反相高效液相色譜法測定毛魚藤中魚藤酮的含量

1、藥物分析反相高效液相色譜法測定毛魚藤中魚藤酮的含量胡道德,顧磊,劉皋林(上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院,上海200080作者簡介:胡道德(19642,男,副主任藥師,副教授,研究生導師1Tel:(021632400904801,E 2mail:shanghaiyaosina .com 1摘要目的:建立以反相高效液相色譜法測定毛魚藤中魚藤酮含量的方法。方法:以Z ORBAX Ecli p se XDB-C 18(5m ,4.6150mm 色譜柱為固定相;乙腈:0.1%磷酸溶液(4852,v/v,pH 2.6為流動相;流速1.0mL /m in;柱溫40.0;檢測波長299n m 。結果:魚藤酮在濃

2、度為3050mg/L 范圍內,其峰面積與濃度線性關系良好,線性方程為A =20.7311C -0.3616(r =0.9998,平均加樣回收率為100.74%,RSD 為0.86%。結論:本方法操作簡便、快速,結果準確,可用于毛魚藤中魚藤酮的含量測定。關鍵詞毛魚藤;魚藤酮;反相高效液相色譜法中圖分類號:R917文獻標識碼:A 文章編號:1006-0111(200703-0159-03D eter m i n a ti on of rotenone i n D erris elliptica by reversed 2pha se h i gh performance li qu i d chr

3、oma tographyHU Dao 2de,Gu Lei,L i ou Gao 2lin (Depart m ent of Phar macy,Affiliated First Peop les Hos p ital,Shanghai J iaot ong University,Shanghai 200080,China ABSTRCT O bjecti ve:To establish a reversed 2phase high perf or mance liquid chr omat ography method f or r otenone in D erris elliptica

4、.M ethods:The deter m inati on was perfor med on Z ORBAX Ecli p se XDB 2C 18(5m,4.6150mm colu mn .The mobile phase consisted of acet onitrile and 0.1%phos phate acid s oluti on (4852,v/v,pH 2.6with fl ow rate at 1.0mL /m in and deter m inati on wavelength at 299n m under 40.0.Results:Under the condi

5、ti ons described,the calibrati on curve of r otenone was linear over the concentrati on range of 30t o 50mg/L.The regressi on equati on was:A =20.7311C 20.3616,r =0.9998(n =5,P 0.01.The average recovery for r otenone was 100.74%.The mean relative standard deviati on (RSD was 0.86%.Conclusi on:The me

6、thod is si m p le and accurate,and suitable for the deter m inati on of r otenone in D erris elliptica .KE Y WO R D S D erris elliptica ;r otenone;reversed 2phase high perfor mance liquid chr omat ography毛魚藤(D erris elliptica 為豆科魚藤屬植物,廣泛生長在東南亞各國1。毛魚藤根、莖中魚藤酮(r otenone 含量高,是目前我國魚藤酮原藥生產的主要原料。魚藤酮是一種抑制神經

7、組織和肌肉組織的選擇性植物源殺蟲劑,具有活性高、殺蟲譜廣的特點,在無公害農產品的害蟲防治方面,具有較好的應用前景。近年文獻報道2,3,大鼠長時間接觸魚藤酮會對大鼠黑質多巴胺神經元有選擇性損傷作用,可出現特征的Le wy 小體,而對膽堿能神經元無影響,從而使大鼠產生類似于人類帕金森病(Parkins on disease 的癥狀,利用魚藤酮的這一藥理毒理作用可以建立大鼠帕金森病動物模型。我們在建造大鼠帕金森病動物模型之前,參考了有關文獻4,5,結合本實驗室的具體條件,建立了測定毛魚藤中魚藤酮含量的反相高效液相色譜法,該方法操作簡便、快速,結果準確,為魚藤酮定量測定提供又一分析手段。1儀器與試藥1

8、11儀器Agilent 1100型高效液相色譜儀,包括四元梯度泵、二極管陣列檢測器(DAD 190950nm 、自動進樣器、柱溫箱、在線脫氣機、數據處理系統(tǒng)為美國Agilent 公司化學工作站(Che m stati on ,Z ORBAX Ecli p se XDB 2C 18(5m ,4.6150mm 色譜柱,微孔濾膜(0.45m ,HP 201真空過濾裝置,Mettler Toledo 電子天平(AL104。112試藥對照品魚藤酮(Sig ma 2A ldrich,含量98.0%,乙腈(美國天地公司,批號:412021,色譜純;三氯甲烷、丙酮、乙醇等均為分析純;三蒸水(自制。2方法與結果

9、211毛魚藤根、莖提取物的制備稱取毛魚藤根、莖干粉適量,裝入索氏提取器中,用三氯甲烷浸漬過951藥學實踐雜志2007年第25卷第3期夜(12h ,然后回流提取1h,所得提取液先粗濾,后精濾(0.45m ,減壓濃縮即得樣品。212標準溶液配制精密稱取干燥至恒重的魚藤酮對照品適量,加丙酮-乙醇(12溶解并稀釋至刻度,配成500mg/L 儲備液,置4冰箱保存。臨用時將魚藤酮儲備液以乙醇按適當比例稀釋,配制成濃度分別為30、35、40、45、50mg/L 的魚藤酮標準溶液。213供試品溶液配制精密吸取樣品1.0mL,置50mL 量瓶中,加乙醇至刻度,搖均,再精密吸取上述溶液1.0mL,置25mL 量瓶

10、中,加乙醇至刻度,搖均,即得。214檢測波長的選擇精密配制濃度40mg/L 的魚藤酮標準溶液,按色譜條件進樣,結果顯示魚藤酮標準溶液在299n m 波長處有最大的面積響應值,因此,本實驗選定檢測波長為299nm 。215色譜條件色譜柱:Z ORBAX Ecli p se XDB 2C 18(5m ,4.6150mm ;流動相:乙腈0.1%磷酸溶液(4852,v/v,pH 2.6;色譜參數:流速1.0mL /m in;柱溫40.0;檢測波長299n m;進樣量:10L;記錄的魚藤酮峰面積為響應參數,外標法定量。魚藤酮的典型色譜圖譜見圖1和圖2。由圖可知,在建立的色譜條件下,毛魚藤根、莖提取物中魚

11、藤酮和其它組分達到了完全分離,魚藤酮的保留時間為13.0m in 。圖1魚藤酮對照品的色譜圖216標準曲線的制備分別進樣30、35、40、45、50mg/L 的魚藤酮標準溶液,進行測定,以峰面積A 對濃度C 進行線性回歸,得線性方程為A =20.7311C-0.3616(r =0.9998。表明魚藤酮在濃度為3050mg/L 范圍內,其峰面積與濃度線性關系良好。217溶液穩(wěn)定性試驗取供試品溶液10L,分別于0、2、4、6、8h 進樣,共進樣5次,觀察魚藤酮峰面積變化,結果表明,該溶液在8h 內穩(wěn)定,峰面積測量值的RSD 為0.27% 。圖2供試品的色譜圖218進樣精密度試驗取標準曲線下溶液10

12、L,進樣5次,計算魚藤酮進樣精密度,結果魚藤酮峰面積測量值的RSD 為0.11%。219中間精密度試驗取供試品溶液10L,分別在第1天、第2天、第3天由不同的分析人員在不同的儀器上分別進樣5次,結果魚藤酮的RSD 為0.13%。2110方法回收率精密吸取已知含量的樣品,共9份,分別精密加入一定量的魚藤酮對照品貯備液適量,使成高、中、低濃度,分別進樣3次測定,代入回歸方程,外標法定量,計算得平均加樣回收率為100.74%,RSD 為0.86%。如表1。表1魚藤酮方法回收率(n =3序號樣品量(mg 加入量(mg 測得量(mg 回收率(%平均回收率(%RSD (%124.46 5.7830.302

13、1100.21224.46 5.7830.3911100.50324.46 5.7830.063799.42424.4612.1236.460899.67524.4612.1236.9429100.99100.740.86624.4612.1236.9667101.06724.4620.2445.2274101.18824.4620.2445.4344101.64924.4620.2445.5875101.992111專屬性在建立的色譜條件下,峰形良好,其他物質對魚藤酮測定無干擾。用強酸(1mol/L HCL 溶液、強堿(1mol/L Na OH 溶液、強氧化劑(1mol/L H 2O 2溶液

14、對供試品進行破壞,色譜圖見圖3,圖4,圖5。表明降解產物不影響測定。2112檢測限及定量限以信噪比為31時(S/N =31相應注入儀器的量確定檢測限,以信噪比為101時(S/N =31相應注入儀器的量確定定量限。結果,本方法檢測限及定量限分別為0.72ng 和2.17ng 。61Journal of Phar maceutical Practice Vol .252007No .3 圖3強酸(1m o l/L HC l 溶液 破壞后供試品的色譜圖圖4強酸(1m o l/L N aO H 溶液 破壞后供試品的色譜圖圖5強氧化劑(1mo l/L H 2O 2溶液破壞后供試品的色譜圖2113樣品測定

15、精密吸取樣品溶液1.0mL,置50mL 量瓶中,加乙醇至刻度,搖均,另精密吸取上述溶液1.0mL,置25mL 量瓶中,搖均,10L 注入液相色譜儀,記錄色譜圖,外標法以峰面積代入回歸方程,計算魚藤酮的含量。測定了3批毛魚藤提取物樣品中魚藤酮含量分別是46.65、45.24、45.00g/L,如表2。表23批樣品中魚藤酮含量測定結果(n =3樣品編號含量(g/L RSD (%146.650.28245.240.25345.000.533討論毛魚藤植物中含有的魚藤酮類化合物主要有魚藤酮、魚藤素、毛魚藤酮及其12羥基化合物(魚藤醇酮、灰豆素和毛魚藤醇酮和6,12脫氫化合物(脫氫魚藤酮、脫氫魚藤素和脫

16、氫毛魚藤酮,它們屬異黃酮類化合物。魚藤酮類化合物UV 吸收光譜有四種類型,魚藤酮、魚藤素、毛魚藤酮和它們的脫氫氧化物分別在299、273、241nm 和281nm 處有吸收峰6。在本實驗條件下比較不同檢測波長處的魚藤酮色譜圖,可以看出魚藤酮在299nm 波長處有最大的面積響應值,因此,本實驗選定檢測波長為299n m ,同文獻報道一致6。在綜合分析了魚藤酮的物理和化學性質的基礎上,對使用不同的溶劑作為流動相進行了反復的對比研究,發(fā)現采用C 18色譜柱,甲醇/水為流動相組成的反相系統(tǒng),魚藤酮峰型的對稱性不佳且有拖尾。只有采用C 18色譜柱和乙腈011%磷酸溶液(4852,v/v,pH 2.6為流

17、動相組成的反相系統(tǒng),峰型對稱,分離效果滿意。魚藤酮在酸、堿中較穩(wěn)定,但在強氧化劑(1mol/L H 2O 2溶液作用下不穩(wěn)定,有新物質生成,在本實驗條件下新物質色譜峰的保留時間為12.197m in (圖5,同魚藤酮的分離度大于1.5,分離效果良好,該新物質結構確定,尚需進一步研究。魚藤酮見光易分解,標樣保存時注意密封、避光,進樣時應在暗室條件下進行?？傊?本方法具有較高的精密度和準確性,并且操作簡便、快速,是進行毛魚藤中魚藤酮有效成分檢測的理想分析方法。參考文獻:1Sae 2Yun A,Ovatlarnporn C,Itharat A ,et al 1Extracti on of r ote

18、 2none fr om D erris elliptica and D erris m alaccensis by p ressurized liq 2uid extracti on compared with macerati on J 1J Chr omat ogr A,2006;1125(2:172.2Huang J,L iu H,Gu W ,et al 1A delivery strategy for r otenone m i 2cr os pheres in an ani m al model of Parkins on s disease J 1B i oma 2terials,2006;27(6:937.3Phinney AL,Andringa G,Bol JG,et al .Enhanced sensitivity ofdopa m inergic neur ons t o r otenone 2induced t oxici