人造海水的配方

1、人造海水的配方*(引自 Chemical Oceanography ,Second Edition , Millero F J,1996 :水&化合物的總重量為1kg.名稱質(zhì)量(x 10-3kg)氯化鈉23.98氯化鎂5.029硫酸鈉4.01氯化鈣1.14氯化鉀0.699重碳酸鈉0.172溴化鉀0.100硼酸0.0254氯化鍶0.0143氟化鈉0.0029water. ASW) 人工海水的組成(Lyman and Flemingt 1940)如下0NaCI24.477sMgCb誦再。44妣罠N 恕 SO*CflCirHjO1 J020gKCI0.6640gNaHClJOJ920gKBrHjIK

2、Kj0,0260ftSrCl20.024l*gNaF0.0039s攜懐歐1 CJOOml為了避免沉淀的產(chǎn)生*人工海水的各成分需要分別濬解*然后殍混合；pH*7仏可以用玻的氫匏化鈉或鹽酸來調(diào)節(jié)。用以上人工梅水代替天然悔水大大方便了實(shí)弊聿條件下對(duì)真菌的培養(yǎng)，使海海洋微生物及其代謝產(chǎn)物-林永成主編2003細(xì)菌的分離：牛肉膏蛋白胨瓊脂、營養(yǎng)瓊脂等是分離細(xì)菌的常用培養(yǎng)基，前蘇聯(lián)細(xì)菌學(xué)家設(shè)計(jì) 的ZOBELL 2216E培養(yǎng)基是培養(yǎng)好氣性異養(yǎng)細(xì)菌較好的培養(yǎng)基，可培養(yǎng)多種細(xì) 菌，SIMIDU培養(yǎng)基也常用于海洋好氣性異養(yǎng)細(xì)菌的分離，PFENNIGS 用于海洋光合細(xì)菌的分離，分離海洋弧菌可采用 TCBS培為7.2

3、-7.6,鹽度為28到30,培養(yǎng)溫度28到37，培養(yǎng)時(shí)間1到7天，注意觀察 平板菌落變化，1到2天先挑取大菌落，5到7天后再挑取小菌落，為防止真菌 的污染，常在培養(yǎng)基中添加一定的抗真菌抗生素，如制霉菌素、兩性霉素、放線 菌酮等。放線菌因生長緩慢且菌落不大，一般不會(huì)對(duì)細(xì)菌的分離產(chǎn)生影響。放線菌的分離：1放線菌是數(shù)量最多、最常分離到的 G+ JENSEN勺研究表明，離海岸越近，在 0到1米水深的底泥樣本中，鏈霉菌占分離的放線菌總數(shù)的86%小單抱菌占12% 其他占2%2分離培養(yǎng)基多采用合成培養(yǎng)基(高氏合成一號(hào)、精氨酸、天門冬素培養(yǎng)基)和有機(jī)培養(yǎng)基(HV YE、WAKSMAhbennett ),高氏合

4、成一號(hào)是分離的常用培養(yǎng)基，適合尤其是鏈霉 菌的生長，但細(xì)菌和真菌也大量生長。HV是以腐植酸為唯一碳、氮源的培養(yǎng)基， 對(duì)小單抱菌、小雙抱菌、指抱囊菌、鏈抱囊菌的選擇性高，但是生長的放線菌形 態(tài)不完整，難以觀察，給挑菌工作帶來困難。3抑制劑放線菌酮、制霉菌素可抑制真菌，青霉素、鏈霉素可抑制細(xì)菌，重鉻酸鉀對(duì)真菌 和細(xì)菌均可抑制，0 005%-001淞較理想的分離抑制劑，有三個(gè)特點(diǎn)：抑制細(xì) 菌和真菌的生長，不影響放線菌的正常生長，還可促進(jìn)一些放線菌抱子的萌發(fā)， 價(jià)格低廉。4樣品預(yù)處理120干熱處理樣品1小時(shí)能大大減少細(xì)菌和鏈霉菌的數(shù)量，而對(duì)稀有放線菌影響 較少，甚至能利于抱子萌發(fā)，由于海洋樣品多潮濕，

5、同時(shí)抱子對(duì)濕熱敏感，故米 用50到55度的熱處理會(huì)促使大部分抱子萌發(fā)?；瘜W(xué)殺菌劑法殺菌劑 氯化鈣苯酚 SDS葡萄糖酸洗必泰 CG 芐索氯氨BC碳酸鈣富集的放線菌 囊抱菌非鏈霉菌屬小單抱菌智小雙抱菌非鏈霉菌屬小四抱菌所有放線困放線雙抱菌 小四抱菌鏈抱囊菌差速離心濃縮真菌的分離：到2000年止已認(rèn)知的海洋真菌僅僅 444種，包括177屬360種的子囊菌（占81 1%，51屬74種半知菌（占16 7%和7屬10種的擔(dān)子菌（占2 2% 選擇性富集海水樣品可通過濃縮或過濾，用無菌的045卩廚1徑的硝酸纖維素濾膜過濾海水， 然后直接把濾膜放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。分離酵母菌時(shí)，可將含 50-200啞/L氯霉素的分

6、離培養(yǎng)基用濃鹽酸調(diào)PH值至3 4酸性條件下可抑制很多細(xì)菌生長。植物內(nèi)生真菌分離方法：進(jìn)行分離前，對(duì)植物材料表面進(jìn)行徹底消毒非常必要，典型的消毒劑有70%-90%的乙醇、漂白劑、1%勺過氧乙酸和3%-30%勺過氧化氫，多采用 PDA培養(yǎng)基，并 加入慶大霉素、氯霉素、鏈霉素等抗生素，抑制細(xì)菌和放線菌的生長。鑒定：16S rRNA相對(duì)分子量適中，易于進(jìn)行序列測(cè)定和分析比較，可以為細(xì)菌鑒定提 供相對(duì)穩(wěn)定可靠的信息，廣泛用于評(píng)價(jià)生物遺傳多態(tài)性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。18SrRNA成為目前研究真菌屬物種多樣性的分析比較。原核微生物rRNA包含23S16S、5S,真核微生物轉(zhuǎn)錄區(qū)包含 5S、18S、5 8S、28S

7、。（C+G mol%在種內(nèi)不超過4%屬內(nèi)不超過10%低于2%沒有分內(nèi)學(xué)意義。只具 有否定價(jià)值，需與表型特征相結(jié)合。16S rDNA成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法，適用種及種以上的分類單位。同源性95%的菌可歸為同一屬， 97如視為同一種，大于 97%寸必須測(cè)定 DNA-DN雜交率是否大于70%才能確定是否為新種。由于對(duì)同種內(nèi)的不同菌株分 辨力較差，更適合研究屬及屬以上的菌株。18S rDNA普遍用于真菌物種的鑒定分析。植物內(nèi)生真菌的分離 葉、葉脈、莖、樹皮（韌皮部）等樣品用自來水沖洗掉泥土， 然后進(jìn)行嚴(yán)格的表面消毒程序：依次浸泡在75%酒精lmin , 3%5%有效氯的次 氯酸鈉溶液3 mi

8、n。75%的酒精O 5 min,然后再用無菌水沖洗3遍。晾干后，在 超靜臺(tái)將其剪成約O. 5 cmx 0. 5 cm左右小片。將處理好后剪成的小片鋪于 PDA 平板上，加入氯霉素與鏈霉素各50斗g/mL抑制細(xì)菌的生長，在26C培養(yǎng)培養(yǎng)2 3周分離內(nèi)生真菌。這些平板在第1周要每天檢查1次，然后可以3、4 d檢查1 次。一旦發(fā)現(xiàn)有菌絲從組織小塊長出，應(yīng)馬上將其轉(zhuǎn)接到另一新的平板上，經(jīng)幾 次純化保存于PDA斗面。植物組織樣品處理：將采集的紅樹林植物樣品先用流動(dòng)的清水沖洗干凈，再超聲 清洗徹底去除植物組織表面的雜質(zhì)，把植物樣品剪切成15 cm左右長度的節(jié)段 進(jìn)行表面消毒。樣品依次用次氯酸鈉（含5%有效

9、氯量）浸泡5 min,無菌水清洗3次, 75%酉精浸泡3 min,無菌水清洗3次,晾干，用粉碎機(jī)把植物組織粉碎備1,3.1各種樣品預(yù)處理方法樣禺懸浮液的直接制備;稱取2 g樣品（海生動(dòng)植物體用無菌剪刀剪碎）到2。血的無菌海水中，旋渦振 10 mnt使梵充分混懸，SD5法處理樣品岳稱取2 g樣品輝生動(dòng)植物體用無菌剪刀剪碎到20汕含有0.05 % SDS和6 %酔母膏的無菌海水中，振蕩3-5min后，409、200 r（nin r 下振蕩 30 odm苯酚法處理樣品【I叭稱2 g樣品（海生動(dòng)植物體用無菌剪刀剪碎）到含有L5 %苯酚的20 mL的無鑿禪水中，振蕩3-5 min后，30工 200 mi

10、f下振蕩30 min*加熱法處理樣品I叫 將直接制備好的樣品懸浮液55匸水浴6 min.（或5OV,】h）注意；樣晶處理的軟個(gè)過程必級(jí)是無曲的表1-1兩種分離篩選所用到的培養(yǎng)基名稱配方%酵母粉-麥牙膏瓊脂(YE)1,21酵母粉04.麥芽膏1,葡他糖0.4.瓊脂2,陳海水 75.蒸憎水 25, pH： 7. 2-7. 4淀粉-干酪素瓊脂(SC) 1,2 1,1可溶性淀粉h 干酪索0. 03, KNO, 0.2%9 NaCl0.2. K：PO0.002, FeS0 0.001,瓊脂 2,放線菌崩 75ppo 陳海水75.蒸烤水25. pH: 7. 2-7. 4徹萄糖-天門冬酰氨彌萄糖L 天門冬酰訊

11、0.05,磷酸耗二鉀0.05.瓊曆(GA) HV的配制：稱取腐植酸加1%的1ICL.煮沸后過濾取上清：各種維生索與堵養(yǎng)基其 他成分開滅葡，倒皿前加入. 以上培養(yǎng)基除GA要求115*C下，滅菌30 min夕卜，其余培養(yǎng)基均是121,滅曲 21 nin. 加入750 ppm放線菌酮的YE、SC、GA. HV用于涂布預(yù)處理后的樣品；加入100 ppm重鋸酸鉀的YE, Gause用于扳輅酸鉀選擇法，不加任何抑制劑或抗生素的YE、SC、 GA、HV作為對(duì)照不加任何抑制劑或抗生素的YE斜面用來探減放線菌和真菌-,2- 131瓊脂2.陳海75.蒸憾水25. pH: 7. 2-7. 4腐殖酸-維生素瓊脂(HV) 1,41腐殖聯(lián) 0. 1. N&HPOi 0.005. KC1 0. 17 . MgSO蒸IS 水 25. pH:7. 2-7.4淀粉蛋白腺瓊脂(Ml) ,s,可溶性淀粉0. 25,蛋白籐0.1,酵母粉0.05甘油確酸二鈉0