基因治療課件

1、1第八節(jié)第八節(jié) 基因治療與基因診斷基因治療與基因診斷2一、基因治療的概念一、基因治療的概念基因治療（gene therapy）就是向有功能缺陷的細胞補充相應(yīng)功能基因，以糾正或補償其基因缺陷，從而達到治療的目的。3Gene Therapy Principles4原位修復(基因修復）：對有缺陷的基因在原來位置上進行修復，使該基因恢復正?；蛱娲煼ǎ褐委煵呗允乔谐l(fā)生缺陷的基因，再轉(zhuǎn)入有功能的正?；蛟鰪姡簩⒛康幕?qū)氚屑毎?，目的基因的表達產(chǎn)物可以補償缺陷細胞的功能基因抑制：導入外源基因以抑制原有的基因，目的在于阻斷有害基因的表達二、基因治療的策略二、基因治療的策略5基因治療的前景分析基因治療：

2、降低成本理論上所有治療基因（包括非分泌蛋白）均可開展基因治療基因治療：技術(shù)上難度大，有效性和安全性要求高基因治療：僅10余年歷史，技術(shù)不夠成熟，風險大6三、基因治療的兩大途徑71體細胞基因治療：把外源基因?qū)牖颊叩捏w細胞，以治療或預(yù)防基因接納者個人的疾病，只有特定的個體受益，但不能遺傳給后代。 2種系細胞的基因治療：在生殖細胞（精子、卵子或未分化的受精卵）中引入正?；蚧蛐迯腿毕莼蛞孕Ｕz傳缺陷。引入的外源基因（整合到基因組）能遺傳給后代。優(yōu)點：目的基因轉(zhuǎn)移到機體的所有組織并遺傳給后代。目前尚未開展，一是涉及倫理學問題；二是技術(shù)困難（診斷困難、引起新的插入突變的危險） 8又稱間接體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移

3、，基本途徑是：個體供者組織或細胞移植物 組織培養(yǎng)治療基因或標記基因培養(yǎng)細胞選擇或富集轉(zhuǎn)基因細胞I.轉(zhuǎn)染細胞實驗動物或受試病人的靶器官1.通過回體（ex vivo）基因轉(zhuǎn)移的治療途徑9又稱直接體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，將插入目的基因的表達載體直接導入體內(nèi)的方法?；就緩绞牵汉委熁虮磉_載體直接注射/與介質(zhì)結(jié)合后直接注射或用基因槍導入體內(nèi)包裝細胞系中包裝好的復制缺陷型病毒顆粒優(yōu)點：簡便省時省力，能很快觀察到外源基因的表達及作用缺點：DNA在體內(nèi)不易進入細胞，易被降解，以病毒顆粒的形式導入人體則易引起免疫反應(yīng)和被補體滅活。2. 通過體內(nèi)（in vivo）基因轉(zhuǎn)移的途徑10四、基因轉(zhuǎn)移的方法病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒載

4、體腺病毒載體單純皰疹病毒載體非生物學方法直接注射脂質(zhì)體受體介導11（一）基因治療的病毒載體應(yīng)該具有的基本條件：攜帶外源基因并能組裝成病毒顆粒介導外源基因的轉(zhuǎn)移和表達I.對機體沒有致病能力12 充分了解載體病毒的基因組結(jié)構(gòu)和功能（編碼區(qū)/非編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白/非結(jié)構(gòu)蛋白、必須基因/非必須基因、包裝容量等） 外源基因插入病毒基因組的非必須區(qū) 致病基因（裂解細胞、癌基因使細胞轉(zhuǎn)化）刪除 插入外源基因長度受限刪除非必須基因/必須基因（由輔助病毒或宿主細胞提供該基因的功能）病毒載體的產(chǎn)生13反轉(zhuǎn)錄病毒(Retrovirus, RV)載體優(yōu)點：基因轉(zhuǎn)移的效率高，細胞宿主范圍較廣泛，DNA整合效率高于其它病毒

5、載體等。缺點：只感染分裂狀態(tài)的細胞，載體容量?。?kb），目的基因在未分化的細胞中常丟失，隨機整合潛在致癌的危險。14優(yōu)點：安全，不整合到染色體上不需要宿主細胞的分裂增殖就能進入細胞 缺點：免疫原性較強不能整合到宿主細胞基因組使得外源基因表達持續(xù)時間有限I.插入外源DNA的能力也有限（7kb）。腺病毒(AV)載體15優(yōu)點：嗜神經(jīng)組織能插入較長外源基因（20kb或略長些缺點：較大的基因組使得遺傳操作較難進行不整合到宿主細胞基因組，表達持續(xù)的時間受限I.包含大量功能基因，安全水平尚待進一步觀察皰疹病毒（HSV）載體16 優(yōu)點：安全，痘病毒在人類歷史上已經(jīng)廣泛應(yīng)用外源基因的容量可達30 kb適用廣泛

6、的細胞型（可感染非分裂的細胞）缺點：不整合入細胞基因組，故外源基因表達的時間不能持久載體過大，受免疫系統(tǒng)的影響也較大。痘病毒（Poxvirus, PV）載體17（二）非病毒載體1. 裸裸DNA2. 脂質(zhì)體脂質(zhì)體/DNA復合物復合物3. 多聚物多聚物/DNA復合物復合物4. 其它方法其它方法181. 裸DNA 方法：直接注射或基因槍轟擊 溶液類型對基因表達有影響：重組DNA可貯存于5%-30%的蔗糖溶液中也可用生理鹽水或PBS192. 脂質(zhì)體/DNA復合物形成高效包裝DNA的人造膜，與細胞膜極為相似。形成脂質(zhì)雙層包圍水溶液的脂質(zhì)微球，與細胞融合后被細胞內(nèi)吞。20無毒性和免疫原性可生物降解，不會在

7、體內(nèi)堆積可制成球狀(0.03-50 m)，包容大小不同的生物分子可帶有不同的電荷具有不同的膜脂流動性、穩(wěn)定性、及溫度敏感性，能適應(yīng)不同的生理要求人工脂質(zhì)體膜具有如下特點21 陽離子多聚體 DNA帶負電 細胞表面帶負電3. 多聚物/DNA復合物22受體介導基因轉(zhuǎn)移技術(shù)磷酸鈣共沉淀法電穿孔法顯微注射法4.其它方法23 轉(zhuǎn)入功能基因（單基因遺傳?。┭巡 薛京倫等用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將IX因子的cDNA至血友病B患者的皮膚成纖維細胞中，再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表達明顯增高，癥狀得到改善重癥綜合性免疫缺乏癥（SCID）五、基因治療的應(yīng)用24n腺苷脫氨酶（腺苷脫氨酶（ADAADA）缺乏癥是常染色

8、體隱性遺傳的）缺乏癥是常染色體隱性遺傳的致死性疾病，患者由于致死性疾病，患者由于ADAADA缺乏導致脫苷腺氨酸增多，缺乏導致脫苷腺氨酸增多，改變了甲基化能力，致使淋巴細胞受損，從而導致改變了甲基化能力，致使淋巴細胞受損，從而導致免疫缺陷免疫缺陷n19901990年，首次將年，首次將ADAADA轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因T T淋巴細胞注射到淋巴細胞注射到人體骨髓組織人體骨髓組織（患有腺苷脫氨酶（患有腺苷脫氨酶（ADAADA）缺乏癥的缺乏癥的4 4歲兒童歲兒童） ，治療SCID25基因治療基因治療SCID的過程的過程26轉(zhuǎn)基因治療的問題與危險性轉(zhuǎn)基因治療的問題與危險性 有效的目的基因過少；有效的目的基因過少；

9、安全性安全性: :導入的基因缺乏調(diào)導入的基因缺乏調(diào)控手段；控手段； 有效性和穩(wěn)定性：有效性和穩(wěn)定性：缺少高效缺少高效和導向的載體系統(tǒng)；和導向的載體系統(tǒng)； 目前人們多重視分子水平的目前人們多重視分子水平的研究而忽略了整體研究，對研究而忽略了整體研究，對整體宏觀水平缺乏了解。整體宏觀水平缺乏了解。 1999年年9月月17日，美日，美國國Arizona州州18歲的歲的青年青年格爾辛格格爾辛格在賓夕在賓夕法尼亞大學人類基因法尼亞大學人類基因治療研究所接受基因治療研究所接受基因治療治療4天后不幸死亡，天后不幸死亡，成為基因治療實施以成為基因治療實施以來第來第1個直接死于這個直接死于這種試驗的病人。種試驗

10、的病人。 生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生27六、基因治療關(guān)鍵問題1.靶向性基因?qū)胂到y(tǒng)基因治療的關(guān)鍵問題是將治療基因送入特定得靶細胞，并在該細胞中得到高效表達；2.外源基因表達的可控性導入基因后無調(diào)控表達將會產(chǎn)生嚴重后果。最理想的可控性是模擬人體內(nèi)基因本身的調(diào)控形式；3.治療基因過少 28293031Fig.1.MapofrecombinantAd.RGD.mda-7andAd.RGD.pK7.mda-7adenovirusvectorsgenomesencodingmda-7.32Fig.2.Figureshowingtheenhancedtumorkillingeffectofgen

11、eticallymodifiedAd.RGD.pK7.mda-7andAd.RGD.mda-7virusescomparedtounmodifiedAd.mda-7.33Fig.3.PBS(A)orcontrolvirusAd.GFPtreatedanimals(B),orAd.RGD.Pk7.GFPtreatedanimals34Fig.4.SignificantinhibitionoftumorgrowthandbloodyasciteswasshowninAd.mda-7treatedanimals(C)andAd.RGD.pK7.mda-7treatedanimals(E).35基因治

12、療在未來人類重大疾基因治療在未來人類重大疾病的預(yù)防和治療上必將發(fā)病的預(yù)防和治療上必將發(fā)揮越來越大的作用！揮越來越大的作用！36七、基因診斷（七、基因診斷（Gene DiagnosisGene Diagnosis） G G到到T T一個堿基的改變，決定了一個堿基的改變，決定了一個人的命運一個人的命運小皓珩出生小皓珩出生2323個月就出現(xiàn)皮疹、個月就出現(xiàn)皮疹、便血等病狀，患上了罕見的原發(fā)便血等病狀，患上了罕見的原發(fā)性免疫缺陷病。性免疫缺陷病。 DNADNA序列分析，證實了小皓珩序列分析，證實了小皓珩WASWAS蛋白基因的蛋白基因的13881388位核苷酸由位核苷酸由G G突突變?yōu)樽優(yōu)門 T，使編碼

13、谷氨酸的密碼，使編碼谷氨酸的密碼GAGGAG突變?yōu)榻K止密碼突變?yōu)榻K止密碼TAGTAGWASWAS蛋白突變?yōu)闊o功能的蛋白突變?yōu)闊o功能的WASWAS蛋白，蛋白，導致患兒血小板減少，淋巴細胞導致患兒血小板減少，淋巴細胞形態(tài)和功能異常形態(tài)和功能異常 希望：希望：WASWAS目前已經(jīng)可以用骨髓目前已經(jīng)可以用骨髓移植或干細胞移植根治移植或干細胞移植根治通過從患者體內(nèi)提取樣本(DNA)用基因檢測方法來判斷患者是否有基因異常或攜帶病原微生物的方法，就是基因診斷。生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生37傳統(tǒng)與基因診斷的比較 傳統(tǒng)的診斷望 問 聽 觸經(jīng)驗化驗/檢驗微生物、免疫學、生物化學、病理學等對細胞、組織、酶

14、、代謝物等檢測影像學X線、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等特殊檢查肌電/腦電/心電、骨密度等基因診斷應(yīng)用分子生物學方法：如應(yīng)用分子生物學方法：如PCRPCR技術(shù)或技術(shù)或PCRPCR與分子雜交與分子雜交標記標記主要應(yīng)用于主要應(yīng)用于 先天遺傳性疾患（苯丙酮尿先天遺傳性疾患（苯丙酮尿癥、血紅蛋白?。┌Y、血紅蛋白?。?后天基因突變引起的疾病后天基因突變引起的疾病（腫瘤、糖尿?。[瘤、糖尿?。?病原生物的侵入（流感、肝病原生物的侵入（流感、肝炎、艾滋?。┭?、艾滋病） 個體識別、法醫(yī)物證個體識別、法醫(yī)物證生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生生物技術(shù)與醫(yī)藥衛(wèi)生38感染性疾病檢測感染性疾病檢測n 利用PCR技術(shù)或PCR與分子雜

15、交標記相結(jié)合，可以快速準確地檢測出病原性物質(zhì)n乙型肝炎病毒n丙型肝炎病毒n結(jié)核桿菌和瘧原蟲的分型39 公安司法系統(tǒng)公安司法系統(tǒng)罪犯及受罪犯及受害人的身份識別及親子鑒定害人的身份識別及親子鑒定 部隊部隊 傷亡士兵的身份傷亡士兵的身份識別；印尼海嘯中死難人員識別；印尼海嘯中死難人員身份識別身份識別 保安保安 個人個人DNADNA身份證，身份證，用于人員識別用于人員識別個體識別個體識別14歲智障少女懷孕 親子鑒定牽出70歲嫌犯40作業(yè)：作業(yè)： “英國研究人員英國研究人員2007年年4月月12日宣布，他們在世界上首次日宣布，他們在世界上首次確認了一個與肥胖相關(guān)的等位基因，他們將之稱為確認了一個與肥胖相關(guān)的等位基因，他們將之稱為FTO。這一研究成果發(fā)表在這一研究成果發(fā)表在科學科學雜志上。雜志上?！比绻闶且幻嗜绻闶且幻逝职Y患者，你將如何根據(jù)這一新發(fā)現(xiàn)對自己進行治療？請胖癥患者，你將如何根據(jù)這一新發(fā)現(xiàn)對自己進行治療？請簡要寫出治療方案。簡要寫出治療方案。 “統(tǒng)計表明，全世界統(tǒng)計表明，全世界HBV（乙型肝炎）感染者和攜帶者達（乙型肝炎）感染者和攜帶者達3.5億人之多。我國屬億人之