多功能AuFe3O4納米顆粒對癌細胞的多模式和超靈敏檢測

1、多功能 au-fe3o4 納米顆粒對癌細胞的多模式和超靈敏檢測#1 2 1 1 11*51015（1. 蘭州大學應用有機化學國家重點實驗室,蘭州 730000；2. 蘭州大學第一臨床醫(yī)學院，蘭州 730000）摘要：癌癥早期診斷和治療至關重要，與傳統(tǒng)單模式納米材料相比，多功能納米復合材料能為癌癥早期診斷和治療提供更精確的多方位信息。基于 au-fe3o4 納米顆粒的新奇結構，本工作報道了一種偶聯(lián)葉酸和銪配合物的 au-fe3o4 多功能納米探針。該納米探針能應用于葉酸受體過度表達癌細胞（如，hela 細胞）的比色/熒光雙模式檢測和量化癌細胞。該納米探針對癌細胞的檢測限達 100 個，在生物醫(yī)學

2、研究中能為癌癥早期診斷提供更準確的信息。關鍵詞：癌癥早期診斷；au-fe3o4 納米顆粒；葉酸；銪配合物；納米探針；比色/熒光雙模式檢測中圖分類號：o6 14.8a multifunctional aufe3o4 nanoparticles for multimodaland ultrasensitive detection of cancer cellsliu jian1, zhang wei2, yang zhengyin1, li tianrong1, huo xing1, wangbaodui120(1. statekey laboratory ofappliedorganic che

3、mistry, lanzhou university, lanzhou,730000;2. the first clinical medical school, lanzhou university, lanzhou, 730000)abstract: it is essential for early diagnosis and treatment of cancer cell. compared withtraditional single-modal nanoparticles, multifunctional nanoparticles can offer more precise a

4、ndmultiparametric information for the early diagnosis of cancer and better patient management.253035based on the novel structure of au-fe3o4 nanoparticles (nps), we report folic acid (fa) andeu(iii) complex-conjugated au-fe3o4 nps for the simultaneous multimodal detection andcounting of cancer cells

5、 based on colorimetric/fluorigenic dual-modal detection of cancer cellswith excessive expression folate receptor.the detection limit of this nanoprobe (1e) reaches 100cells, thus providing comprehensive and reliable information for more accurate and advancedearly diagnosis of cancers in biomedical r

6、esearch.key words: early diagnosis of cancer cell; au-fe3o4nps; folic acid; eu(iii) complex; nanoprobe;colorimetric/fluorigenic dual-modal0 引言癌癥早期診斷和治療至關重要，多功能納米復合材料作為一種新型檢測手段，在快速識別、高度敏感診斷和準確分析血液或其他體液中的癌細胞得到了巨大的發(fā)展。與傳統(tǒng)單模式納米材料相比,多功能納米粒子可以選擇性靶向標記癌細胞，隨后運用各種檢測技術對其檢測或造影1-3光學響應的多功能納米粒子可以對有限的癌細胞提供定量信息，從而準確地

7、量化癌細胞在癌40癥早期表達水平。最近研究表明，組成結構新穎的 au-fe3o4 納米顆粒(nps) 具有特殊的磁性和光學性質(zhì)，能用于檢測腫瘤細胞4 5基金項目：國家自然科學基金資助項目(21271093, 81171337, 21001040, 21202068)；國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973 計劃)資助項目(2012cb933102)；甘肅省自然基金資助項目(1107rjza255)；高等學校博士學科點專項科研基金資助項目(20100211120010)作者簡介：劉健(1986-)，男，碩士研究生，主要研究方向：生物無機化學-1-劉健 ，張偉 ，楊正銀 ，李天榮 ，火星 ，汪寶堆，從而

8、為癌癥早期診斷和治療提供更精確的多方位信息。此外,具有催化活性和。此外，fe3o4 納米顆粒具有過氧化酶活性 ，能夠催化氧化某些敏感底物 (染料) 而進行比色法定量檢測癌細胞。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)冷光的鑭系金屬元素負載在磁645大 stokes 位移、窄發(fā)射峰寬等性質(zhì)，能夠減弱細胞等生物樣本的背景信號而放大檢測信號從而使得檢測限達單分子水平7-9基于這些發(fā)現(xiàn)，我們設計把葉酸(fa)、銪(eu)配合物負載在 au-fe3o4 納米顆粒(nps)上，得到一種新型的納米探針。該探針具有葉酸對癌細胞的靶向識別功能，而 au-fe3o4 納米顆粒催化 h2o2 氧化 3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)的比色

9、檢測和鈣-吡啶二羧酸 (cadpa)敏5055化 eu 配合物的的熒光檢測。實驗結果證明，這種多功能納米探針可以在生理溶液里超靈敏檢測 cadpa，實現(xiàn)對 h2o2 氧化 tmb 的優(yōu)良催化活性。進一步實驗發(fā)現(xiàn)，該納米探針能夠比色/熒光雙模式檢測和量化癌細胞，對癌細胞的檢測限達 100 個。1 實驗1.1 試劑與儀器試劑：haucl4 3h2o、三丁基溴化銨(tbab) 、油胺、油酸、1,2,3,4-四氫化萘、1-十八烯、fe(co)5、聚乙二醇二胺(mw=3400)、聚乙二醇(mw=4000)和 3,4-二羥基苯甲醛購自sigmaaldrich 公司。葉酸、硫代乙醇酸、二環(huán)己基碳二亞胺(dc

10、c)、(nhs)、3,35,5-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)購自阿拉丁試劑公司。除了 dmf、dmso、chcl3 除水外，其他實際試劑未經(jīng)二次處理直接使用。1，-peg 二胺（nh2-peg-nh2），3,4-二羥基苯甲醛-peg-胺(dib-peg-nh2)60和二乙三胺五乙酸酐(dtpaa)10-12均參照文獻方法合成。17400 振動樣品磁強計，hitachirf-4500熒光光譜儀，ttherrnomattson型傅里葉變換紅外光譜儀，lambda 950紫外吸收光譜儀。1.2 納米探針（1e）的合成過程651e 的合成方法如圖 1 所示。圖 1 1e 的合成方法fig. 1 synthe

11、tic method of 1e-2-性納米顆?？梢院芎玫赜糜诩毎臒晒獬上窈痛殴舱癯上?。eu(iii)配合物有長熒光壽命、。儀器：varian 400 mhz h nmr核磁共振儀，philips em 420 (120kv)型透射電鏡，lakeshore1.2.1au-fe3o4 納米顆粒的合成7013, 0.1 g haucl4 3h2o 溶于油胺(10 ml)和四氫化萘(10 ml)中形成的黃色溶液，tbab (1 mmol)溶于油胺(1 ml)和四氫化萘(1 ml)，快速加入上述溶液中，黃色溶液迅速變紫紅色，室溫攪拌 1h。加乙醇 40 ml，離心，n2 氛圍下干燥。au np (

12、20 mg) 溶于油胺 (2 ml) ，油酸(1 ml)和 1-十八烯(20 ml)混合溶液中，n2 氛圍下 120 脫水 1 h，0.10 ml fe(co) 5 快速注入，然后快速升溫，維持在 300 回流 25min。75黑褐色反應產(chǎn)物冷卻到室溫，加異丙醇 40 ml，離心，少量乙醇清洗 3 次，產(chǎn)物最終分散到正己烷中保存。1.2.2hs-peg-nh2 (1a) 的合成0.092 g 硫代乙醇酸(1 mmol) 溶于 20 ml dmf, 加入 0.40 g dcc (1.5 mmol) 和 0.14g nhs(1.2 mmol)，室溫暗處攪拌 14h。白色副產(chǎn)物離心除去，離心液中加入

13、 3.4g 聚乙二醇80二胺（mw=3400），在室溫下繼續(xù)攪拌 14h。減壓蒸餾除去溶劑，加少量 chcl3 溶解殘渣，離1sh2ch2), 3.84 (t, 2h, nh2ch2ch2), 3.70 (bs, 187h, peg3400), 3.41 (t, 2h, nh2ch2).1.2.3 hs-peh-nh-fa (1b) 的合成葉酸(0.044 g,0.1 mmol)溶解在 3 mldmso 中，加入 0.04 g dcc (0.15mmol) 和 0.0148590g nhs(0.012 mmol)，室溫暗處攪拌 14h。白色副產(chǎn)物離心除去，離心液中加入 0.23 g(0.11m

14、mol) 1a，在室溫下繼續(xù)攪拌 14h。減壓蒸餾除去溶劑，加少量 chcl3 溶解殘渣，離心，1s, c8), 7.61 (2h, d, c13 和 c15), 6.61 (2h, d, c12 和 c16), 4.47 (2h, s, c9), 4.33(2h, dd, c19), 3.80 (s, 2h, sh2ch2), 3.64 (t, 2h, nh2ch2ch2), 3.50 (bs, 187h, peg3400),2.81 (t, 2h, nh2ch2), 2.65 (2h, m, c25), 2.55 (2h, m, c26), 2.20(2h, m, c20), 1.80pp

15、m (2h, m, c19).1.2.4 eu:dtpa-nh2-peg-dib-fe3o4-au (1d)的合成35.7 mg (0.1mmol) dtpaa 溶于dmf(5 ml), 1c (400 mg, 0.1 mmol)溶于chcl3，10min內(nèi)緩慢滴入溶液中，室溫攪拌12h。加乙醚沉淀離心。用chcl3 , dmf 、乙醚 (1/1/5, v/v/v)95洗3次, 真空干燥，產(chǎn)物保存在-20。dib-peg-dtpa (200 mg) 溶于 chcl3(10 ml), 加入au-fe3o4 (30 mg)，分散體系在室溫下攪拌過夜。加入正己烷，離心。產(chǎn)物用chcl3 和正己烷（1

16、/5, v/v）清洗3遍，最后分散在20 ml chcl3中。5 ml 乙醇的eucl3.6h2o (9 mg) 溶液加入上述溶液中，室溫下攪拌12h。加入正己烷沉淀出納米顆粒，離心分離，chcl3、乙醇、正己烷(1/1/5, v/v/v) 洗3次, 真空干燥，產(chǎn)物分散在chcl3。1001051.2.5 eu:dtpa-peg-fe3o4-au-hs-peg-fa (1e) 的合成5 ml 1b（0.04 g）的chcl3溶液中加入0.02g 1d，分散液在室溫暗處攪拌反應2h。正己烷沉淀，離心，chcl3、正己烷(1/5, v/v) 洗3次,產(chǎn)物分散在二次水中，室溫下水透析24h。收集產(chǎn)物

17、水溶液，避光5密封保存。1.3 過氧化氫酶活性的測定5hac-naac 緩沖液中 (0.2 m) 依次加入 20l 目標納米探針(12.4-3-mm)，50 l h2o2（c=20au-fe3o4 納米顆粒的合成參照文獻方法心，離心液用乙醚沉淀，干燥產(chǎn)物保存在-20。 hnmr (cdcl3, 400 mhz): = 4.2 (s, 2h,離心液用乙醚沉淀出，真空干燥，產(chǎn)物保存在-20。 hnmr (cdcl3, 400 mhz): =8.62 (1h,由參考文獻 ，首先選定 fe3o4 納米顆粒最佳 ph 為 4.0，h2o2 濃度 20 mm。在 2.0 mlmm）和 30 l tmb (

18、15.0 mm)作為催化底物，在不同溫度（060）中各孵育一定時間（10min，20 min）并測定紫外吸收強度，選擇出最佳溫度。在最佳溫度條件下，只改變 ph（2.59.0），其他條件不變，驗證得到最佳 ph。在最佳溫度、ph 和緩沖體系，選擇出 h2o2110最佳濃度。為了進一步驗證其過氧化氫酶活性，我們又選用二苯胺（dab）為底物，在相同條件下檢測其顏色變化。為了比較該納米探針各金屬組分的過氧化氫酶活性，我們把修飾成水溶性的 au 納米顆粒、fe3o4 納米顆粒、au 納米顆粒+ fe3o4 納米顆粒、au-fe3o4 納米顆粒作為相互對照組（au nps5nm，fe3o4 nps 12

19、nm），其中 fe 濃度為 12.4 mm，au 濃度為 7.0 mm。相對應固定濃度的納115米顆粒在 2.0 mlhac-naac 緩沖液中 (0.2 m ，ph = 4.5) 和 0.3 mm tmb 、不同濃度 h2o2（0.5 ml，020 mm）在室溫下反應，在 653nm 測定其隨時間變化的紫外吸收強度。1.4 細胞毒性測定作為一種癌細胞探針，首先 1e 自身應該不對細胞有很強烈的毒性。我們選用 hela 細胞系進行甲基噻唑基四唑實驗（mtt 法），細胞固定在 10% 胚胎牛血清培養(yǎng)基的 96 孔板中（5104120125個/孔），在 37 ，5% co2 氛圍下培養(yǎng) 24h。加

20、入不同濃度的 1e (1, 5, 50, 100 g/ml ，培養(yǎng)基中)，相同條件下培養(yǎng) 24h，48h ，72h。然后依次加入 mtt (20 ml/孔, 5 mg/ml) 培養(yǎng) 4h，dmso（100 l/孔）培養(yǎng)條件下穩(wěn)定 15min，用酶標儀選定 492 nm 觀測孔板的光強度。1.5 比色/熒光法檢測和量化癌細胞為了檢測 1e 對癌細胞的特異檢測性，我們選用具有葉酸受體的 hela 細胞系（人宮頸癌1415。選用 hela 細胞系作為實驗組，nih-3t3 作為對照組。首先，我們把定量的兩種細胞系（6000 個）分別和一系列濃度梯度的 1e (16、32、64 mm) 在 96 孔板

21、里孵育 2h 后立即用pbs 緩沖液洗 3 遍除去未靶向細胞的游離態(tài) 1e。與 1e 作用后的細胞分散在 0.6 ml pbs 緩沖130135140145液中，加入 tmb (0.3 mm)混勻后孵育 15min，直接在 653 nm 用酶標儀檢測。2 3 4 5 56 6 7遍除去未靶向細胞的游離態(tài) 1e。與 1e 作用后的細胞分散在 0.6 ml pbs 緩沖液中，加入 tmb(0.3 mm)混勻后孵 15min，直接在 653nm 用酶標儀檢測。類似的，我們選用 hela 細胞系作為實驗組，nih-3t3 作為對照組。我們把定量的兩種細胞系（6000 個）分別和一系列濃度梯度的 1e

22、(16、32、64 mm)在 eppendorf 管里孵育 2h后立即離心（1000 rpm，30s）除去未靶向細胞的游離態(tài) 1e，并用 pbs 緩沖液洗 3 遍。與 1e作用后的細胞分散在 2 ml pbs 緩沖液中，加入 cadpa (0.04 mm)混勻后孵育 30 min，直接用于熒光檢測。2 3 4 5 56 6 730s）除去未靶向細胞的游離態(tài) 1e，并用 pbs 緩沖液洗 3 遍。與 1e 作用后的細胞分散在 2 mlpbs 緩沖液中，加入 cadpa (0.04 mm)混勻后孵育 30 min，直接用于熒光檢測。2 結果與討論1e 的合成方法如圖 1 所示，在 dcc、nhs

23、活化作用下，聚乙二醇二胺一端巰基化，一端-4-細胞）作為實驗組和沒有葉酸受體的 nih-3t3 細胞系（小鼠成纖維細胞）作為對照組隨后實驗中，不同梯度個數(shù)的 hela 細胞（0、110 、110 、110 、110 、510 、110 、510 、110 ）和定量 1e（32 mm）在 96 孔板孵育 2h 后立即用 pbs 緩沖液洗 3在另一組實驗中，不同梯度個數(shù)的 hela 細胞（0、110 、110 、110 、110 、510 、110 、510 、110 ）和定量 1e（32 mm）在 eppendorf 管里孵育 2h 后立即離心（1000rpm，連接葉酸，得到 1b。聚乙二醇-3

24、，4-二羥基苯甲醛（1c）的活潑胺基和 dtpaa 反應，通過配位原理，鄰苯二酚基團取代 au-fe3o4 nps 表面油酸/油胺，dtpa 多羧和 eu（iii）配位，得到 1d。最后能夠和 au nps 強烈配位的巰基把 1b 偶聯(lián)在納米顆粒上，得到目標納米探針1e。由熱分解法制備的 au-fe3o4 nps 水溶性極差，但功能化修飾得到的目標納米探針 1e 水150155溶性良好；修飾前后，納米顆粒形態(tài)學變化可以忽略，但水動力學半徑顯著增加(圖 2)。圖 2 au-fe3o4 nps 修飾前后形貌變化測定：修飾前分散在正己烷中（a），修飾后分散在水中（b）的電鏡照片；修飾前后納米顆粒的水

25、動力學直徑變化fig. 2 morphology changes before and after modification of au-fe3o4 nps. tem images of au-fe3o4nps dispersed in hexane before (a) and after (b) modification；hydrodynamic diameters measuredby dls for the as-synthesized nps dispersed in hexane and 1e in pbs1e 的結構用紅外和熒光光譜進行了進一步的證實，偶聯(lián)在 fe3o4 一端的

26、dtpa 配位 eu（iii）通過紅外和熒光得到驗證。油相法制備的 au- fe3o4 nps 在 2850 cm-1和 2915 cm-1160165170強吸收歸屬于油酸/油胺 c-h 對稱和不對稱的伸縮振動。fe3o4 一端修飾完后，新出現(xiàn)的 1625-1 -1振動。圖 3 ir 圖譜: au-fe3o4 nps; (b) au-fe3o4-peg-dtpa; (c) 1d; (d) fa-peg-sh-au-fe3o4.fig. 3 the ir spectra of (a) as-synthesized au-fe3o4 nps; (b) au-fe3o4-peg-dtpa; (c)

27、 1d;(d)fa-peg-sh-au-fe3o4.2.1 過氧化氫酶活性的測定紫外吸收光譜測定，1e 的過氧化氫酶催化活性在本體系中最佳條件是:t=35 ,hac-naac 緩沖體系 ph=4.0，c(h2o2)=2.0 mm。同時為了進一步驗證其過氧化氫酶活性，我們又選用二苯胺（dab）為底物，在相同條件下檢測其顏色變化。如圖 4(a)所示，兩種底物都能被很快轉變?yōu)樗{色和棕色氧化態(tài)。為了比較該納米探針各金屬組分的過氧化氫酶活性，我們把修飾成水溶性的 au 納米顆粒、fe3o4納米顆粒、au 納米顆粒+ fe3o4納米顆粒、au-fe3o4 納米顆粒作為相互對照組。如圖 4(b)所示，兩種底

28、物都能被該探-5-cm 峰歸屬于 c=o 伸縮振動；au 一端偶聯(lián)葉酸后，新出現(xiàn)的 1694 cm 峰歸屬于 co-nh 伸縮針迅速催化氧化變色。紫外光譜顯示，不同納米顆粒對 tmb 都有催化氧化活性，但催175180185190化能力為 1e au + fe3o4 fe3o4 au。我們推測，1e（啞鈴狀 au-fe3o4 納米顆粒）的催化活性高于相應量的 au 納米顆粒和 fe3o4 納米顆粒的混合體系的原因是，分別具有催化活性的 au 納米顆粒和 fe3o4 納米顆粒在啞鈴狀 au- fe3o4 納米顆粒中表現(xiàn)出協(xié)同作用。圖 4 1e 的過氧化氫酶活性的測定:（a）1e 對 tmb 和

29、dab 催化顏色變化；（b）au (a), fe3o4 nps (b), au+ fe3o4 nps (c), aufe3o4 nps (d)四個實驗組在 pbs 緩沖液 (ph = 4.5) ，5.0 mm h2o2 和 0.3 mm tmb體系中孵育 15 min 后的的紫外光譜圖（照片顯示各實驗組顏色變化）fig. 4 the determination of catalase activity of 1e. (a) photographs show the production ofcoloured product upon addition of 1e to tmb and dab

30、at ph 4.0; (b) uv-vis spectra of pbs solutions(ph = 4.5) containing 5.0 mm h2o2 and 0.3 mm tmb in the presence of an equal number of au (a),fe3o4 nps (b), au + fe3o4 nps (c), and aufe3o4 nps (d) for 15 min. inset: photographs of differentsolutions corresponding to (ad).2.2 細胞毒性測定在體外癌細胞檢測應用之前，我們選用 he

31、la 細胞系進行 mtt 法實驗。如圖 5 所示，不同濃度 1e（以納米顆粒中金屬含量為標準）和 hela 細胞孵育 24h，細胞存活率達到 90%以上；甚至孵育 72h 后，細胞存活率也在 70%。這表明該納米探針毒性小，不影響細胞的存活。圖5mtt法檢測1e對hela細胞毒性fig. 5 detection the cytotoxicity of 1e to hela cell with mtt assay1952002.3 比色/熒光法檢測和量化癌細胞基于 dpa 能敏化 1e 而發(fā)熒光的事實，我們嘗試利用該體系通過熒光光譜來特異性量化癌細胞。如圖 6（a）所示，在 613nm 處，隨著

32、 1e 濃度的上升， hela 細胞熒光顯著強，而nih-3t3 細胞熒光弱且增強幅度極小，而且具有大量葉酸受體的 hela 細胞和對應數(shù)目的nih-3t3 細胞相比熒光強度更高。這說明了靶向 hela 細胞的 1e 數(shù)量逐漸增加，而 nih-3t3細胞即使數(shù)目 1e 增加數(shù)量增加較少。在另一組實驗中，如圖 6(b)所示，在 613 nm 處，隨著 hela 細胞個數(shù)的增加，熒光逐漸增強。hela 細胞個數(shù)增加，細胞表面靶向吸附的 1e 數(shù)量增加，通過細胞的富集作用，熒光強度逐漸增加。利用這種方法，我們對 hela 細胞個數(shù)的檢測限達 100 個。-6-類似的，為了進一步評定 1e 的過氧化氫

33、酶活性能否通過比色法對有葉酸受體過度表達205210的細胞定量檢測，同樣我們選用 hela 細胞系作為實驗組和 nih-3t3 作為對照組。如圖 6(c)所示，隨著 1e 濃度的上升，hela 細胞熒光顯著強，而 nih-3t3 細胞熒光弱且增強幅度可以忽略；而且具有大量葉酸受體的 hela 細胞和對應數(shù)目的 nih-3t3 細胞相比紫外吸收強度更高。這些結果和熒光光譜檢測結果一致。隨后實驗結果如圖 6（d）所示，在 tmb 和 h2o2 存在下，吸附更多 1e 的癌細胞能夠更快地催化體系顏色變化，可以通過肉眼輕易分辨而且在653nm 處通過紫外吸收定量檢測。隨著 hela 細胞個數(shù)增加，紫外

34、吸收強度增加，表明更多數(shù)量 1e 被特異性靶向富集到細胞表面。利用這種方法，我們對 hela 細胞個數(shù)的檢測限達100 個，該檢測結果和熒光光譜檢測結果一致。215圖6比色/熒光法檢測和量化癌細胞：1e孵育400s后以cadpa 為敏化劑在613nm處的熒光強度(a) 1e濃度梯度變化，(b) hela細胞數(shù)目梯度變化；1e孵育400s后以tmb為比色底物在652nm處的紫外吸收強度(c) 1e濃度梯度變化，(d) hela細胞數(shù)目梯度變化。fig. 6 colorimetric/fluorigenic dual-modal detection of cancer cells. (a) the

35、 emissionintensity values at 613 nm after 400 s depend on the concentration of 1e with cadpa as the220225230235fluorescent response reagent. (b) the emission intensity values at 613 nm after 400 s depend onthe number of hela cells.(c) the absorption values at 652 nm after 400 s depend on the oncentr

36、ationof 1e with tmb as the substrate. (d) the absorption values at 652 nm after 400 s depend on thenumber of hela cells.3 結論綜上所述，我們成功地把葉酸、銪配合物偶聯(lián)到 aufe3o4 表面，得到一種新穎的納米探針。該探針能夠熒光/比色雙模式檢測葉酸過度表達的癌細胞，對癌細胞的檢測限達 100個，這種多功能納米探針在生物醫(yī)學研究中能為癌癥早期診斷提供更準確的信息。參考文獻 (references)1 lee n, cho h r, oh m h, et al. multif

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