4780.ELISA法檢測水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量畢業(yè)論文

1、畢 業(yè) 論 文（設(shè)計(jì)）題 目elisa法檢測水產(chǎn)品中氯霉素的殘留量指導(dǎo)老師 專業(yè)班級 生物技術(shù)及應(yīng)用0701 姓 名 學(xué) 號 2010年5月30日摘 要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法對4個(gè)水產(chǎn)樣品氯霉素的殘留量進(jìn)行檢測，判斷其是否符合國標(biāo)限量要求，以便為其進(jìn)入市場提供監(jiān)測依據(jù)。研究主要利用溶劑萃取技術(shù)對樣品進(jìn)行預(yù)處理，再利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(elisa法)測定樣品中殘留氯霉素含量；檢測結(jié)果表明，4個(gè)水產(chǎn)樣品（花蓮、鱸魚、甲魚、南美白對蝦）中氯霉素含量依次為0.011、0.011、0.014、0.009 ug/kg，均低于國標(biāo)限量值0.3ug/kg，符合動(dòng)物源性食品出口歐盟和美國等國家的要求，可以進(jìn)入

2、市場。關(guān)鍵詞：elisa法；水產(chǎn)品；氯霉素；殘留量目 錄引言11 材料與儀器21.1 實(shí)驗(yàn)樣品21.2 實(shí)驗(yàn)試劑21.3 試驗(yàn)儀器22 方法32.1 樣品預(yù)處理32.2 酶聯(lián)免疫檢測33 結(jié)果與分析43.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作43.2 樣品中氯霉素濃度測定53.3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)64 總結(jié)與討論7參考文獻(xiàn)8引言酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（以下簡稱elisa），是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用最廣的技術(shù)1。自從engvall和perlman（1971）首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked lmmunos orbentassays,elisa）以來，由于elisa具有快速、敏感、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，使其

3、得到迅速的發(fā)展和廣泛的應(yīng)用?；痉椒ㄊ菍⒁阎目乖蚩贵w吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體在固相表面進(jìn)行反應(yīng)，用洗滌法將液相中的游離成分洗除2。elisa方法的基本原理是酶分子與抗體或抗原分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。此種酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過酶聯(lián)免疫檢測儀（酶標(biāo)儀）進(jìn)行定量測定，這

4、樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使elisa方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。根據(jù)elisa所用的固相載體elisa方法可分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的elisa，即我們通常所指的elisa（微量板e(cuò)lisa）；另一類是用硝酸纖維素膜為載體的elisa，稱為斑點(diǎn)elisa（dot-elisa）；再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的elisa，稱為布elisa（c-elisa）。在微量板e(cuò)lisa中，又根據(jù)其性質(zhì)的不同分為間接elisa、雙抗夾心elisa、雙夾心elisa、競爭elisa、阻斷elisa及抗體捕捉elisa3。本次試驗(yàn)所要用到的是競爭性酶聯(lián)

5、免疫吸附試驗(yàn)（即競爭elisa），elisa測定的基礎(chǔ)是竟?fàn)幮悦嘎?lián)免疫抗原抗體反應(yīng)，所有的免疫反應(yīng)都在微孔中進(jìn)行4。當(dāng)加入氯霉素酶標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)或樣液、抗體(兔igg即兔抗氯霉素的抗體)后，存在于樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液中的游離氯霉素和酶標(biāo)記氯霉素相互競爭與氯霉素特異性抗體的結(jié)合位點(diǎn)。由于微孔板中已包被有羊抗兔igg的抗體，所以氯霉素抗體與羊抗體相結(jié)合而被固相化在微孔中，與氯霉素抗體結(jié)合的氯霉素酶標(biāo)記物也因此被保留在微孔中，沒有被結(jié)合的氯霉素酶標(biāo)記物和未固相化的物質(zhì)在洗滌步驟中被去除。之后將底物溶液加入微孔中孵育,氯霉素酶標(biāo)記物中的酶通過與底物反應(yīng)，將無色的底物催化為藍(lán)色的產(chǎn)物,加入反應(yīng)終止液可使顏色由藍(lán)

6、變黃。用酶聯(lián)免疫檢測儀（酶標(biāo)儀）在450nm處測量吸光度值，樣品中氯霉素濃度與吸光度值成反比。氯霉素(chloramphenicol,簡稱cap)，又稱氯胺苯醇,是一種廣譜抗生素5。由于其價(jià)廉及優(yōu)良的抗菌性、穩(wěn)定的藥性，曾在一段時(shí)間內(nèi)作為飼料添加劑和細(xì)菌性疾病的治療用藥，特別是在水產(chǎn)品中，使用范圍較廣6。但氯霉素對骨髓造血機(jī)能有抑制作用，可引起血小板減少性紫癜、粒細(xì)胞缺乏癥、再生障礙性貧血，腹脹、腹瀉、食欲減退，口腔粘膜充血、疼痛、糜爛、口角炎和舌炎等。另外還可引起視神經(jīng)炎、視力障礙、多發(fā)性神經(jīng)炎、神經(jīng)性耳聾以及嚴(yán)重失眠。因此，動(dòng)物源性食品中氯霉素的殘留受到世界各國和地區(qū)的高度重視。歐盟、美國

7、、加拿大等國家禁止在食用動(dòng)物中使用氯霉素，歐盟規(guī)定進(jìn)口食品中氯霉素不得檢出，方法檢出限要求為0.3ug/kg7。目前公布的氯霉素檢測技術(shù)方法有微生物法、放射免疫法、氣相色譜法(gc)、液相色譜法(hplc)、質(zhì)譜分析等8,這些方法各有優(yōu)劣。酶聯(lián)免疫法(elisa)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高，樣品預(yù)處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，且不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，能在短短的幾小時(shí)內(nèi)檢測幾十個(gè)到上百個(gè)樣品，非常適合大批量樣品的檢測工作9。酶聯(lián)免疫檢測法(elisa)又稱酶標(biāo)法。本實(shí)驗(yàn)采用競爭elisa法對魚、蝦類水產(chǎn)品中的氯霉素的殘留量進(jìn)行了測定。1材料與儀器1.1實(shí)驗(yàn)樣品花蓮（編號為1號樣品）；鱸魚（編號為2號樣品）；甲魚（

8、編號為3號樣品）；南美白對蝦（編號為4號樣品）。備注：以上樣品均已剪碎并用勻漿機(jī)勻漿，放在冰箱冷凍室冷凍保存。1.2實(shí)驗(yàn)試劑氯霉素檢測試劑盒（荷蘭euro-dia gnosticn公司），乙酸乙酯(ar)，正己烷（ar）；其中檢測試劑盒包括：128孔板，包被有抗兔igg的羊抗體；6瓶氯霉素標(biāo)準(zhǔn)濃縮液1ml；酶結(jié)合物溶液(cap-hrpo)；氯霉素抗體濃縮液(anti-cap)；零標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（zero standard buffer）；洗滌緩沖液（rinsing buffer）；底物溶液（substrate solution）；樣品稀釋緩沖液。1.3實(shí)驗(yàn)儀器離心機(jī)（80-2，金壇市恒豐儀器制造有

9、限公司）；分析天平（pl202-s，上海優(yōu)浦科學(xué)儀器有限公司）；微型漩渦混合儀（vx200labnet，上海天呈生物醫(yī)學(xué)）；氮吹儀（n- evap111，美國organomation公司）5；酶聯(lián)免疫檢測儀（酶標(biāo)儀，550，北京利康達(dá)圣科技發(fā)展有限公司）；移液搶（nx16-0.2-2ul，美國labnet）。2 方法2.1樣品預(yù)處理樣品解凍：將放在冰箱冷凍室的樣品取出，室溫下解凍。樣品提?。壕_稱取3.0g經(jīng)解凍后的樣品至10ml具塞玻璃離心管中加入6ml乙酸乙酯，均質(zhì)3min放置3060min混勻，2000r/min離心10min用移液搶移取2ml上清液至10ml玻璃試管中用氮?dú)庠?0水浴中

10、吹干。加入1ml正己烷溶解脂肪、色素等雜質(zhì)加入1ml樣品稀釋緩沖溶液（使用前需用蒸餾水稀釋4倍）快速、充分振蕩混勻2000r/min離心4min（若發(fā)生乳化現(xiàn)象，需將試管放置于80水浴中5min，然后再離心）取下層水相溶液于塑料小離心管內(nèi)，用于檢測分析。2.2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒回溫：使用之前應(yīng)先將試劑盒及盒內(nèi)所有試劑恢復(fù)至室溫2025（提前30分鐘從冰箱取出即可）。試劑準(zhǔn)備：將凍干品（又稱氯霉素酶結(jié)合物cap-hrpo）和氯霉素抗體濃縮液(anti-cap)分別加入4ml零標(biāo)準(zhǔn)緩沖液充分溶解6，備用。上板：在微孔板中按順序依次加入100ul零標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（zero standard buffer

11、，作為空白對照）50ul標(biāo)準(zhǔn)濃縮溶液（2，0.5，0.2，0.1，0.05，0.025ng/ml和零標(biāo)準(zhǔn)溶液）50ul處理好的樣品溶液再在上訴各孔中依次加入25ul稀釋了的酶結(jié)合物溶液25ul稀釋了的抗體溶液搖板1min封板，4下在暗處溫育1小時(shí)。洗板：將微孔板上端朝下倒空各孔后，再平穩(wěn)快速向下垂直甩動(dòng)，并將微孔架倒置在吸水紙上拍打以除去孔中的液體，吸取洗滌緩沖液（rinsing buffer，20倍濃縮，用前需用水稀釋20倍）250ul/孔注入全部板孔，再次倒掉微孔中的液體。重復(fù)上述操作3遍。注意一定要把孔中的液體拍干，若孔中有氣泡用槍頭捅破。將100ul底物溶液（substrate sol

12、ution，即時(shí)可用）加入各孔，室溫（25）暗處溫育30min。最后將100ul終止液（stop solution，即時(shí)可用）加入各孔，混勻后，在10min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測量吸光度值。3 結(jié)果與分析3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作采用酶標(biāo)儀測定吸光度值，測定結(jié)果是450nm處吸光度最大。以標(biāo)準(zhǔn)溶液0.000（零標(biāo)準(zhǔn)）、2.000、0.500、0.200、0.100、0.050、和0.025ng/ml各50ul，標(biāo)樣的孔中均依次加入25ul酶結(jié)合的氯霉素(acp-hrpo)和25ul氯霉素抗體溶液(anti-cap)，以100ul零標(biāo)準(zhǔn)緩沖液作為空白試樣進(jìn)行對照實(shí)驗(yàn)。重復(fù)測定2次。以標(biāo)準(zhǔn)溶液(包括

13、零標(biāo)準(zhǔn)a0)扣除空白后的吸光度a作為測定結(jié)果10，如表3.1所示。表3.1 氯霉素檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線折算對應(yīng)測定值表standabsorbance 1absorbance 2mean abs(abs-blanc)% maxconc（ng/ml）02.0862.1742.088100.020.3480.3550.31014.81.750.50.6790.6900.64330.80.540.20.8910.9720.89042.60.230.11.1531.1491.10953.10.110.051.3451.4111.33664.00.050.0251.5801.6021.54974.20.02bla

14、nc0.0400.044以氯霉素平均濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)（x），標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度與零標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的百分比值(a/a0)為縱坐標(biāo)（y），由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)回歸統(tǒng)計(jì)制得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3.1所示。圖3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線由圖3.1及計(jì)算機(jī)回歸所得在0.0252.000ng/ml范圍內(nèi)，樣品中氯霉素含量（x,ng/ml）與吸光度之比（y=a/a0,%）的關(guān)系曲線為：y=-13.653ln(x)+22.467相關(guān)系數(shù)r=0.9954。3.2樣品中氯霉素濃度的測定在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的同時(shí)，吸取花蓮（1號樣品），鱸魚（2號樣品），甲魚（3號樣品），南美白對蝦（4號樣品）的樣品提取液各50ul做同步實(shí)驗(yàn)，各孔中均依次加入25u

15、lcap-hrpo和25ulanti-cap，以100ul零標(biāo)準(zhǔn)緩沖液作為空白對照。重復(fù)進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)，根據(jù)方程y=-13.653ln(x)+22.467計(jì)算得到試樣溶液和原待測樣品中氯霉素含量，結(jié)果見表3.2。表3.2 樣品中氯霉素含量檢測結(jié)果編號檢測樣品氯霉素檢測含量(ng/ml)平均檢測含量國標(biāo)限量12ng/mlug/kg0.3(ug/kg)1花蓮0.0090.0120.01050.0112鱸魚0.0120.0100.0110.0113甲魚0.0140.0130.01350.0144南美白對蝦0.0090.0090.0090.009由表3.2可以看出，1號樣品花蓮檢測出的氯霉素濃度為0.0

16、11ug/kg，2號樣品鱸魚檢測出氯霉素的濃度為0.011ug/kg，3號樣品甲魚檢測出的氯霉素濃度為0.014ug/kg，4號樣品南美白對蝦檢測出的氯霉素濃度為0.009ug/kg。檢測結(jié)果表明，4個(gè)所測試的水產(chǎn)樣品（花蓮，鱸魚，甲魚，南美白對蝦）中氯霉素含量均低于國標(biāo)限量值0.3ug/kg，符合動(dòng)物源性食品出口歐盟和美國等國家的要求，可以安全進(jìn)入市場。3.3加樣回收率實(shí)驗(yàn)將4號樣品南美白對蝦準(zhǔn)確稱取3.0g于10ml玻璃試管中，共3份，分別加入氯霉素標(biāo)準(zhǔn)液(10ng/ml)120.0ul，加入6.0ml乙酸乙酯，在通風(fēng)櫥內(nèi)混合10min。按2.1進(jìn)行樣品預(yù)處理，然后按照2.2進(jìn)行上板檢測。

17、計(jì)算加標(biāo)回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3.3所示。表3.3 氯霉素加樣回收率檢測結(jié)果原樣測定值（ng/ml）添加量（ng/ml）測定值（ng/ml）回收率%0.0090.40.37892.30.0090.40.37290.00.0090.40.38493.8從表3.3可見，氯霉素的加樣回收率在90.0%93.8%之間，平均值為92.0%，可見在實(shí)驗(yàn)過程中氯霉素的損失量較少。4 總結(jié)與討論利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（elisa法）檢測動(dòng)物組織中氯霉素的殘留量。elisa是酶標(biāo)記的抗原與抗體進(jìn)行的抗原-抗體反應(yīng)。由于酶的專一性催化作用，微孔板上多份樣品同時(shí)檢測，故操作簡單，靈敏度、精密度較高。本實(shí)驗(yàn)的方法檢出限

18、為0.3ug/kg，回收率在90.0%93.8%之間，平均值為92.0%。且在0.0252.00 ng/ml測量范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9954。氯霉素含量(x,ng/ml)與吸光度之比（y=a/a0,%）的線性方程為y=-13.653ln(x)+22.467。結(jié)果表明，采用酶聯(lián)免疫法測定，不僅檢測限達(dá)到ng級，而且回收率、精密度都能滿足要求國際標(biāo)準(zhǔn)，尤其是操作簡單，檢測時(shí)間短（僅需2h），所以非常適合大批量樣品的篩選檢測。但考慮到酶聯(lián)免疫法檢測的影響因素較多，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，最好采用本法篩選，陽性樣品再用gc-ms聯(lián)用技術(shù)或hplc確證，則可獲得更加準(zhǔn)確的檢出結(jié)果10。隨著國際健康組織對氯霉素的嚴(yán)格控制，尤其是日本肯定列表制度的出臺更是大大提高了世界各國對違禁藥物的重視。我國也實(shí)行了氯霉素零檢出量的規(guī)定。因此，建立氯霉素的快速