JHBP和JHAMT基因RNA based轉基因棉花評價報告

1、JHBP和JHAMT基因RNA-based轉基因棉花評價報告一、 室內條件下轉基因棉花對棉鈴蟲的抗性鑒定（一）研究材料與試驗方法1 、試驗材料供試昆蟲:室內不接觸任何藥劑飼養(yǎng)的棉鈴蟲品系的初孵幼蟲 供試棉葉:轉基因植株和對照植株上采取的新鮮棉葉WO: 采自作為對照的陸地棉 W0GFP:采自作為對照的表達GFP基因dsRNA的轉基因棉花JHBP11和JHBP14:采自表達保幼激素結合蛋白基因（JHBP1） dsRNA的不同 克隆的轉基因棉花JHAMT389:采自表達保幼激素甲基轉移酶（JHAMT ） dsRNA的轉基因棉花 2、試驗方法從田間健康的棉花植株上采取新鮮的倒三葉，以表達JHBP和JH

2、AMT基因dsRNA的轉基因棉花為試驗材料，以陸地棉 W0和 以表達GFP基因dsRNA的轉基因棉花為對照，研究了室內條件下轉基因棉花對 標靶害蟲棉鈴蟲的抗蟲效果， 以及田間條件下對棉田節(jié)肢動物群落的影響， 具體 包括調查靶標害蟲、非靶標害蟲和天敵的田間變化動態(tài)。放置在冰盒中直至使用。 將棉 葉表面的水分用吸水紙吸干并將葉柄處剪成斜面， 包裹以濕潤的脫脂棉球 （棉球 水量不宜過多），之后平整地放置于培養(yǎng)皿內。每張棉葉接種 5 頭棉鈴蟲初孵幼 蟲，后覆蓋 3層吸水紙，蓋緊培養(yǎng)皿蓋子，防止幼蟲逃逸。每 10 張葉片為一個 重復，每個處理設3個重復。將接種好的棉鈴蟲置于261恒溫，光周期（14L:

3、10D）的光照養(yǎng)蟲室進行觀察。每天對脫脂棉球加水以保證其濕潤。接種后第六 天更換新鮮葉片，飼養(yǎng)至第1 0天，并記錄第 6天及第10天接種棉鈴蟲的死亡率、 生物量、平均體重和葉片的受損情況，并計算相應的校正死亡率。校正死亡率（）=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（100-對照組死亡率）X 100 為保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性及可靠性，分別于 2012年、2013年和 2015年進行重 復試驗，試驗內容和檢測指標均采用同一標準。（二）結果與分析 我們對選取的針對兩個保幼激素相關基因的三種轉基因棉花材料進行了室 內的生物測定，從三年的室內生測數(shù)據(jù)可以看出不論是接種后第 6 天還是第 10 天，與對照相比，喂食

4、這幾種轉基因棉花葉片的棉鈴蟲，死亡率顯著上升，存活 幼蟲的體重也明顯減少，棉鈴蟲的生長發(fā)育收到了嚴重抑制（表1-1， 圖 1），說明這三種轉基因棉花在室內條件下對棉鈴蟲都有較好的防治效果， 盡管不能完 全殺死棉鈴蟲， 但是能夠顯著的抑制其生長。 此外，通過比較接種后第 6天和第 10天的棉花葉片的受害情況（圖 1-2），我們不難看出，相比對照品種，這 3種 轉基因棉花的受害情況都有不同程度的減輕，這也是其抗蟲性的一個有力體現(xiàn)。6dW010d201220132015平均體重（mg）11.37 1.17a死亡率（）5.33 1.15b校正死亡率 （）0.00 0.00b生物量（mg）53.47 4

5、.92a平均體重（mg）11.97 0.13a死亡率（）2.00 2.00c校正死亡率 （）0.00 0.00b生物量（mg）平均體重（mg）死亡率（）校正死亡率 （）生物量（mg）表1-1表達dsRNA的轉基因棉花對棉鈴蟲的抗性生測73.83 0.74A5.33 1.15C0.00 0.00C348.87 9.29A75.47 0.60A7.00 4.36C0.00 0.00C58.58 0.74a 350.44 19.04A11.48 0.50a71.59 1.78A6dGFP10d6dJHB P1-110d6dJHB P1-410d6dJHAMT -38910d3.00 1.15c0.0

6、0 0.00c7.00 2.31D0.00 0.00D55.45 3.19a 334.19 15.67A11.18 0.13a72.80 1.30A3.58 0.41b27.63 2.94B4.13 0.39b23.60 1.97B3.18 0.19b25.43 1.10B4.67 1.15b9.33 1.15C17.33 2.31a38.67 1.15A18.00 2.00a28.67 1.15B16.00 2.00a30.67 3.06B-0.67 1.21b52.95 1.15a11.27 0.42a4.00 0.00bc2.04 0.00ab4.26 1.22C12.71 2.44a3

7、5.23 1.22A13.41 2.11a24.67 1.22B11.30 2.11a26.79 3.23B329.63 5.56A71.48 3.25A9.22 1.07C2.39 1.15C53.89 2.28a 324.75 12.97A11.00 0.29a72.15 2.88A5.00 1.15c1.72 1.19c9.00 2.31D1.79 2.48D52.26 1.42a 330.18 21.48A15.82 0.22b3.60 0.25b18.57 3.09a17.01 3.12a14.74 040b3.85 0.26b17.00 5.03c14.78 5.12b15.94

8、0.61b83.70 7.81B16.98 1.81b84.67 9.11B13.09 1.09b87.43 7.80B25.73 1.79B44.00 3.46A39.79 3.72A73.17 11.37B26.0743.0039.0773.12 0.32B 1.15B 1.24C 2.55B3.98 0.21b14.67 5.03a12.93 5.14a16.98 1.57b4.08 0.43b19.00 5.03b16.84 5.19b16.61 2.89b23.87 1.88B28.67 6.43B23.30 6.91B85.33 12.89B24.3233.0028.3281.13

9、 1.71B 3.06C 3.29C 8.02B3.36 0.56b26.77 2.64B12.67 3.06ab10.88 3.12ab14.78 2.10b3.68 0.34b16.67 2.31b14.09 2.38b15.30 1.54b27.11 0.96B21.62 1.03B102.92 8.15B26.7733.0027.6089.48 1.15B 3.06C 3.29B 7.35B數(shù)據(jù)為平均數(shù)標準誤，不同的字母代表差異性顯著（單因素方差分析,PV 0.05)姜盪/ 圖1-1接種后10d棉鈴蟲的生長情況GFP圖1-2接種后6d和10d棉花葉片的的受害情況JA-389 JBMJB

10、14:珀10 dpi轉基因棉花對對棉田節(jié)肢動物群落的影響（一）試驗材料與試驗設計1、試驗材料本次調查包括3種不同類型的棉花：作為對照的陸地棉W0及兩種新型轉基因棉花 W0 :作為對照的陸地棉 W0JHBP:表達保幼激素結合蛋白基因（JHBP1） dsRNA的轉基因棉花JHAMT:表達保幼激素甲基轉移酶（JHAMT）dsRNA的轉基因棉花2、試驗設計根據(jù)2012年室內的生物測定數(shù)據(jù)顯示，表達兩種昆蟲激素 dsRNA的轉基因棉花 表現(xiàn)出一定的抗蟲性，因此我們于 2013年在田間調查了這兩類棉花對棉田節(jié)肢 動物群落的影響，以評價其生物安全性。分別于2013年7月16日、7月23日、7月30日、8月6

11、日、8月12日、8月20日、8月28日、9月3日和9月12日對種植各個品種棉花的棉田進行調查， 主要調查對象為害蟲及其天敵的種群數(shù)量。調查方法采用對角線五點取樣法（崔 金杰和夏敬源，2000）,每個小區(qū)每次調查5個樣點，每個樣點連續(xù)跨雙行調查5株棉花，共25株。詳細調查取樣范圍內地面和植株上昆蟲的種類和數(shù)量，并作詳細記載，具體的調查內谷如下所示：棉田中的靶標害蟲：棉鈴蟲的卵、幼蟲，為害棉株蕾鈴數(shù)； 棉田中的非靶標害蟲：煙粉虱，棉蚜，棉大卷葉螟，盲蝽蟓、盲蝽為害株； 棉田中的天敵：草蛉卵、幼蟲、成蟲，瓢蟲卵、成蟲，蜘蛛等。（二）結果與分析根據(jù)田間7、8月份及9月上旬的調查顯示，此次田間調查共 9

12、次，根據(jù)這9次 的調查結果，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，以便更直觀的了解田間害蟲和天敵的發(fā)生情 況。1、靶標害蟲的田間變化動態(tài)2.3統(tǒng)計了不圖2.1顯示在7月下旬及8月下旬為棉鈴蟲產卵的兩個高峰期，這與長江中 下游地區(qū)棉鈴蟲的發(fā)生世代是相吻合的。 此外，從百株卵量上可以看出棉鈴蟲對 這三種棉花沒有產卵的偏好性。圖2.2顯示棉鈴蟲幼蟲數(shù)的變化趨勢，在整個7、 8月份棉鈴蟲的幼蟲均處在一個相對較低的水平，這可能與當?shù)貧夂蛴嘘P，由于 降水過多，導致棉鈴蟲卵的孵化效率較低，從而幼蟲數(shù)量一致維持在較低水平。 9月上旬，幼蟲數(shù)量有急劇的上升，但轉基因棉花的幼蟲數(shù)量還是明顯低于對照 品種，表明，在田間條件下轉基因棉

13、花表現(xiàn)出了一定的抗蟲性。圖同品種棉花的被害蕾鈴數(shù)，在 7月23日左右，被害蕾鈴數(shù)達到一個小高峰，根 據(jù)上述的結果，雖然整個7月份棉鈴蟲的幼蟲數(shù)量都比較少，但在7月下旬幼蟲 數(shù)量也達到了約20頭/百株，也可以對棉花造成一定的危害，在 9月的上旬，被 害蕾鈴數(shù)數(shù)達到了較高水平，這也與上文中提到的幼蟲數(shù)量的變化是一致的，且轉基因品種相比對照受到的為害略輕。因此我們認為在田間條件下轉基因棉花相 比對照品種表現(xiàn)出了一定的抗蟲性。桶鈴蟲卵r JHB P堤鈴蟲卵瑩/百株ljhawWO一石二6圖2.1不同類型棉田棉鈴蟲的卵量變化棉鈴蟲幼蟲圖2.2不同類型棉田棉鈴蟲的幼蟲數(shù)量變化郴鐵蟲百樣蟲塑JHBPJHAMr

14、WO棉花被害蕾鈴乂 m 旳 m 汕 O2 7 11 榊花破弟鈴數(shù)/百抹JHBPJHAWTWO圖2.3一巨弓一耳益一八善不同類型棉田棉花被害蕾鈴的數(shù)量變化2、非靶標害蟲的田間變化動態(tài)高峰一般在第七圖2.4顯示棉田棉蚜數(shù)量大致以15天為單位呈現(xiàn)升降變化，天，根據(jù)資料顯示，蚜蟲的生長溫度大約在 25C-3O0C。從南京的7、8月的天氣 情況可以分析出，由于7月雨水天氣比較多，導致棉蚜數(shù)量少，8月氣溫回升，有 利于蚜蟲生長，導致蚜蟲數(shù)量有所上升。由于棉蚜為非靶標害蟲， 所以各品種棉 田中的數(shù)量與棉花種類關系不大。 從圖2.5中可以看出煙粉虱的發(fā)生在7月中下旬 大致呈遞增趨勢，進入8月份以后趨勢比較平緩

15、，在3個棉花品種中的分布也沒有 規(guī)律性，由此可得出煙粉虱在棉田的分布與棉花種類無關。圖 2.6和2.8顯示的是 各品種棉花上的棉盲蝽變化和盲蝽為害情況， 棉田內的盲椿象數(shù)目一直保持在一主要是盲蝽蟓是非靶轉基因棉花在對非個較低的水平，且三個棉花品種之間也沒有明顯的偏向性， 標害蟲，對不同品種棉花沒有選擇性所致。綜合上述的結論, 靶標害蟲的影響方面與對照品種沒有明顯差異。棉蚜60005000棉 蚜 百 株 蟲 量400030002000-JHB P-JHAMT1000十 BD1B月圖2.4不同類型棉田棉蚜的數(shù)量變化圖2.5不同類型棉田煙粉虱的數(shù)量變化8 7 6 5 4 3 2 煙粉虱百株蟲量盲蝽J

16、HBPO O O O O O O7 6 5 4 3 2 1 盲蜻百株蟲量flul n月flu2B月UflusB月/RT2B月/R日VI0月/圖2.6不同類型棉田盲蝽的數(shù)量變化盲蝽被害株-JHB P*JHAMT*W0盲蜻被害株/百株HZAZ 0月圖2.7不同類型棉田盲蝽被害株的數(shù)量變化3、天敵的田間變化動態(tài)圖2.7顯示不同品種的棉田中草蛉卵會有所差異，但是總體趨勢還是一致的，7月中旬和8月草蛉產卵量都比較少，7可能是因為降雨量大導致的草蛉活動量減 少或雨水沖刷導致卵減少都是可能的原因。圖2.8顯示各棉花品種的草蛉成蟲都比較少，可能主要是是由于卵的基數(shù)較低，導致蟲口數(shù)量一直不大。圖2.9和圖2.1

17、0可以看出瓢蟲和蜘蛛的數(shù)量和棉田種類關系不是很大，一般認為天敵的數(shù)量 和害蟲直接相關，由于瓢蟲和蜘蛛食性廣，所以害蟲的增加，會直接導致天敵瓢 蟲和蜘蛛的數(shù)量上升，但天敵數(shù)目的多少與當?shù)氐挠晁?氣溫等氣候情況也是緊 密相關的。以上結果表明轉基因棉花在對天敵的影響方面與對照品種沒有明顯差 異。200180草蛉卵160140100806040200JHBP日TO 0月k bzaz 0月圖2.7不同類型棉田草蛉卵的數(shù)量變化草蛉成蟲3.5草 蛉 成 蟲 百 株32.521.5JHB P-*-JHAMT蟲量50SJ2 0月日 t- 0月BAZ 0月日，0月圖2.8不同類型棉田早蛉成蟲的數(shù)量變化瓢蟲瓢 蟲

18、 百 株 蟲 量-*-JHAMTJHBPR日y 0月bu3b月bu2 0月日，n月Rul 0月圖2.9 不同類型棉田瓢蟲的數(shù)量變化圖2.10不同類型棉田蜘蛛的數(shù)量變化3 3 2 2 1 1 蜘蛛百株蟲量棉花作為世界性的重要經(jīng)濟作物，產生的天然纖維是重要的紡織工業(yè)原料。然而隨著環(huán)境惡化，棉花在其生長區(qū)域頻繁遭受著干旱、高鹽、低溫等非生物以及病蟲害等生物脅迫的侵襲，嚴重影響著棉花的生長發(fā)育和產量。世界上各產棉 國培育開發(fā)的抗蟲棉絕大多數(shù)為轉Bt基因棉，然而Bt作物的廣泛種植可能導致靶標害蟲在持續(xù)的選擇壓力下，對Bt毒素產生抗性，并且，已經(jīng)有研究顯示，因田間抗性導致Bt毒素對靶標生物仿效下降的現(xiàn)象已

19、經(jīng)在7種害蟲中得到發(fā)現(xiàn)，其中有兩類害蟲是對 Bt制劑產生了抗性(Tabashnik et al. 1990; Janmaat and Myers. 2003)有 5 類是對轉 Bt作物產生了抗性Van Rensburg 2007; Tabashnik et al. 2008;此外，轉基因隨著生育期進 因而，目前因此，將與Storer et al. 2010; Dhurua and Gujar 2011; Gassna nn et al. 2011)。 抗蟲棉僅對低齡幼蟲抗性較強， 而對高齡幼蟲效果不明顯。同時， 展，轉基因抗蟲棉后期的抗蟲能力不斷下降，仍需化學防治來輔助。 推廣和應用的轉基因抗

20、蟲棉遠不能從根本上解決棉花害蟲為害問題。 棉花抗蟲性的有關基因進行遺傳轉化以及功能驗證，顯得尤為重要。昆蟲的生長發(fā)育、脫皮、變態(tài)、滯育、生殖、多型現(xiàn)象等生理過程以及行為 反應等，都離不開激素的參與。腦激素、保幼激素和蛻皮激素又合稱昆蟲變態(tài)激 素。目前已模擬合成多種保幼激素和蛻皮激素(昆蟲生長調節(jié)劑)，并用于害蟲防治或益蟲利用。這類物質能干擾蟲體內的激素平衡，破壞其正常生長發(fā)育、變態(tài)和生殖，且對高等動物毒性小，不污染環(huán)境，被稱為第3代殺蟲劑(Mulla,1995)。保幼激素(JH，juvenile hormone)由咽側體分泌，又叫咽側體激素，主 要起保持幼蟲狀態(tài)、抑制蛻皮和變態(tài)的作用 (Mas

21、ner et al., 1987)，保幼激素的生 物合成途徑主要是：乙酸、丙酸-甲羥戊酸(MVA)-異戊烯基焦磷酸(IPP)-焦磷酸法呢酯-法呢酸（FA）-保幼激素。甲基酯化和環(huán)氧化是JH合成的特有反應， 相應的JHAMT、JH環(huán)氧化酶也是JH合成的特有的反應酶。JH在體內經(jīng)過保幼激素酯酶（JHE）的作用變成保幼激素二醇，經(jīng)過耦合作用排除體外。JHBP也是JH途徑中的關鍵蛋白，在JH從合成部位向作用部位轉運過程中起保護作用，使JH不被非特異的酯酶降解（Suzuki et al., 2011）（圖3-1）。ilsopentaryl PPPP_y_hoflw-FatfWiyii PPConserv

22、ed in eukaryotes,archaea, and some bacteriaI JH epoHidnBhomeyqdPeculiar JH branch among insecta：%Free JH IIJHEHJH Illi 心JH II diolJHSP / JHL Targ1 tnsufl I organJH II-JhBP complex保幼激素的代謝分析Hr圖3.1RNAi介導的基因沉默已經(jīng)廣泛的應用到了各類昆蟲群體中，并將成為害 蟲防治中的一種新的手段和技術。陳曉亞實驗室和孟山都公司分別報道利用植物 自身表達昆蟲基因的雙鏈 RNA成功抑制植食性昆蟲對植物的侵害，研究人員首

23、 先利用植物表達與昆蟲特定基因匹配的 dsRNA分子，當昆蟲取食這類植物后, 其靶標基因的表達明顯降低，生長被抑制從而達到了一定的抗蟲效果（Baum et al., 2007; Mao et al., 2007, 2011; Tian et al. 2009; Zhu et al., 2011; Zhu et al. 2012這一 技術的優(yōu)點在于只對植食性的昆蟲有抑制作用，而且通過表達不同序列的 dsRNA還可以對某一種或某一屬昆蟲的生長發(fā)育起作用，起到精確、安全控制 蟲害的目的。本研究所選用材料正是保幼激素相關基因RNA-based轉基因株系。我們研究發(fā)現(xiàn)，表達保幼激素結合蛋白基因（JHB

24、P1）和表達保幼激素甲基轉移酶（JHAMT ） dsRNA的轉基因棉花在室內條件下均表現(xiàn)出對靶標害蟲棉鈴蟲較好 的抗性效果，能夠有效的抑制棉鈴蟲的生長和對棉花的為害，在田間條件下，受氣候和耕作制度等的影響，轉基因棉花沒有表現(xiàn)出極大的抗蟲優(yōu)勢，但是也有一定的抗蟲效果。此外，通過對其他非靶標害蟲和天敵等的調查，我們得出，相比對照品種而言，轉基因的棉花對其沒有影響。因此，鑒于這種轉基因棉花良好的 抗蟲性和對天敵的無害性，可以作為抗蟲材料予以開發(fā)和推廣，此外，也可以作為基因疊加策略的備選基因，在抗藥性治理方面發(fā)揮作用。參考文獻崔金杰，夏敬源.轉Bt基因棉田昆蟲群落多樣性及其影響因素研究J.生態(tài)學報,

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