流式細(xì)胞儀應(yīng)用簡(jiǎn)介

1、流式細(xì)胞儀標(biāo)本處理一般原則及方法流式細(xì)胞儀標(biāo)本處理一般原則及方法流式細(xì)胞儀使用一般方法及技巧流式細(xì)胞儀使用一般方法及技巧臨床流式細(xì)胞儀應(yīng)用簡(jiǎn)介臨床流式細(xì)胞儀應(yīng)用簡(jiǎn)介殷躍鋒殷躍鋒流式細(xì)胞儀原理介紹流式細(xì)胞儀原理介紹雙光源系統(tǒng)流式細(xì)胞儀在管道大約50倍直徑距離處，鞘液中心速度與邊緣速度達(dá)到穩(wěn)定，形成穩(wěn)定的層流。樣本與鞘液未入管道時(shí)，邊緣與中心速度一致。進(jìn)入管道后，受管壁粘性阻力邊緣速度下降，中心速度不變。流體形成層流后，會(huì)產(chǎn)生流體聚焦效應(yīng)，所有顆粒均被推致流速最快的液流中。顆粒以衡定的速度作勻速運(yùn)動(dòng)。無(wú)論每秒檢測(cè)數(shù)量為多少，顆粒經(jīng)過(guò)檢測(cè)區(qū)的速度是衡定的流式細(xì)胞儀標(biāo)本準(zhǔn)備流式細(xì)胞儀標(biāo)本準(zhǔn)備染色的一般

2、原則及方法染色的一般原則及方法標(biāo)本來(lái)源：標(biāo)本來(lái)源：外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他。外周血、骨髓、組織塊、培養(yǎng)細(xì)胞、脫落細(xì)胞及其他。根據(jù)各種具體實(shí)驗(yàn)，選用根據(jù)各種具體實(shí)驗(yàn)，選用不同的抗凝劑。不同的抗凝劑?？捎玫目鼓齽┤缦拢嚎捎玫目鼓齽┤缦拢篍DTA： 2mg/ml枸椽酸鈉：枸椽酸鈉：0.38%肝素：肝素：15IU/ml標(biāo)本處理時(shí)間：新鮮樣本分析時(shí)，樣本采集后應(yīng)立即分析樣本固定方法：樣本固定方法：1%的多聚甲醛或75%的酒精，作用30分鐘。注：不同的實(shí)驗(yàn)，所用的固定方法不完全相同。樣本處理標(biāo)準(zhǔn)試劑：樣本處理標(biāo)準(zhǔn)試劑：一、10%Bovine Serum Albumin BSA1. 溶

3、解10g BSA至100ml蒸餾水中2. 4C，20000 g離心30分鐘3. 分裝后-20C保存二、0.1% BSA-PBS緩沖液 1. 準(zhǔn)備500ml，PH7.3 PBS2. 加入5ml 10% BSA3. 使用0.45um濾網(wǎng)過(guò)濾三、氯化銨溶血?jiǎng)?1. 在一升蒸餾水中溶解8.29g NH4CL,1g KHCO3和37mg Na2EDTA 2. 調(diào)節(jié)PH值至7.23. 在使用前配置該溶血?jiǎng)?，并?.45um濾膜過(guò)濾方法一：溶血法方法一：溶血法1.取取100 ul抗凝全血；抗凝全血；2. 快速加入快速加入 2ml NH4CL溶血?jiǎng)┤苎獎(jiǎng)?混勻；混勻；3. 室溫孵育室溫孵育10分鐘；分鐘；4.

4、 4C，400g離心離心10分鐘。去上清，加入分鐘。去上清，加入2ml BSA-PBS；5. 4C，400g離心離心10分鐘。去上清，加入分鐘。去上清，加入2ml BSA-PBS；6. 4C，400g離心離心10分鐘。去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度至分鐘。去上清，調(diào)整細(xì)胞濃度至5x106/ml。富集白細(xì)胞富集白細(xì)胞注：注：化學(xué)試劑直接作用于紅細(xì)胞的溶血?jiǎng)┯校阂圆菟峄瘜W(xué)試劑直接作用于紅細(xì)胞的溶血?jiǎng)┯校阂圆菟釣橹鞯娜苎獎(jiǎng)橹鞯娜苎獎(jiǎng)–oulter Q-Prep），基于），基于NH4CL的的BD公司的公司的FACSLyse溶血?jiǎng)Ｈ苎獎(jiǎng)?。?yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：溶血時(shí)間快？，在流式細(xì)胞儀上可清楚地溶血時(shí)間快？，在流式

5、細(xì)胞儀上可清楚地將淋巴、單核、粒及紅細(xì)胞碎片相區(qū)分。將淋巴、單核、粒及紅細(xì)胞碎片相區(qū)分。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：需嚴(yán)格掌握溶血時(shí)間，對(duì)白細(xì)胞表面抗原有影響，需嚴(yán)格掌握溶血時(shí)間，對(duì)白細(xì)胞表面抗原有影響，隨時(shí)間細(xì)胞形態(tài)變化大。隨時(shí)間細(xì)胞形態(tài)變化大。方法二：密度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞方法二：密度離心法提取單個(gè)核細(xì)胞 Histopaque 1077為為Ficoll與與Sodium diatrizoate(泛影酸鈉泛影酸鈉)混合物，其密度為混合物，其密度為1.1191.077。通過(guò)離心可將全血中的粒。通過(guò)離心可將全血中的粒細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離。粒細(xì)胞沉積于細(xì)胞與單個(gè)核細(xì)胞分離。粒細(xì)胞沉積于1.1191.077的血漿的

6、血漿層，而單個(gè)核細(xì)胞則在層，而單個(gè)核細(xì)胞則在1.077以下的血漿層中。以下的血漿層中。 1. 準(zhǔn)備2ml抗凝血（根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求確定用血量）， 等量PBS稀釋?zhuān)?. 準(zhǔn)備1ml Histopaque 1077 (Sigma)；3. 室溫下700g離心30分鐘；4. 仔細(xì)將含有單個(gè)核細(xì)胞血漿層吸出；5. 加4ml BSA-PBS，400g離心10分鐘；6. 加2ml BSA-PBS清洗2次。操 作 淋巴節(jié)、扁桃體、脾、胸腺等淋巴組織淋巴節(jié)、扁桃體、脾、胸腺等淋巴組織由于結(jié)構(gòu)松由于結(jié)構(gòu)松散，容易分離成單個(gè)細(xì)胞。一般對(duì)樣本進(jìn)行切剪、研磨、過(guò)濾散，容易分離成單個(gè)細(xì)胞。一般對(duì)樣本進(jìn)行切剪、研磨、過(guò)濾便可。便

7、可。從組織獲取淋巴細(xì)胞從組織獲取淋巴細(xì)胞1. 將樣本置于陪替氏培養(yǎng)皿，加入將樣本置于陪替氏培養(yǎng)皿，加入15ml BSA-PBS；2. 將樣本切成將樣本切成3-4mm3大小，用鑷子將其分離；大小，用鑷子將其分離；3. 將樣本經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾，用密度法分離、提純淋巴細(xì)胞。將樣本經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾，用密度法分離、提純淋巴細(xì)胞。方方 法：法：其他標(biāo)本：其他標(biāo)本：通常在其他組織中分離淋巴細(xì)胞需用酶進(jìn)通常在其他組織中分離淋巴細(xì)胞需用酶進(jìn)行消化。對(duì)于不同標(biāo)本，處理方法也各不相同。行消化。對(duì)于不同標(biāo)本，處理方法也各不相同。制備大鼠腎臟浸潤(rùn)細(xì)胞制備大鼠腎臟浸潤(rùn)細(xì)胞解剖刀、解剖刀、CO2孵育箱、濾網(wǎng)孵育箱、濾網(wǎng)以及含以及含1m

8、g/ml膠原酶的細(xì)胞培養(yǎng)液（無(wú)血清）膠原酶的細(xì)胞培養(yǎng)液（無(wú)血清）材料：材料：方方 法：法：1. 將樣本置于皮氏培養(yǎng)皿，用解培刀切成小塊；將樣本置于皮氏培養(yǎng)皿，用解培刀切成小塊；2. 加入加入10ml膠原酶溶液，膠原酶溶液，37C CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)箱孵育30分鐘；分鐘；3. 濾網(wǎng)過(guò)濾；濾網(wǎng)過(guò)濾；4. 密度梯度法離心提純淋巴細(xì)胞。密度梯度法離心提純淋巴細(xì)胞。其他類(lèi)型細(xì)胞其他類(lèi)型細(xì)胞 在組織中提取細(xì)胞通常使用在組織中提取細(xì)胞通常使用酶消化法酶消化法。同樣對(duì)于不。同樣對(duì)于不同組織處理方法也各異，以下是講述通用的膠原酶消同組織處理方法也各異，以下是講述通用的膠原酶消化法制備組織細(xì)胞。改良后的此法尚可

9、用于制備人、化法制備組織細(xì)胞。改良后的此法尚可用于制備人、鼠上皮細(xì)胞。鼠上皮細(xì)胞。材材 料料1. 解剖刀解剖刀2. 0.15%胰蛋白酶胰蛋白酶3. Hankss緩沖鹽或緩沖鹽或PBS，pH7.34. 不含不含Ca、Mg離子的離子的HBSS5. II型膠原酶型膠原酶6. 1%BSA或或5%FBS7. 5ml的吸樣管的吸樣管8. 35um尼龍濾網(wǎng)尼龍濾網(wǎng)9. DNase1. 將樣本置于皮氏培養(yǎng)皿，加15ml BSA-PBS，將樣本切 成1mm3大小，用鑷子將其分離；2. HBSS或PBS洗清3. 加入10ml無(wú)Ca、Mg離子0.2% II型膠原酶溶液0.02% DNase 1的HBSS；4. 37

10、C搖床上孵育1560分鐘，視樣本類(lèi)型而定；操操 作作5. 用5ml的吸樣管反復(fù)吹打，制成單個(gè)細(xì)胞懸液；6. 使用35um濾網(wǎng)過(guò)濾，300g離心5分鐘；7. 用PBS或細(xì)胞培養(yǎng)液重懸樣本；對(duì)于某些樣本過(guò)濾后仍有小塊組織，重復(fù)第5步獲取細(xì)胞，重復(fù)第7步；8. 用含0.15%胰酶、0.02%DNase 1不含Ca、Mg的HBSS重懸， 37C孵育一段時(shí)間加入1%BSA或5%FBS，滅活酶活性。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 許多原代細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞系，都為貼壁型生長(zhǎng)。通常先用胰酶處理獲得單細(xì)許多原代細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞系，都為貼壁型生長(zhǎng)。通常先用胰酶處理獲得單細(xì)胞懸液，需注意消化過(guò)度會(huì)損害細(xì)胞，特別是改變其表面抗原標(biāo)記。

11、胞懸液，需注意消化過(guò)度會(huì)損害細(xì)胞，特別是改變其表面抗原標(biāo)記。準(zhǔn)備單細(xì)胞懸液準(zhǔn)備單細(xì)胞懸液1.儀器和試劑：儀器和試劑： 0.25%r EDTA,pH 7.20.25% 的胰酶的胰酶 10%血清的培養(yǎng)液血清的培養(yǎng)液2.方法：方法： a. PBS洗滌細(xì)胞；洗滌細(xì)胞； b. 加入加入0.25%有胰酶，有胰酶，37C處理處理28分鐘；分鐘； c. 倒置顯微鏡下觀察，至大部分細(xì)胞脫落懸浮后，加入含倒置顯微鏡下觀察，至大部分細(xì)胞脫落懸浮后，加入含10%血清的培養(yǎng)液。血清的培養(yǎng)液。 d. PBS液洗滌細(xì)胞，最后配成終濃度為液洗滌細(xì)胞，最后配成終濃度為1106/ml 的細(xì)胞懸液。的細(xì)胞懸液。樣 本 處 理抗體染

12、色一般方法 外周血白細(xì)胞分析：100ul全血 血小板分析：15ul全血（根據(jù)樣本血小板數(shù)量） 紅細(xì)胞分析：1ul全血（根據(jù)樣本中紅細(xì)胞數(shù)稀釋后使用） 骨髓：100ul 其他樣本，計(jì)數(shù)后決定使用體積目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量及檢測(cè)終濃度：目標(biāo)細(xì)胞數(shù)量及檢測(cè)終濃度：1106/ml細(xì)胞計(jì)數(shù)方法 傳統(tǒng)手工計(jì)數(shù)：耗時(shí)、準(zhǔn)確度差 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)：BD，Coulter儀器：高速4ul/秒，中速2ul/秒，低速0.5ul/秒？partec儀器:最為精密的細(xì)胞計(jì)數(shù)器，直接報(bào)告細(xì)胞濃度反應(yīng)體積 樣本中加完抗體后， 1106細(xì)胞反應(yīng)體積應(yīng)不小于100ul?？贵w染色抗體染色 最為普通的抗體染色原則：最為普通的抗體染色原則：1106

13、細(xì)胞對(duì)細(xì)胞對(duì)1 ug 抗體（抗體供應(yīng)商所推薦抗體（抗體供應(yīng)商所推薦使用單位），此濃度使用單位），此濃度90%處于過(guò)飽合狀態(tài)處于過(guò)飽合狀態(tài)精確使用：滴定抗體，抗體對(duì)于抗原恰達(dá)到精確使用：滴定抗體，抗體對(duì)于抗原恰達(dá)到飽合濃度飽合濃度SPECIFIC ANTIBODYNON-SPECIFIC ANTIBODYCONCENTRATIONAMOUNT BOUND抗體滴定原理抗體滴定原理流式細(xì)胞儀抗體滴定方法流式細(xì)胞儀抗體滴定方法33 gs/n = 2.51 gs/n = 2.10.3 gs/n = 2.40.1 gs/n = 4.10.03 gs/n = 4.80.01 gs/n = 4.60.003

14、gs/n = 3.50.001 gs/n = 3.2auto65432100102030405060DilutionSignal to NoiseTITER孵育、溶血、固定 抗體孵育：室溫下避光抗體孵育：室溫下避光15分鐘（某些情況下如：細(xì)胞分鐘（某些情況下如：細(xì)胞內(nèi)因子檢測(cè)需冰育）內(nèi)因子檢測(cè)需冰育） 溶血：如樣本含中有紅細(xì)胞需溶血（見(jiàn)下頁(yè)）溶血：如樣本含中有紅細(xì)胞需溶血（見(jiàn)下頁(yè)） 樣本溶血后需立即上機(jī)檢測(cè)，固定后可放置較長(zhǎng)時(shí)間樣本溶血后需立即上機(jī)檢測(cè)，固定后可放置較長(zhǎng)時(shí)間白細(xì)胞保護(hù)型溶血?jiǎng)〤al-Lyse(其中已含細(xì)胞固定劑)：1，100ul外周血，加入100ul溶血?jiǎng)?，混勻后，室溫下孵育

15、10分鐘3，加入2ml蒸餾水，混勻后室溫下孵育10分鐘4，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，免洗直接上機(jī)檢測(cè)或400g離心10分鐘后PBS重懸優(yōu)點(diǎn)：試劑為溫和型溶血?jiǎng)?，不影響?xì)胞表面抗原及溶血時(shí)間無(wú)需精確把握各各溶溶血血?jiǎng)﹦┬孕阅苣鼙缺容^較抗體標(biāo)記熒光素及其他熒光染料 熒光激發(fā)及發(fā)射原理能量級(jí)激發(fā)激發(fā)態(tài)發(fā)射激光能量損失標(biāo)記抗體常用熒光素 FITC 激發(fā)光：488nm 發(fā)射光：525nm;使用面最廣，價(jià)格便宜Alexa Green具有更佳的能量轉(zhuǎn)移效率及更純的發(fā)射光譜PE 激發(fā)光488nm 發(fā)射光575nm 此熒光的激發(fā)效率最佳，故此熒光得到的信號(hào)最強(qiáng) 檢測(cè)某些弱表達(dá)的抗原，推薦使用此熒光素 價(jià)格較FITC昂貴PE

16、-Cy5 TC 激發(fā)光488nm, 發(fā)射光667nm為復(fù)合熒光素，熒光激發(fā)較率較高，信號(hào)強(qiáng)FTIC、PE、PE-Cy5三者為流式細(xì)胞最為常的熒光，并經(jīng)常將三者共同使用進(jìn)行三色分析PE-Cy7 激發(fā)光488nm， 發(fā)射光767nm 為復(fù)合熒光素，2000年后被開(kāi)發(fā)出來(lái)，激發(fā)效率佳 與前三者聯(lián)進(jìn)可進(jìn)行單激光四色分析（488nm），光譜之間影響較小APC 激發(fā)光633nm， 發(fā)射光660在配有雙激光的流式細(xì)胞儀上，此熒光染料與FITC、PE、PE-Cy5聯(lián)用做四色分析。但現(xiàn)在因單激光四色可實(shí)現(xiàn)，故使用該染料意義不大。核酸染料染料激發(fā)光發(fā)射光光源Propidium Iodide495342639488

17、Ethidium biromide4933206374887-Aminoactinomycin D546647514488Acridine Orange503 530(DNA)488640(RNA)Chromomycin A3430580457Hoechst 33342395450UVDAPI372456UVPyronin Y545565514488Thiazole Orange509533488YO-PRO-1642661488TO-PRO-3642661630LDS 751543712488細(xì)胞膜電位、離子、脂類(lèi)探針 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)或開(kāi)發(fā)出來(lái)了各種細(xì)胞膜電位、各類(lèi)離子、pH值、脂類(lèi)探針，運(yùn)用這些

18、探針在流式細(xì)胞儀上可輕易檢測(cè)各種細(xì)胞功能，可實(shí)現(xiàn)一些異想不到的效果。 詳細(xì)信息，見(jiàn)細(xì)胞探針公司網(wǎng)站： www.molecularP與流式細(xì)胞儀相關(guān)的熒光術(shù)語(yǔ) MESF（Molecules of equivalent soluble fluorochrome）等量可溶性熒光分子：國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)單位，用來(lái)衡量熒光強(qiáng)度 自發(fā)熒光：細(xì)胞或顆粒在激發(fā)照射下會(huì)發(fā)出各種波長(zhǎng)的熒光。白細(xì)胞自發(fā)熒光強(qiáng)度為6501150MESF，血小板及其他顆粒自發(fā)熒光更低 流式細(xì)胞儀精度：分析白細(xì)胞要求精度在1000MESF以內(nèi)，分析其他細(xì)胞或顆粒需要更高的精度：300MESF以內(nèi)第二部分流式細(xì)胞儀使用一般方法及技巧流式細(xì)胞儀使用一

19、般方法及技巧上機(jī)檢測(cè) 樣本染色及溶血過(guò)程處理完后應(yīng)立即上機(jī)檢測(cè) 打開(kāi)流式細(xì)胞儀：預(yù)熱及進(jìn)行質(zhì)控程序 選擇相應(yīng)的方案或新建方案 加載或重新調(diào)節(jié)各參數(shù) 上樣檢測(cè)技巧一：定位目標(biāo)細(xì)胞群體 尋找細(xì)胞群：如標(biāo)本為外周血，在FS/SS散點(diǎn)圖中信號(hào)最強(qiáng)的為粒細(xì)胞，依次為單核、淋巴、紅細(xì)胞碎片。要尋找淋巴細(xì)胞，可首先調(diào)低FS/SS電壓定位粒細(xì)胞后逐步調(diào)高電壓依次尋找各細(xì)胞群。 使用目標(biāo)群所特有的表面標(biāo)志物結(jié)合SS信號(hào)，可最快、最特異性地定位目標(biāo)細(xì)胞群 如標(biāo)本中無(wú)明顯特征細(xì)胞群，可使用已建淋巴細(xì)胞檢測(cè)方案根據(jù)相對(duì)位置定位目標(biāo)細(xì)胞群技巧二：陰性對(duì)照陰性對(duì)照作用：調(diào)節(jié)PMT電壓；設(shè)立陰、陽(yáng)性界線使用抗體相應(yīng)同型熒光

20、免疫球蛋白作為陰性對(duì)照，注對(duì)照及抗體需出自同一廠家（檢測(cè)一過(guò)性樣本中的某些指標(biāo)）使用對(duì)照組樣本作陰性對(duì)照（與其他實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組含意相同，但此時(shí)仍需使陰性對(duì)照初始化儀器）對(duì)與非抗體染色，如各類(lèi)核酸染料或探針：PI、ANNEXIN-V。使用空白標(biāo)本作為陰性對(duì)照，或設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照。技巧三：常見(jiàn)故障及解決時(shí)刻注意鞘液及廢液桶液量，熟悉儀器各類(lèi)報(bào)警信號(hào)通過(guò)軟件操作儀器，很少能引起儀器硬件固障如樣本中有可見(jiàn)顆粒，建議過(guò)濾后再檢測(cè)如儀器經(jīng)常不使用，管道會(huì)結(jié)晶、長(zhǎng)菌、堵塞、漏氣，此時(shí)叫工程師便可解決如儀器出現(xiàn)硬件故障，通常是儀器自身問(wèn)題，與操作者無(wú)關(guān)技巧四：檢測(cè)指標(biāo)檢測(cè)前要清楚地知道：除陽(yáng)性百分比指標(biāo)外，還有熒光

21、強(qiáng)度指標(biāo)。后者往往比前者更有意義檢測(cè)時(shí)，靈活應(yīng)用放大模式：線性或?qū)?shù)（如指標(biāo)相差不大，使用線性放大，如：SS、FS；一般熒光參數(shù)使用對(duì)數(shù)放大）靈活運(yùn)用門(mén)的邏輯關(guān)系及顏色示蹤功能，可使檢測(cè)結(jié)果更為明了合理選擇不同的熒光素標(biāo)記試劑，以最少的投入獲取最多的信息熒光補(bǔ)償：極其重要的操作FITC與PE調(diào)與未調(diào)補(bǔ)償FL1FL2補(bǔ)償調(diào)節(jié)原理補(bǔ)償調(diào)節(jié)原理雙色熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)方法：第一步 IgGFITC/IgGPE 通過(guò)調(diào)節(jié)電壓使陰性群體落在FTIC 及PE 雙陰性區(qū)注在注在 進(jìn)行調(diào)補(bǔ)償時(shí)必須將原補(bǔ)償全部歸零進(jìn)行調(diào)補(bǔ)償時(shí)必須將原補(bǔ)償全部歸零雙色熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)方法：第二步 FITC 標(biāo)記抗體/IgGPE雙色熒光

22、補(bǔ)償調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)方法：第三步 通過(guò)補(bǔ)償設(shè)置按鈕增、減補(bǔ)償百分?jǐn)?shù)因?yàn)椋核裕鹤⒁猓?用來(lái)調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)腇ITC、PE抗體必須有明顯的陽(yáng)性信號(hào)，否則就不會(huì)出現(xiàn)熒光滲漏現(xiàn)像，調(diào)節(jié)補(bǔ)償也無(wú)從入手。 在正式數(shù)據(jù)采集前要調(diào)整好補(bǔ)償，一旦數(shù)據(jù)被獲取，BD、Coulter儀器無(wú)法再改變補(bǔ)償 partec流式細(xì)胞儀提供軟件調(diào)節(jié)補(bǔ)償技術(shù)，無(wú)論何時(shí)都可重新調(diào)節(jié) 多色熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)方法同雙色法復(fù)雜方案分析 了解流式儀胞儀各參數(shù)的意義 熟悉設(shè)門(mén)操作 開(kāi)擴(kuò)思路，靈活設(shè)計(jì)各種檢測(cè)方案流式細(xì)胞儀CD34陽(yáng)性干細(xì)胞計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)方案：ISHAGE 背景知識(shí)：外周血現(xiàn)已被廣泛地被用作骨髓移植癌癥患者接受大劑量化療或放療后骨髓重建造所需血干細(xì)胞H

23、emotopoietic Progenitor Cells HPC 的來(lái)源外周血源性干細(xì)胞現(xiàn)主要被運(yùn)用自體移植其應(yīng)用面也逐步拓展至異基因骨髓移植中。 運(yùn)用流式細(xì)胞儀可最早監(jiān)測(cè)外周血中是否有足夠的干細(xì)胞供采集。 由于此類(lèi)樣本中，碎片、血小板、聚集物對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較大，故設(shè)計(jì)了ISHAGE方案去除這些影響。CD34計(jì)數(shù)中的問(wèn)題溶血?jiǎng)罕苊馊苎獣r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，處理完成后將樣本置于冰水中，將降低溶血?jiǎng)├^續(xù)作用的效果。另溶血后染色/染色后溶血效果各有不同。有些樣本可能存在某些特殊問(wèn)題血小板可能會(huì)與CD34+或CD34-細(xì)胞結(jié)合影響精確計(jì)數(shù)這個(gè)問(wèn)題可通過(guò)增加EDTA來(lái)解決聚集的血小板可能會(huì)與CD34 CD45

24、抗體微弱結(jié)合但可通過(guò)巧妙的設(shè)門(mén)方案將其去除樣本保存：血小板聚集問(wèn)題，細(xì)胞死亡問(wèn)題，凍存液如DMSO對(duì)樣本的影響抗體選擇：熒光素對(duì)抗體結(jié)合的影響陰性對(duì)照：在用CD34 抗體染色的標(biāo)本中目標(biāo)細(xì)胞群可能少于總細(xì)胞群的0.1%而只有目標(biāo)細(xì)胞群大于1%時(shí)才合適用同型作為陰性對(duì)照。需使用多參數(shù)設(shè)門(mén)來(lái)確定陰性對(duì)照收集標(biāo)本數(shù)：由于CD34+細(xì)胞一般只占1%整單個(gè)核細(xì)胞固可將其視作泊松分布曲線如要得到一個(gè)變異系數(shù)為10%左右值就要采集100 個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞。第一步 一個(gè)門(mén)R1是基于CD45/SSC 雙參數(shù)圖上的通過(guò)對(duì)其設(shè)門(mén)可去除紅細(xì)胞碎片和聚集物這些干擾在造血細(xì)胞樣本中尤為多見(jiàn)特別是在樣本使用溶血-免洗法處理后第二

25、步 將通過(guò)R1 門(mén)獲取的細(xì)胞顯示在CD34/SSC 雙參數(shù)點(diǎn)圖在此圖中設(shè)立R2 門(mén)并調(diào)節(jié)其位置包含所有CD34 強(qiáng)陽(yáng)性或弱陽(yáng)性的并SSC 信號(hào)弱及中等的細(xì)胞第三步 建立一CD45/SSC 雙參數(shù)點(diǎn)圖將以上CD34 陽(yáng)性細(xì)胞顯示于其中在其中設(shè)門(mén)R3 門(mén)去除CD34 陽(yáng)性顆粒中的聚集血小板淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞第四步 將R3 門(mén)中圈定的細(xì)胞顯示在FS/SS 圖中以檢測(cè)細(xì)胞是否落在平時(shí)的幼稚淋巴細(xì)胞門(mén)R4 中通過(guò)R4 要去除比淋巴細(xì)胞小的顆粒第五步 如何確定R4 門(mén)的位置呢？方法如下在CD45/SSC 雙參數(shù)點(diǎn)圖中設(shè)立R5 門(mén)圈定CD45 強(qiáng)陽(yáng)性且SSC 低信號(hào)的淋巴細(xì)胞群體將R5 門(mén)中的細(xì)胞顯示在R4

26、 門(mén)所在的FS/SS 雙參數(shù)直方圖中根據(jù)其中的淋巴細(xì)胞的位置調(diào)節(jié)R4門(mén)確定R4 門(mén)在FS 和SS 軸上最小值的最低范圍第六步 R1 門(mén)在CD45 從標(biāo)的下限則根據(jù)以下直方圖來(lái)確認(rèn)建立第5 張CD45/CD34 雙參數(shù)直方圖根據(jù)CD34 陽(yáng)性顆粒的CD45 表達(dá)的最小值建立十字門(mén)確保所有CD34 陽(yáng)性CD45極弱表達(dá)的細(xì)胞全部在CD45 設(shè)定界線的左側(cè)然后根據(jù)此進(jìn)的CD45 界線位置確定R1 門(mén)的最小值第七步絕對(duì)計(jì)數(shù)：對(duì)于普通流式細(xì)胞儀在樣本中加入標(biāo)準(zhǔn)微球，校準(zhǔn)流式細(xì)胞的計(jì)數(shù)，從而得出干細(xì)胞的濃度Partec流式細(xì)胞儀所有檢測(cè)指標(biāo)均為絕對(duì)計(jì)數(shù)，無(wú)需校準(zhǔn)微球，計(jì)數(shù)過(guò)程由硬件完成。陰性對(duì)照 對(duì)于陽(yáng)性

27、細(xì)胞數(shù)很少的樣本，如何建立有效的陰性對(duì)照是值得考慮的問(wèn)題流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)保存及分析 所有商業(yè)流式細(xì)胞儀樣本分析結(jié)果數(shù)據(jù)包均以FCSII格式保存 無(wú)論操作平臺(tái)是DOS、Windows、MAC，流式數(shù)據(jù)文件均可被自由拷貝 流式數(shù)據(jù)包含有各項(xiàng)參數(shù)信息及分析顆粒信號(hào)信息功能強(qiáng)大的免費(fèi)分析軟件：PC版 WinMDI提供流式軟件分析所需的所有功能，運(yùn)行在Windows平臺(tái) 可在任何PC機(jī)上分析流式數(shù)據(jù)并輸出報(bào)告 下載：臨床流式細(xì)胞儀應(yīng)用簡(jiǎn)介 以下將簡(jiǎn)單地、舉例性地介紹流式細(xì)胞可開(kāi)展的部分項(xiàng)目。只須掌握了流式細(xì)胞儀的原理及操作軟件，您可開(kāi)展任何基于熒光技術(shù)的檢測(cè)項(xiàng)目 流式細(xì)胞儀是一種任您自由展開(kāi)想像力的、非凡

28、的檢測(cè)工具DNA倍體分析：DNA分析是流式細(xì)胞儀最初且是現(xiàn)在應(yīng)用最廣檢測(cè)項(xiàng)目。由于惡性細(xì)胞DNA含量通常與正常細(xì)胞不同，存在異倍體細(xì)胞，所以現(xiàn)有很研究評(píng)價(jià)異倍體細(xì)胞與腫瘤惡性度及其預(yù)后的關(guān)系。DNA含量檢測(cè)還可提供細(xì)胞周期方面的信息，這在細(xì)胞生物學(xué)中運(yùn)用很廣泛。特別地，它可表示出細(xì)胞毒性藥物對(duì)細(xì)胞作用過(guò)程。這些DNA檢測(cè)還可與細(xì)胞表面標(biāo)志物標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行，這樣在細(xì)胞混合培養(yǎng)中，可通常追蹤表達(dá)特異標(biāo)志物的細(xì)胞顯示其生長(zhǎng)周期情況。所有方法都是基于染料能與核酸起特異的化學(xué)反應(yīng)并發(fā)射出熒光，常用的染料為PI，DAPI。流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，575nm濾光片。乳腺癌DNA異倍體患者生存率 DNA

29、倍體分析中，S期的含量也是評(píng)估疾病預(yù)后的重要指標(biāo)DNA倍體的診斷標(biāo)準(zhǔn) 1.發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)DNA 非整倍體細(xì)胞峰診為癌非整倍體細(xì)胞峰診為癌 2.如無(wú)明顯的非整倍體細(xì)胞峰便有一個(gè)突出的四倍體如無(wú)明顯的非整倍體細(xì)胞峰便有一個(gè)突出的四倍體細(xì)胞峰和大于細(xì)胞峰和大于15%的超二倍體細(xì)胞的超二倍體細(xì)胞S 期細(xì)胞并伴期細(xì)胞并伴G0/1 峰的峰的CV 值大于值大于9%診為癌診為癌 3.無(wú)明顯的非整倍體細(xì)胞峰但無(wú)明顯的非整倍體細(xì)胞峰但G0/1 峰峰CV值增大并伴有值增大并伴有大于大于10-15%超二倍體細(xì)胞和一個(gè)突出的四倍體峰位診超二倍體細(xì)胞和一個(gè)突出的四倍體峰位診為可疑癌為可疑癌檢測(cè)是結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，特異性地分析腫瘤

30、細(xì)胞的檢測(cè)是結(jié)合腫瘤標(biāo)記物，特異性地分析腫瘤細(xì)胞的DNADNA含量有助于提高診斷的準(zhǔn)確率。含量有助于提高診斷的準(zhǔn)確率。細(xì)胞生存能力實(shí)驗(yàn)，使用Heochest 33342染料與DNA特異性結(jié)合，后因細(xì)胞活力不同染料的結(jié)合程度也各異，故可評(píng)估細(xì)胞的活性度。流式細(xì)胞儀要求：360nm光源，455nm濾光片計(jì)數(shù)外周血中檢測(cè)網(wǎng)織紅細(xì)胞：使用TO染料能夠特異性地與RNA結(jié)合，結(jié)合系數(shù)高達(dá)3000，故具有很好的信噪比。流式細(xì)胞儀要求：488nm光源，525nm濾光片，液量絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)網(wǎng)織紅細(xì)檢測(cè) 網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)量可作為貧血及治療效果的監(jiān)測(cè)。1 10 01 11 10 02 21 10 03 31 10 04

31、4T Th hi ia az zo ol le e O Or ra an ng ge e - - - 1 10 01 11 10 02 21 10 03 31 10 04 4F FS SC C- -H He ei ig gh ht t - - - RBCsReticulocytesPlateletsNucleatedCellsIRFPlatelet Associated Ig PA Ig血小板自身抗體檢測(cè) 血小板自身抗體檢測(cè)：血小板自身抗體識(shí)別人血小板抗原，會(huì)引起各種臨床相關(guān)癥狀，如新生兒自免性血小板減少癥、輸血后紫癜、難治性血小板減少。流式細(xì)胞可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)血小板自身抗體。FITC標(biāo)記抗人

32、免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記識(shí)別血小板抗體。 儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片與網(wǎng)織血小板同時(shí)檢測(cè)可時(shí)，兩者均為陽(yáng)性時(shí)提示為自身免疫性貧血 移植交叉配型：原細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，主要用于避免移植物超急性排拆反應(yīng)。流式細(xì)胞儀用于監(jiān)測(cè)T或B細(xì)胞是否受到受體血清中免疫球蛋白攻擊，作為HLA配型前的預(yù)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞儀因其高精確性已成為該領(lǐng)域內(nèi)的金標(biāo)準(zhǔn)。FITC標(biāo)記抗人免疫球蛋白抗體、PE標(biāo)記識(shí)別T細(xì)胞CD3或B細(xì)胞CD29抗體。 儀器要求：488nm光源，525nm、575nm濾光片細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞經(jīng)抗原或細(xì)胞有絲分裂刺激后活化效應(yīng)：淋巴細(xì)胞早期活化指標(biāo)CD69可用來(lái)檢測(cè)免疫治療效果。流式細(xì)

33、胞使用三色分析可監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞各亞群活化情況：FITC標(biāo)記的CD3抗體、PE標(biāo)記的CD8抗體、PE-CY5標(biāo)記的CD69抗體。儀器要求：488nm光源，525nm、575nm、575nm濾光片細(xì)胞增殖狀態(tài)檢測(cè)：核增殖抗PCNA、Ki67、BrdUrd用于衡量細(xì)胞增殖分裂狀況，在評(píng)估腫瘤預(yù)后有重要意義。為些標(biāo)志物的檢測(cè)一般同細(xì)胞表面標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)。FITC標(biāo)記PCNA或Ki67或BrdUrd，PE或（并）PE-CY5標(biāo)記細(xì)胞表面標(biāo)志物。儀器要求：488nm或633nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)因子（TH1/TH2細(xì)胞檢測(cè)）：未活化的淋巴細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子極少用流式細(xì)

34、胞儀很難檢測(cè)出來(lái)因此在檢測(cè)前需刺激活化活化所用的刺激素為PMA 佛波酯+ Ionomycin 淋巴細(xì)胞在刺激素的作用下活化分泌細(xì)胞因子到細(xì)胞外因流式細(xì)胞儀只能對(duì)細(xì)胞表面或內(nèi)部的抗原進(jìn)行檢測(cè)如細(xì)胞因子分泌到細(xì)胞外則檢測(cè)不到因此必須阻止細(xì)胞因子的分泌抑制細(xì)胞因子分泌的試劑為Brefedlin A 或Monensin。Th1/Th2 細(xì)胞首先是CD4+T 細(xì)胞因此存在著用CD4 來(lái)設(shè)定細(xì)胞群的問(wèn)題我們知道CD4 不但在T 細(xì)胞上表達(dá)還在所有的單核細(xì)胞上表達(dá)因此單獨(dú)用CD4 設(shè)門(mén)無(wú)法將CD4+T細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)那么我們用CD3 和CD4 雙參數(shù)設(shè)門(mén)是否可以呢回答是否定的因?yàn)樵诜鸩サ拇碳ぷ饔孟翪D4 抗原

35、的表達(dá)會(huì)迅速下調(diào)甚至完全喪失所以不適合于設(shè)門(mén)用CD3 和CD8 設(shè)門(mén)因CD8 不受佛波脂的影響且絕大多數(shù)D3+CD8-的細(xì)胞都是CD3+CD4+細(xì)胞因此可用CD3+CD8-細(xì)胞群來(lái)確定CD4+T 細(xì)胞群。FITC標(biāo)記CD8，PE標(biāo)記IL-4和，PE-CY5標(biāo)記IFN-r，APC或PE-CY7標(biāo)記CD3。 儀器要求：488nm或633nm（僅限APC染料）光源，525nm、575nm、675nm，767nm濾光片染色體分析：流式細(xì)胞儀染色分析運(yùn)用兩種特異性染料：Hoechest33258與核苷酸AT結(jié)合；Chromomycin A3與GC相結(jié)合。從而在雙參數(shù)坐標(biāo)上根據(jù)染色體ATCG含量的不同識(shí)別

36、各種染色體。平時(shí)進(jìn)行的染色體分析耗時(shí)且需要操作者極具經(jīng)驗(yàn)，而用流式細(xì)胞儀時(shí)可快速地識(shí)別出異常染色體，如加配分選系統(tǒng)可將這些異常染色體分選出來(lái)作進(jìn)一步分析。儀器要求：360nm或488nm光源，450nm、580nm濾光片BrdUrd標(biāo)記追蹤細(xì)胞分化：通過(guò)細(xì)胞分化時(shí)涉入溴化尿嘧啶，再使用抗BrdUrd抗體及PI核酸染料可精確識(shí)別它們。在流式細(xì)胞儀上可清楚地識(shí)別出處于G1、S、G2、M期的細(xì)胞，在腫瘤研究中有著重要作用。儀器要求： 488nm光源，525nm、575nm濾光片淋巴細(xì)胞亞群分析：外周血CD3、CD4、CD8、CD19、NK等各類(lèi)淋巴細(xì)胞亞群定量分析。儀器要求： 488nm光源，525

37、nm、575nm濾光片，液量絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng) 白血病免疫分型：CD45設(shè)門(mén)三色白血病免疫分型。儀器要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。最少三色熒光，參數(shù)越多檢測(cè)越為靈敏。 血小板分析：血小板活化實(shí)驗(yàn)、血小板功能分析。血小板識(shí)別抗體及相應(yīng)活化指標(biāo)。儀器要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)血小板分析：血小板活化實(shí)驗(yàn)、血小板功能分析。血小板識(shí)別抗體及相應(yīng)活化指標(biāo)。儀器要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)白血病、淋巴瘤微小殘留病灶檢測(cè)：根據(jù)初診免疫分型結(jié)果，多參數(shù)聯(lián)合設(shè)門(mén)檢測(cè)是否有殘留

38、白血病細(xì)胞，監(jiān)測(cè)白血病的復(fù)發(fā)。T系白血病微小殘留病灶檢測(cè)儀器要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片，液量絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)B系白血病微小殘留病灶檢測(cè)，液量絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)儀器要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。最少三色熒光，參數(shù)越多檢測(cè)越為靈敏。髓系白血病微小殘留病灶檢測(cè)，液量絕對(duì)計(jì)數(shù)系統(tǒng)儀器要求： 488nm光源，525nm、575nm、675nm濾光片。最少三色熒光，參數(shù)越多檢測(cè)越為靈敏。血小板活化實(shí)驗(yàn)要求減少血小板聚集聚集血小板在流式細(xì)胞儀可被檢測(cè)出來(lái)但是如果血小板發(fā)生了聚集流式細(xì)胞儀便不能檢測(cè)聚集血小板中每個(gè)血小板所表達(dá)的抗原數(shù)量了這是因?yàn)?/p>

39、流式只檢測(cè)每個(gè)顆粒的表達(dá)熒光而無(wú)法區(qū)分這個(gè)顆粒單個(gè)血小板還是由一定數(shù)量血小板聚積而成在準(zhǔn)備全血標(biāo)本時(shí)可依據(jù)以下標(biāo)本處理方法使血小板聚集現(xiàn)象減到最低對(duì)于每個(gè)樣本都要監(jiān)測(cè)血小板的聚集情況聚集血小板往往會(huì)出現(xiàn)在FS 和SS 坐標(biāo)中右上象限內(nèi)減少全血標(biāo)本中血小板聚集的標(biāo)本處理方法 在抽血前準(zhǔn)備好所有在標(biāo)本處理過(guò)程中所需試劑以避免延誤時(shí)間 抽血時(shí)針管不要細(xì)于21 號(hào) 平穩(wěn)放松地抽取血液 棄用前2ml 血液 使用聚乙稀試管或針筒 立即與抗凝劑混勻 不要進(jìn)行洗滌離心過(guò)濾晃動(dòng)等巨烈的處理步驟 加入緩沖液稀釋血小板濃度 如果要使用凝血酶作為激活劑則在其中要加入肽GPRP固定檢測(cè)血小板活化都需要限制血小板自身的或

40、被激活的體外活化通過(guò)抗激活藥物肌苷潘生丁或固定方法通常使用多聚甲醛都可限制血小板自發(fā)或被動(dòng)活化固定或許會(huì)破化某抗原與單抗結(jié)合的位點(diǎn)如用福爾馬林固定標(biāo)體還會(huì)引起血小板的自發(fā)熒光所以在檢測(cè)中選用恰當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照此外固定的標(biāo)本中不應(yīng)存在未結(jié)合的抗體這會(huì)引起非特異性結(jié)合建議先將標(biāo)本與抗體孵育洗去未結(jié)合抗體后固定然而這會(huì)在處理過(guò)程引起額外的血小板活化并且這很難控制對(duì)血小板進(jìn)行固定對(duì)于臨床不能立即上流檢測(cè)的標(biāo)本來(lái)說(shuō)是極為有利的方法固定可以減少血小板在體外的人為活化對(duì)于絕大多數(shù)抗體來(lái)說(shuō)使用染色后再固定的方法進(jìn)行處理的標(biāo)本立即上機(jī)檢測(cè)與在24 小時(shí)內(nèi)分析在熒光強(qiáng)度上沒(méi)有明顯差異并且固定前染色方法并立即上機(jī)檢測(cè)與固定后24 小時(shí)內(nèi)染色分析在熒光強(qiáng)度上也沒(méi)有明顯差異然而要注意因固定方法而對(duì)標(biāo)本引起的變化特別是使用固定前染色的單抗時(shí)因?yàn)閷?duì)于檢測(cè)血小板活化依賴(lài)性單抗與固定后的血小板結(jié)合率會(huì)有下降此外有些單抗與固定后的血小板結(jié)合率會(huì)表現(xiàn)出時(shí)間相關(guān)性減少所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室在使用種新抗體時(shí)必須選擇最恰當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒?xì)胞凋亡分析：DNA凋亡峰檢測(cè)、ANNEXIN-V/PI雙染法凋亡檢測(cè)。儀器要求： 488nm光源，525nm、575