分光法測(cè)蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理。2. 掌握紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。3. 掌握TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)的使用方法并了解此儀器的主要構(gòu)造。、實(shí)驗(yàn)原理1. 紫外-可見分光光度法，是以溶液中物質(zhì)的分子或離子對(duì)紫外和可見光譜區(qū)輻射能的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外光：10-400 nm可見光：400-780 nm （可被人們的眼睛所感覺）特點(diǎn)：帶光譜、分子光譜應(yīng)用：定性分析-最大吸收波長(zhǎng);定量分析-朗伯-比爾定律（標(biāo)準(zhǔn)曲線法和標(biāo)準(zhǔn)加入法）a. 定性分析原理：吸收曲線：吸收峰的數(shù)目、位置、相對(duì)強(qiáng)度以及吸收峰的形狀

2、b. 定量分析原理：根據(jù)朗伯一比耳定律：A= ebc,當(dāng)入射光波長(zhǎng) 入及光程b 一定時(shí)，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比。定量分析常用的方法是標(biāo)準(zhǔn)曲線法即只要繪岀以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)岀試液的吸光度，就可以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對(duì)應(yīng)的濃度值，即未知樣的含量。c. 儀器組成部件：各種類型的紫外-可見分光光度計(jì)，如下圖所示，從總體上來說是由五個(gè)部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和信號(hào)顯 示記錄裝置。2. 本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的實(shí)驗(yàn)原理:（1） 蛋白質(zhì)可作定量分析的原因：蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在

3、275-280nm具有一個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.1 1.0mg/mL。（2）此種方法測(cè)量的準(zhǔn)確度差一點(diǎn)的原因：由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白質(zhì)溶液在280nm的光吸收職也不同。據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，濃度為1.0 mg/mL的1800種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在 280nm的吸光度在0.3 3.0之間，平均值為1.25+/-0.51。所以此種方法測(cè)量的準(zhǔn)確度差一點(diǎn)。（3） 有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時(shí)的經(jīng)驗(yàn)公式：若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸

4、類吸收紫外光的物質(zhì)，在280nm處來測(cè)量蛋 白質(zhì)含量時(shí)，會(huì)有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強(qiáng)，但蛋白質(zhì)卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm 的吸收差來計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260（A280和A260分別為蛋白質(zhì)溶液在 280nm和260nm處測(cè)得的吸光度值）還可以通過下述經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算岀溶液中的蛋白質(zhì)的含量:蛋白質(zhì)濃度（mg/mL ） =F* A280*D*1/d其中A280為蛋白質(zhì)溶液在280nm處測(cè)得的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm） ;D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子（4）稀溶液中

5、蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的經(jīng)驗(yàn)公式：蛋白質(zhì)的肽鍵在200 250nm有強(qiáng)的紫外吸收。其光吸收強(qiáng)度在一定范圍與濃度成正比，其波長(zhǎng)越短，光吸收越強(qiáng)。若選用215nm可減少干擾及光散射，用 215nm和225nm光吸收差值與單一波長(zhǎng)測(cè)定相比，可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差，因此，對(duì)稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗(yàn)公式：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）=0.144 （ A215-A225）（A215和A225分別為蛋白質(zhì)溶液在 215nm和225nm處測(cè)得的吸光度值三、儀器與試劑儀器：TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)，比色管（10ml的5個(gè)），吸量管。試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5

6、.00 mg/mL溶液、0.9% NaCI溶液，待測(cè)蛋白質(zhì)溶液（牛血清白蛋白）。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 基本操作（1） 啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動(dòng)工作站并初始化儀器，預(yù)熱半小時(shí)。（2）用吸量管分別吸取 0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL 5.00 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于 5只10 mL比色管中，用0.9% NaCI溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCI溶液為參比（參比溶液不可取出）（3） 在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目為光譜掃描，設(shè)置掃描參數(shù)（起點(diǎn)：400nm，終點(diǎn)：250nm，速度：中，間隔：1.0nm，單 次掃描）（4）將兩個(gè)均裝有0.9%NaCI溶液的1

7、cm石英比色皿放入測(cè)量池中，進(jìn)行基線掃描，然后選定量測(cè)定，校零，在調(diào) 回光譜掃描。2. 吸收曲線的制作：（找出最大吸收波長(zhǎng)）將放在前面的比色皿中溶液換為0.3 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，點(diǎn)擊 START進(jìn)行掃描，得到如下吸收曲線，從曲線中我們可以看出此標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的最大吸收波長(zhǎng)為278nm，此波長(zhǎng)下的吸光度為 0.1984。3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在工作界面上選擇測(cè)量項(xiàng)目為光度測(cè)量設(shè)置測(cè)量條件（測(cè)量波長(zhǎng)：278.00 nm ）。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCI溶液為參比，在 278nm處分別測(cè)定以上所配標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278，記錄如下：濃度（mg/mL）0.30.40.50.60.7A

8、2780.19710.25320.32220.37580.4382以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:4. 樣品測(cè)定:配制三份待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，(取待測(cè)蛋白質(zhì)溶液2.0mL分別于3只10mL比色管中，用0.9% NaCI溶液稀釋至刻度)按上述方法測(cè)定278 nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906，0.3765，0.3848。平均值為A278=0.3840,根據(jù)樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測(cè)蛋白質(zhì)的濃度為0.6101mg/mL。轉(zhuǎn)換后待測(cè)蛋白質(zhì)溶液的濃度為C= 0.6101mg/mL ?10 mL/2.0mL=3.0505mg/mL。五、注意事項(xiàng)準(zhǔn)備工作:(1) 在測(cè)量前

9、應(yīng)把機(jī)器預(yù)熱半小時(shí)。(2) 溶液一定要配制準(zhǔn)確，以防影響實(shí)驗(yàn)效果，保證點(diǎn)在一條直線上。(3) 由于蛋白質(zhì)的紫外吸收峰常因PH值的改變而改變，故進(jìn)行樣品測(cè)定時(shí)的PH最好與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時(shí)的 PH值一致。測(cè)量工作:(1) 吸收曲線繪制前必須進(jìn)行光譜的掃描。(2) .在作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量前一定要選擇最大的吸收波長(zhǎng)，確保靈敏度高。(3) 在實(shí)際操作中，比色皿在使用中應(yīng)注意保持干凈，更不能觸摸比色皿的光面，以防摩擦影響通光。六、思考題1. 紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的方法有何缺點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)？受哪些因素的影響和限制？答：優(yōu)點(diǎn)：方法操作簡(jiǎn)便、迅速、不需要復(fù)雜和昂貴的設(shè)備，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用，低濃度的鹽和大多數(shù)緩沖溶 液不干擾測(cè)定。缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度和靈敏度差一點(diǎn)。干擾物質(zhì)多：對(duì)于測(cè)定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的 誤差。若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生較大干擾2. 若樣品中含有核酸類雜質(zhì)，應(yīng)如何校正？答：因?yàn)楹怂嵩?60nm處的光吸收比280nm更強(qiáng)，但蛋白質(zhì)卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計(jì)算蛋白 質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL ）