熒光急劇下降。利用該特點(diǎn)以及不同PCR產(chǎn)物其Tm值的不同，因此使其熒光信號(hào)發(fā)生迅速下降的溫度也不同，可通過(guò)此對(duì)PCR的特異性進(jìn)行鑒定。qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 非特異性熒光標(biāo)記 熔解曲線qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 非特異性熒光標(biāo)記優(yōu)點(diǎn) (1).對(duì)DNA模板沒(méi)有選擇性-適用于任何DNA (2).使用方便-不必設(shè)計(jì)

9、復(fù)雜探針 (3).非常靈敏 (4).可做熔解曲線分析 (5).便宜缺點(diǎn) (1).對(duì)引物特異性要求較高 (2).與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性,干擾實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,尤其是分析表達(dá)量不高的基因時(shí),這類情況尤其突出; 需要不斷的優(yōu)化反應(yīng)體系,降低非特異性擴(kuò)增.qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 特異性熒光標(biāo)記Taqman探針?lè)═aqMan探針的特性：(1).5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等(2).3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)(3).探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， R與Q分 開(kāi)，發(fā)熒光(4).Taq酶有 53外切核酸酶活

10、性，可水解探針與目標(biāo)序列互補(bǔ)qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 特異性熒光標(biāo)記 Taqman探針?lè)üぷ髟砻繑U(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過(guò)程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 特異性熒光標(biāo)記 Taqman探針的設(shè)計(jì)原則qRT-PCR的標(biāo)記方法的標(biāo)記方法 特異性熒光標(biāo)記 Taqman探針?lè)?優(yōu)點(diǎn) (1).極高的特異性和準(zhǔn)確性：由于探針?lè)ǔ艘镄蛄械奶禺愋灾?，還有探針序列的特異性，從兩個(gè)方面保證了所 擴(kuò)增基因的特異性。 (2).良好的重復(fù)性 缺點(diǎn) (1).目前合成價(jià)格較貴. (2).不能做熔解曲線分析.qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法絕對(duì)定量（Ab

11、solute；How many？）相對(duì)定量（Relative；How much？）qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法絕對(duì)定量絕對(duì)定量典型應(yīng)用領(lǐng)域典型應(yīng)用領(lǐng)域: : 特定物種鑒定(e.g. bacteria, virus)特定核酸樣本檢測(cè)(e.g. oncology research)檢測(cè)病原體載量(e.g. legionella, anthrax)篩選抗生素抗性基因(e.g. MRSA, VRE)水質(zhì)監(jiān)測(cè)相對(duì)定量相對(duì)定量典型應(yīng)用領(lǐng)域典型應(yīng)用領(lǐng)域: :mRNA 表達(dá)水平的檢測(cè)(e.g. 細(xì)胞因子, 腫瘤)基因定量 (e.g. 染色體缺失) 研究疾病的微小殘留病灶(MRD)GMO 檢測(cè)qR

12、T-PCR的定量分析方法的定量分析方法 絕對(duì)定量分析方法 絕對(duì)定量一般通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定目的基因在樣本中的分子數(shù)目，即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。 絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)必須使用已知拷貝數(shù)的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線。qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 絕對(duì)定量分析方法 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 嚴(yán)格意義上的操作要求將PCR產(chǎn)物切膠后進(jìn)行膠回收，并進(jìn)行質(zhì)粒的連接、轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，質(zhì)粒在大腸桿菌中增值后提取質(zhì)粒，并用分光光度計(jì)測(cè)定含有PCR產(chǎn)物的質(zhì)粒的OD值，借此來(lái)確定質(zhì)粒的摩爾量，將已知摩爾量的質(zhì)粒做5倍或10倍的連續(xù)梯度稀釋，做成質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，這是準(zhǔn)確測(cè)定樣品中目的基因模板量的定量基礎(chǔ)。 現(xiàn)在也有的不做質(zhì)粒，

13、直接測(cè)定純化后的PCR產(chǎn)物的摩爾量，然后梯度稀釋PCR產(chǎn)物，以此來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)品。qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 絕對(duì)定量分析方法 標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制未知樣品的絕對(duì)定量qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法 絕對(duì)定量通常在需要確定轉(zhuǎn)錄本絕對(duì)拷貝數(shù)的條件下使用，但在有些情況下，并不需要對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行絕對(duì)定量，只需要給出相對(duì)基因表達(dá)差異即可。如X基因在經(jīng)過(guò)某種處理后表達(dá)量是增加了還是減少了，這時(shí)只需要用相對(duì)定量的方法就可以得到結(jié)果，而不需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量來(lái)確定濃度。由于系統(tǒng)誤差的原因，不同的樣品很難獲得相同量的RNA，這時(shí)就有必要引入管家基因來(lái)對(duì)所有樣品進(jìn)

14、行歸一化處理(RNA 量校正)，然后再對(duì)不同樣品之間的目的基因表達(dá)量進(jìn)行比較。qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法 內(nèi)參基因的作用：利用內(nèi)參基因 (=內(nèi)源性對(duì)照) 對(duì)樣本間的差異進(jìn)行歸一化處理 內(nèi)參基因可以內(nèi)參基因可以修正修正：樣品起始量的差別樣品中核酸回收率的差別樣品中可能的RNA降解不同樣品中核酸質(zhì)量的差別加樣差qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法 理想的內(nèi)參基因u 表達(dá)水平在所有樣品中是持續(xù)、穩(wěn)定的：正常組織 vs. 腫瘤組織u 表達(dá)水平不受實(shí)驗(yàn)條件變化的影響：處理樣本 vs. 未處理的樣本 看家基因(Housekeeping genes)

15、：編碼有基礎(chǔ)細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)-actinmultigene family; 20 genes; 1 active locus: hormones of tyroid gland20 pseudogenes: stomach tumorg-actinmultigene family; pseudogenesGAPDHmultigene family; 10-30 genes; 200 in mouse: lung, pancreatic, colon cancermostly pseudogenes: insulin, EGF5.8S,18S, 28S RNApseudogenes2-micro

16、globulinno pseudogenes : Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumorsG6PDHno pseudogenes: kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factorsPBGDno pseudogenesaldolasepseudogenesHPRTpseudogenesU3, U8, .Pseudogenesornithin: tumorsdecarboxylase.GeneGenomic structure / pseudogenesRegu

17、lation e.g.qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法u雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法u比較Ct法qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法u雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法所謂的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法就是對(duì)內(nèi)參基因和所研究的目的基因都做絕對(duì)定量，然后將各生理階段的目的基因的量和內(nèi)參基因的量相除，得出一個(gè)比值；最后再將不同生理階段所得的比值相除，最終得出目的基因在不同生理階段的表達(dá)變化。qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法u雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法優(yōu)點(diǎn)：思路直觀條理清晰最大限度的避免了實(shí)驗(yàn)的誤差缺點(diǎn)：每次都需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，適合樣品量比較多但待測(cè)基因量少的實(shí)驗(yàn)qRT-PCR的定量分析方

18、法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法u比較Ct法此法是經(jīng)定量的數(shù)學(xué)原理推導(dǎo)而來(lái)該方法直接利用看家基因來(lái)校正樣品初始量，但同時(shí)默認(rèn)兩個(gè)基因擴(kuò)增效率一致，而并非真實(shí)擴(kuò)增情況的反映，因此實(shí)驗(yàn)條件需要嚴(yán)格優(yōu)化，并且總會(huì)存一定的偏差。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，必需對(duì)目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。軟件會(huì)自動(dòng)給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的R值、擴(kuò)增效率等信息，如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即M值的差小于0.1，表明兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率已非常接近，那么后續(xù)實(shí)驗(yàn)中就可以用此法進(jìn)行相對(duì)定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就無(wú)法用該方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。此時(shí)的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，使兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值小于0.1，二是換用其它的相對(duì)定

19、量方法。qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法u比較Ct法qRT-PCR的定量分析方法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法u比較Ct法 PCR 擴(kuò)增效率的差異存在于：擴(kuò)增效率的差異存在于： 不同模板及引物序列的差異 不同的PCR體系 不同次的PCR實(shí)驗(yàn) N = No x En, E = 2? 理想情況下擴(kuò)增效率2Crossing Point Log Concentration樣品 1 樣品 2效率2 的標(biāo)準(zhǔn)曲線效率偏離2的標(biāo)準(zhǔn)曲線E =10 E =10 -1/slope-1/slopeqPCR的定量分析方法的定量分析方法 相對(duì)定量分析方法u比較Ct法Bio-Rad CFX M

20、anager Software操作方法操作方法PCR程序設(shè)定Plate 設(shè)定結(jié)果導(dǎo)出與分析qRT-PCR引物檢索及設(shè)計(jì)引物檢索及設(shè)計(jì)qRT-PCR引物檢索及設(shè)計(jì)引物檢索及設(shè)計(jì) qRT-PCR引物數(shù)據(jù)庫(kù) Primerbank（HS and MM)/primerbank/ Origenehttps:/ qPrimerDBhttps:/ RTPrimerDB NCBI Probe/probeqRT-PCR引物檢索及設(shè)計(jì)引物檢索及設(shè)計(jì)qRT-PCR引物檢索及設(shè)計(jì)引物檢索及設(shè)計(jì) qRT-PCR引物設(shè)計(jì)qRT-PCR引物檢索及設(shè)計(jì)引物檢索及設(shè)計(jì) qRT-PCR引物設(shè)計(jì) /gen