型別檢測_PowerPoint_97-2003_幻燈片

1、HPV檢測在宮頸癌檢測在宮頸癌診治中的應(yīng)用診治中的應(yīng)用胡飛紅在2003年，香港天后級藝人，梅艷芳梅艷芳身患癌癥，在她剛剛過完40歲生日后離開人世宮頸癌與HPV關(guān)系豪森，德國人，2008年10月諾貝爾獎獲得者研究了人乳頭狀瘤病毒與宮頸癌的關(guān)系研究了人乳頭狀瘤病毒與宮頸癌的關(guān)系 HPV HPV型別與宮頸病變型別與宮頸病變HPV病毒通過皮膚病毒通過皮膚表面的微小創(chuàng)口侵表面的微小創(chuàng)口侵入入更多的更多的HPV病毒侵入到病毒侵入到創(chuàng)口周圍組織并進(jìn)入上創(chuàng)口周圍組織并進(jìn)入上皮細(xì)胞皮細(xì)胞病毒復(fù)制HPV檢測在宮頸癌診治中的臨床意義 CIN治療后，治療后，宮頸癌手術(shù)宮頸癌手術(shù)后的隨訪后的隨訪 篩查宮篩查宮頸癌高頸癌

2、高發(fā)人群：發(fā)人群： 協(xié)助診斷早協(xié)助診斷早期宮頸癌和期宮頸癌和癌前病變：癌前病變：科學(xué)研究指科學(xué)研究指導(dǎo)（疫苗導(dǎo)（疫苗） 常用HPV檢測方法的分析1.細(xì)胞學(xué)檢查傳統(tǒng)巴氏涂片（傳統(tǒng)巴氏涂片（CVCV）液基薄層細(xì)胞學(xué)技術(shù)液基薄層細(xì)胞學(xué)技術(shù)(TCT)(TCT)2.2.組織學(xué)檢查（組織學(xué)檢查（肉眼觀察。陰道鏡觀察。組織檢查）3.3.感染組織中感染組織中HPVHPV蛋白的檢測蛋白的檢測4.4. HPV HPV感染的血清學(xué)檢查感染的血清學(xué)檢查檢測人體血清中是否存在有針對HPV產(chǎn)生的抗體，通過免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測。檢測人體血清中是否存在有針對HPV產(chǎn)生的抗體，通過免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測。HPV基因檢測5.5. HP

3、V HPV基因組檢測基因組檢測 1. 1. 基于基于PCRPCR靶向擴(kuò)增靶向擴(kuò)增 2. 2. 基于基于PCRPCR產(chǎn)物分析產(chǎn)物分析, ,雜交分析雜交分析用 型特異PCR引物-設(shè)計成能特定擴(kuò)增單個HPV基因型。一個PCR反應(yīng)僅能檢測一種型別型特異PCR 依據(jù)不同HPV亞型用共同保守序列的特點合成通用引物，對HPV廣譜擴(kuò)增 E6，E7特異引物陽性率遠(yuǎn)高于用L1區(qū)通用引物通用引物PCR普通PCR的基礎(chǔ)上增添了熒光探針，常用通用引物，僅多定量功能。目前兩通用探針可檢測40多種型別。實時熒光定量PCR1?；赑CR靶向擴(kuò)增對PCR產(chǎn)物的一對引物間序列進(jìn)行測序?qū)崿F(xiàn)HPV型別，避免了雜交固有的交叉反應(yīng)。特別

4、對少見型和新型別作用大，但多重感染影響測序準(zhǔn)確度，病毒載量少者易被忽略。（1）直接測序法選擇合適的限制性核酸內(nèi)切酶，據(jù)特定酶切電泳條帶模式判斷型別。可檢測具體型別，但對特異性要求高，非特異性性條帶可致酶切后分型不準(zhǔn)確。（2）限制性片段長度多態(tài)性分析2.基于基于PCR產(chǎn)物產(chǎn)物分析分析（1）雜交捕獲法雜交捕獲雜交捕獲( (hybridcapturesystemhybridcapturesystem，HCSHCS) ) 實驗是美國實驗是美國DigeneDigene 公司新發(fā)公司新發(fā)展的一種檢測展的一種檢測HPV DNA HPV DNA 的技術(shù)，其原理是利用對抗體捕獲信號的放的技術(shù)，其原理是利用對抗體

5、捕獲信號的放大和化學(xué)發(fā)光信號的檢測。大和化學(xué)發(fā)光信號的檢測。敏感性好，重復(fù)性高，不存在交叉雜交問題。敏感性好，重復(fù)性高，不存在交叉雜交問題。（2）反向雜交法有線性平行雜交，點雜交，反向線性雜交。有線性平行雜交，點雜交，反向線性雜交。常用于常用于HPVHPV型別分布的統(tǒng)計研究中。型別分布的統(tǒng)計研究中。（3）以聚笨乙稀磁鐵珠為載體的多重HPV分型方法雜交載體是磁珠，通用引物行廣譜擴(kuò)增，加入變性劑，產(chǎn)物解為單鏈，雜交載體是磁珠，通用引物行廣譜擴(kuò)增，加入變性劑，產(chǎn)物解為單鏈，與磁珠上型別特異性探針雜交反應(yīng)。與磁珠上型別特異性探針雜交反應(yīng)。2.基于PCR產(chǎn)物雜交分析（4）基因芯片技術(shù)雜交捕獲法雜交捕獲一

6、代（HC-)試驗可檢測9 種高危型HPV ,包括16 、18 、31 、33 、35 、45 、51 、52 和56 。所用的反應(yīng)載體是試管；雜交捕獲二代試驗(HC)原來的試管法改為96 孔平板法，能同時檢測13 種高危型HPV (16 、18 、31 、33 、35 、39 、 45 、51 、52 、56 、58 、59 和68) 。雜交捕獲法雜交捕獲法捕獲雜交法捕獲雜交法（通過對病毒DNA解鏈,雜交捕獲,光信號放大獲取結(jié)果）基本實驗步驟如下： 1. 樣本DNA 雙鏈被釋放并分解為核苷酸單鏈; 2. DNA 單鏈與RNA 探針結(jié)合為RNADNA 雜交體; 3. 特異性抗體將RNADNA 雜

7、交體固定在試管壁或微孔壁上; 4. 結(jié)合有堿性磷酸酶的多個第二抗體與RNADNA 雜交體結(jié)合,使信號放大; 5. 堿性磷酸酶使酶底物發(fā)光,判讀光的強(qiáng)弱可確定堿性磷酸酶的含量,從而確定RNADNA 雜交體的含量。HCII唯一通過FDA批準(zhǔn)可在臨床使用的HPV技術(shù)DNA裂解 RNA-DNA雜交 抗體捕獲 化學(xué)發(fā)光 計算機(jī)判讀新發(fā)展的一項診斷技術(shù)，在HPV分型中用寡核苷酸原位合成法，原理是將疾病的特征性基因片段或致病病原體片段固定芯片上，制成診斷芯片，提取患者樣本中核酸行標(biāo)記作探針，利用探針與芯片雜交，掃描雜交結(jié)果，判斷基因型分型是否被感染，可診斷HPV潛在感染，行早期預(yù)防基因芯片技術(shù)HPVHPV基

8、因芯片檢測基因芯片檢測敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠檢測靈敏度是檢測靈敏度是PCR方方 法的法的100 倍倍針對性強(qiáng)：對樣品中的針對性強(qiáng)：對樣品中的HPV-DNA 直接進(jìn)行檢測。檢出直接進(jìn)行檢測。檢出HPV 的潛伏期感染，克服了血清學(xué)及免疫組化檢測法對的潛伏期感染，克服了血清學(xué)及免疫組化檢測法對潛伏感染會產(chǎn)生漏檢的缺點（潛伏感染會產(chǎn)生漏檢的缺點（實現(xiàn)對疾病的早期快速診實現(xiàn)對疾病的早期快速診斷斷）操作簡單：通過操作簡單：通過1次雜交檢測不僅可以判斷待檢樣品次雜交檢測不僅可以判斷待檢樣品中是否存在中是否存在HPV 感染，而且可以鑒定出是哪種型別感染，而且可

9、以鑒定出是哪種型別的的HPV 感染感染同時檢測多種同時檢測多種HPV 型別，對多重型別，對多重HPV. 感染的判感染的判斷一目了然，克服了其他斷一目了然，克服了其他HPV. 檢測方法難以判斷檢測方法難以判斷混合感染或操作煩瑣的缺點混合感染或操作煩瑣的缺點。總結(jié)?？傊?，目前的HPV分型檢測技術(shù)主要基于聚合酶鏈反應(yīng)。HPV特定型別在宮頸疾病發(fā)展中的重要作用，考慮到HPV型譜的多樣性和多重性HPV聯(lián)合感染的高發(fā)率，準(zhǔn)確的HPV檢測顯得尤為重要。不斷尋求更準(zhǔn)確，快速有效的檢測技術(shù)。注：如何對待HPV感染？1.HPV 1.HPV 感染較為常見感染較為常見2.2.多數(shù)多數(shù) HPV HPV 可以被清除可以被清除,“,“一過性一過性”感染不致宮頸病感染不致宮頸病變變 3.3.少數(shù)持續(xù)性感染會引發(fā)宮頸病變少數(shù)持續(xù)性感染會引發(fā)宮頸病變 4.HPV4.HPV致致CINICINI、CINIICINII、CINIIICINIII到浸潤癌需要相當(dāng)長的到浸潤癌需要相當(dāng)長的時間，一般是時間，一般是810810年年5.5.致宮頸癌的是高危型致宮頸癌的是高危型HPVHPV6.HPV(+)6.HPV(+)只說明是一種感染，并非是一種疾病只說明是一種感染，并非是一種疾病 7.7.沒有沒有HPVHPV感染可以不得宮頸癌感染可