莖特異表達基因EST測序分析及RNA微陣列驗證.doc

1、莖特異表達基因EST測序分析及RNA微陣列驗證莖在植物體內(nèi)水分、 無機鹽和有機物質(zhì)的運輸中發(fā)揮功能， 并對水稻的產(chǎn)量 和品質(zhì)具有重大的決定作用。 為了對水稻莖中基因表達譜和莖特異基因有一更好 地了解，我們以水稻45葉期莖為實驗材料構(gòu)建cDNA文庫，并對其進行EST 測序和生物信息學(xué)分析， 發(fā)現(xiàn)一些高豐度表達基因， 為驗證這些基因是否為莖特 異性基因，選取9個EST克隆為探針，與容量為755個不同水稻表型的RNA微陣 列雜交。本研究主要結(jié)果如下：1 從水稻莖cDNA文庫中隨機挑取4704個克隆進行 3端測序，共獲得 3652 條可讀序列，經(jīng)生物信息學(xué)分析，共獲得 2683條 有效ESTs并對其中

2、2485條3端具Poly(A)尾的ESTs作進一步分析；另外2630 條序列已被GenBank收錄。 2 本研究利用自主開發(fā)的分析軟件 DNAuse， 結(jié)合人工精確判斷，對 2485 條具有 Poly(A) 尾的序列進行了冗余度分析，共獲 得 1903條獨立基因，占全部序列的 76.6。其中低豐度表達基因 1591 條，占獨立基因總數(shù)的 83.6；中豐度表達基因 282條，占獨立基因總數(shù)的 14.8；高豐度表達基因 30條，占獨立基因總數(shù) 1.6， 其中最高的包含21個ESTs說明在水稻莖組織中表達的基因絕大部分呈中、低 豐度表達。3. 1903條獨立基因與GenBank水稻數(shù)據(jù)庫進行BLAS

3、TS匕對，首次建立了水稻莖組織特異表達基因數(shù)據(jù)庫。 通過對數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)， 新基因 1066條， 占56.0；功能已知基因 353條，占 1 8.5 ；有染色體定位信息的基因 593條， 占 31.2；既有功能注釋又有染色體定位的基因 109條，占 5.7。說明水稻莖組織中大部分基因為新基因， 意味著大量基因可能在水稻莖組織 中特異表達。 4 結(jié)合擬南芥基因功能分類方法，將 353 條有功能注釋基因 劃分為 11大類：蛋白合成和降解基因 (PRO,21.6 ) 、代謝基因 (MET,17.3 ) 、 能量基因(ENG 13.5 %)、逆境反應(yīng)基因(RES 12.9 %)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因(COM,

4、8.3%)、 功能分類不明確基因(MIS,7.6 %)、轉(zhuǎn)錄基因(SCR,7.6 %)、細胞結(jié)構(gòu)相關(guān)基因 (BIO、5.5 %)、細胞生長、分裂和DNA合成基因(GRO,1.3%)、細胞內(nèi)運輸基因 (TRA、4.3 %)和發(fā)育基因(DEV 0.1 %)。5 在高豐度表達且有功能描述的基因中，發(fā)現(xiàn)葉綠體 a/b 結(jié)合蛋白 (light harvesting chlorophyll a/b-binding protein)基因表達豐度最高，表達頻率為 21，其次為伸長因子 (EF-lalpha) 和脫落酸和逆境誘導(dǎo)蛋白 (abscisic acid and stress 。 inducible p

5、rotein 人表達頻率均為 14。另外有富脯氨酸蛋白中roline ich protein, PRPR)微管蛋白(alpha帥 lin )、月類轉(zhuǎn) t 蛋白( hpid transfer protein ， LTPL 高度移動性群體蛋白偽igh mobility gTOUp protein, HMG和苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase , PAL 等 20 個基因。6. RNA微陣列雜交結(jié) 果表明，高度移動性群體蛋白、 伸長因子和過氧化氫酶存 在共調(diào)控表達； 高度 移動性群體蛋白在各表型中表達變化波動不大， 是看家 基因；脂類轉(zhuǎn)運蛋白和 富脯氦酸蛋白的基因表達譜具很大的相似性；葉綠素 a /b結(jié)合蛋白在葉中高 豐度表達且受光誘導(dǎo)，是與光合作用相關(guān)基因。各基因在水稻不同部位(根、莖、葉)基因表達情況分析表明，微管蛋白在莖和根 中都具有較高的表達豐度， 說明根的纖維化和莖的木質(zhì)化是同一 生化過程；脫落酸和逆境誘導(dǎo)蛋白在莖中高豐度表達， 易于為環(huán)境因子所誘導(dǎo)，在莖中不能組成型穩(wěn)定表達， 不能認為是莖中特異性基因； 富脯氨酸蛋白在莖