人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)工藝

1、人生長(zhǎng)激素的生產(chǎn)工藝生長(zhǎng)素分為植物生長(zhǎng)素和高等動(dòng)物、人生長(zhǎng)激素。植物體內(nèi)的生長(zhǎng)素,其化學(xué)成分是吲哚乙酸。而高等動(dòng)物和人體內(nèi)的生長(zhǎng)激素,其化學(xué)成分是蛋白質(zhì)，不同種屬的哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)激素間有明顯的種屬特異性，只有靈長(zhǎng)類的生長(zhǎng)激素對(duì)人有活性。因而動(dòng)物的生長(zhǎng)激素一般不能用在人身上。人生長(zhǎng)激素是腦垂體前葉分泌細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，是由一條191個(gè)氨基酸的多肽鏈所構(gòu)成的蛋白質(zhì),分子中有兩個(gè)二硫鍵,相對(duì)分子質(zhì)量21700,等電點(diǎn)4.9，沉降系數(shù)s20，w2.179，n端的1-134氨基酸段肽鏈為活性所必需，c端的一段肽鏈可能起保護(hù)作用，使生長(zhǎng)激素在血循環(huán)中不致被酶破環(huán)。人生長(zhǎng)激素分子相當(dāng)穩(wěn)定，其活性在冰凍條件下

2、可保持?jǐn)?shù)年，在室溫放置48h無(wú)變化。一、生長(zhǎng)激素發(fā)展歷程： ：科學(xué)家早家1920年就知道了生長(zhǎng)激素的存在，但直到1958年才被用于臨床治療。直到1986年美國(guó)禮來(lái)大藥廠通過(guò)基因工程方法，成功地制造出了191個(gè)氨基酸的hgh。 2：1985年，基于對(duì)hgh的多年研究和廣泛深入的臨床實(shí)驗(yàn)，美國(guó)威斯康辛醫(yī)學(xué)院的羅德曼博士在美國(guó)抗衰老協(xié)會(huì)雜志上首次正式提出一個(gè)有關(guān)人體衰老原因的嶄新理論。 3：1990年7月5日美國(guó)威斯康辛醫(yī)學(xué)院的daniel rudman羅德曼醫(yī)師在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志上發(fā)表了他那一篇震驚醫(yī)學(xué)界的論文effects of human growth hormone in men over

3、60 years old（人類生長(zhǎng)激素在60歲以上老年人中的應(yīng)用），這篇論文可以說(shuō)是hgh應(yīng)用到抗衰老研究醫(yī)學(xué)史上的一座里程碑。 4：1996年，愛(ài)德門錢博士在自己親身體驗(yàn)到hgh的卓越效果后，擴(kuò)展使用到超過(guò)800個(gè)患者，包括電影明星、大公司高級(jí)主管、甚至許多著名的醫(yī)生、專家、學(xué)者，均達(dá)到驚人的效果。1996年8月美國(guó)fda（美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局）終于正式批準(zhǔn)hgh在臨床上使用，用來(lái)治療所有缺乏hgh的病人，也包括正常成年人。5： 現(xiàn)在科學(xué)發(fā)現(xiàn)人體生長(zhǎng)素hgh減少才會(huì)出現(xiàn)人體的衰老。合理的補(bǔ)充人體生長(zhǎng)素（hgh），可以使人體的衰老現(xiàn)象產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)。二、人生長(zhǎng)激素作用有：1：有抗衰老作用2：對(duì)人肝

4、細(xì)胞有增加核分裂作用3：對(duì)紅細(xì)胞有抑制葡萄糖利用作用4：對(duì)白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞有促進(jìn)蛋白質(zhì)及核酸合成作用5：有促進(jìn)骨骼、肌肉、結(jié)締組織和內(nèi)臟增長(zhǎng)作用6：對(duì)垂體功能不全而引起的侏儒癥有效。三、人生長(zhǎng)激素的傳統(tǒng)工藝流程：工藝過(guò)程：1：原料處理。 取出人腦垂體，速凍，置于-20保存?zhèn)溆谩Ｊ褂脮r(shí)用蒸餾水淋洗。剝離后葉，取腺垂體前葉。2：提取。ph= 5.5置組織搗碎機(jī)制成勻漿，水提，離心，收集沉淀用ph =4.0、0.1mol/l硫酸銨提取，離心，然后用ph =5.5、0.25 mol/l硫酸銨提取沉淀，離心，得提取液。3：分級(jí)沉淀。在ph =7.5時(shí)，提取液中加入飽和硫酸銨稀至濃度1 mol/l，離心，

5、棄沉淀，上清液加飽和硫酸銨稀至濃度為1.8mol/l，離心，收集沉淀。 4：透析。腺垂體硫酸銨ph=5.5提取液硫酸銨ph=7.5鹽析物透析除鹽、去雜蛋白 將沉淀溶于少量蒸餾水中，用水透析除鹽。5：等電點(diǎn)沉淀。再將透析液在ph=4.0和ph=4.9分別進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，離心，除去雜蛋白，得上清液。鹽析物蒸餾水溶解液透析液hcl或naohph=4.0, 4.9上清液。6：鹽析。鹽析、離心、洗脫 上清液在ph=4時(shí)用飽和硫酸銨稀至1.25mol/l，鹽析，離心，收集沉淀。7：凝膠過(guò)濾。將沉淀溶于少量蒸餾水，對(duì)ph =8.5的tris-hcl緩沖液(含0.1mol/l氯化鈉)透析，再上sephadex

6、g-75柱，用50mmol/l、ph= 8.5的tris-hcl緩沖液(含0.1mol/l氯化鈉)洗脫，分步收集組分。上清液硫酸銨ph4.0鹽析物透析ph=8.5透析液sephadexg-75ph=8.5活性成分 8：deae-c（de-50）層析。透析、除鹽、凍干 將活性成分對(duì)ph= 8.7、6.5 mmol/l的硼砂-hcl緩沖液進(jìn)行透析，透析液上deae-c柱，用6.5 mmol/l、ph= 8.7的硼砂-hcl緩沖液(含0-0.3mol/l氯化鈉)梯度洗脫，收集組分，合并，透析除鹽，冷凍干燥即得pgh?；钚猿煞滞肝鰌h=8.7透析液deae-cph=8.7吸附物洗脫ph=8.7洗脫峰組

7、分透析透析液凍干-30pgh成品。四、人生長(zhǎng)激素現(xiàn)在生產(chǎn)工藝現(xiàn)在生產(chǎn)工藝主要運(yùn)用生物技術(shù)，有現(xiàn)采用枯草芽孢桿菌系統(tǒng)表達(dá)或用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，現(xiàn)主要介紹運(yùn)用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)1：構(gòu)建工程菌pet30a( + ) -hgh/bl21 ( de3 ),2：種子液的制備。從- 70 甘油凍存的菌種中取出少量接種于5ml 液體lb ( 含氨芐青霉素100ug/ml ) , 在37 200r/min 振蕩培養(yǎng)10 12h。按1% 量再轉(zhuǎn)接于100ml 液體lb ( 含氨芐青霉素100ug/ml ) , 在37 200r/min 振蕩培養(yǎng)8h 左右。3:發(fā)酵培養(yǎng)。培養(yǎng)基體積為4l, ph 控制在7.00 +/

8、- 0.10, 由發(fā)酵控制系統(tǒng)自動(dòng)補(bǔ)入5mol/l naoh 和2mol/l h2so4調(diào)節(jié)培養(yǎng)基ph。培養(yǎng)溫度控制在37 。發(fā)酵過(guò)程中溶氧控制在20% 以上, 當(dāng)溶氧降低至該值時(shí)可通過(guò)提高通氣量和攪拌速度以提高溶氧。4: 誘導(dǎo)和補(bǔ)料發(fā)酵。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到3.5 4h 后, 培養(yǎng)基中的葡萄糖幾乎消耗完, 一次性加入iptg 進(jìn)行誘導(dǎo), 使其終濃度為0.5mmol/l, 同時(shí)以3 4ml/min 的流速滴加補(bǔ)料液, 補(bǔ)料體積為500ml。5: 分析檢測(cè)。菌密度的測(cè)定; 葡萄糖的測(cè)定;周質(zhì)蛋白的提取; 蛋白的定量; 生物量的測(cè)定6:hgh的純化和純度鑒定。hgh 多克隆抗體的制備及純化; 抗體親和層析柱的制備; 抗體親和層析純化hgh; 純度鑒定; 相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定; 免疫活性檢測(cè)參考文獻(xiàn)：1齊香君.現(xiàn)代生物制藥工藝學(xué).176-1772楊少民, 陳方, 付永標(biāo), 等. 用重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)人生長(zhǎng)激素研究. 生物學(xué)雜志, 1998, 15( 81) : 13- 153王海波，王驪麗，歐俊杰，等. 用重組大腸桿菌生產(chǎn)rhg-csf 高密度發(fā)酵的方法. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004， 25