第4章DNA復(fù)制

1、第四第四章章 DNADNA的生物合成的生物合成 1953年Watson和Crick在提 出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。幾周以后， Watson和Crick提出了DNA復(fù)制 的半保留機(jī)制，并于1958年得 到Meselson和Stahl的同位素實(shí) 驗(yàn)證實(shí)。 探索DNA復(fù)制的詳細(xì)機(jī)制 及其調(diào)控，對于我們深入理解 遺傳物質(zhì)的傳遞模式，控制生 物體的生長過程，控制腫瘤和 艾滋病等嚴(yán)重疾病，均有重要 意義。 4.1 DNA復(fù)制的概況復(fù)制的概況 DNA復(fù)制復(fù)制(replication)是指親本DNA雙螺旋解開，兩條鏈 分別作為模板，合成子代DNA分子的過程。 染色體外的遺傳物質(zhì)如質(zhì)粒和噬菌體，以及線粒體和葉綠 體D

2、NA也有基本相似的復(fù)制過程，但它們的復(fù)制受到染色體 DNA復(fù)制的控制。 DNA復(fù)制過程的研究一般采用三類系統(tǒng)：一是X174 DNA或質(zhì)粒DNA及其完成復(fù)制所必需的酶、蛋白質(zhì)及其因子 構(gòu)成的體外系統(tǒng)。二是以E.coli為模式生物，研究原核生物的 復(fù)制。三是以酵母和動物病毒為模式生物，研究真核生物的 DNA復(fù)制。 半保留復(fù)制半保留復(fù)制 (semiconservative replication)的設(shè)想， 即DNA的兩條鏈彼 此分開各自作為模 板，按堿基配對規(guī) 則合成互補(bǔ)鏈。由 此產(chǎn)生的子代DNA 的一條鏈來自親代， 另一條鏈則是以這 條親代鏈為模板合 成的新鏈。 4.1.1 DNA的半保留復(fù)制的半

3、保留復(fù)制 1958年，Meselson和 Stahl應(yīng)用同位素標(biāo)記 法和CsCl密度梯度超速 離心技術(shù)研究E.coli的 DNA復(fù)制，才證實(shí)了 半保留復(fù)制是正確的。 4.1.2 復(fù)制的起點(diǎn)和方向復(fù)制的起點(diǎn)和方向 基因組中能獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的單位稱復(fù)制子復(fù)制子 (replicon) ，在每個(gè)細(xì)胞周期中，每個(gè)復(fù)制子只復(fù)制一 次。 原核細(xì)胞基因組、質(zhì)粒、許多噬菌體、某些病毒 的DNA及真核生物的細(xì)胞器DNA，一般由單個(gè)復(fù)制子 構(gòu)成。 復(fù)制起點(diǎn)起點(diǎn)(origin) 復(fù)制叉復(fù)制叉(replication fork)。 復(fù)制泡或復(fù)制眼(replication eye)。 1963年Cairns觀察在大腸桿菌D

4、NA復(fù)制 時(shí)所形成的放射自 顯影圖片，結(jié)果低放射活性區(qū)在復(fù)制泡的中間，而高放射活性 區(qū)則在兩端，這說明腸桿菌染色體的復(fù)制是朝兩個(gè)方向進(jìn)行的 (圖4-2)。 環(huán)形DNA復(fù)制時(shí)，DNA 會形成類似字母的形狀， 故稱作型復(fù)制。 Visualization of bidirectional DNA replication. Replication of a circular chromosome produces a structure resembling the Greek letter theta (). (a) Labeling with tritium (3H) shows that bot

5、h strands are replicated at the same time (new strands shown in red). The electron micrographs illustrate the replication of a circular E. coli plasmid as visualized by autoradiography. DNA復(fù)制的起始點(diǎn) （origin）是含有100 200個(gè)堿基對的一段DNA。 原核生物的環(huán)狀DNA只有 一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，其復(fù)制叉 移動的速度約為105 bp/min。E.coli的DNA復(fù) 制一次需40min，但在迅 速生長的原

6、核生物中，第 一次復(fù)制尚未完成，第二 次復(fù)制就在同一個(gè)始點(diǎn)上 開始，從而，使原核生物 可以用更快的速度繁殖。 在真核生物染色體的不同位置上有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，真核生 物的復(fù)制叉移動較慢(51025103bp /min)，但由于同時(shí)起 作用的復(fù)制叉數(shù)目很大，真核生物染色體DNA復(fù)制的總速度比 原核生物更快。例如，果蠅胚胎的基因組DNA總長為大腸桿菌 的40倍，卻可在3min內(nèi)完成復(fù)制。 4.2 原核生物原核生物DNA的復(fù)制的復(fù)制 4.2.1 參與原核生物參與原核生物DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)復(fù)制的酶和蛋白質(zhì) 4.2.1.1 DNA 聚合酶聚合酶 DNA聚合酶聚合酶I(DNA polymerase I,

7、DNA pol I)，它是Mr為109000 的一條肽鏈，催化DNA新鏈合成時(shí)，需要四種脫氧核苷三磷酸 作為底物，還需Mg2+和DNA模板，以及與模板DNA互補(bǔ)的一 小段RNA引物，合成的方向是從5-末端到3-末端。 (圖4-3)。 The search for an enzyme that could synthesize DNA began in 1955. Work by Arthur Kornberg and colleagues led to the purification and characterization of DNA polymerase from E. coli ce

8、lls, a single-polypeptide enzyme now called DNA polymerase I (Mr 103,000; encoded by the polA gene). Much later, investigators found that E. coli contains at least four other distinct DNA polymerases. 脫氧核苷酸單位遵循堿基配 對的原則逐個(gè)加到引物的3-端， DNA pol I不但可催化DNA鏈的 延長，也能催化DNA鏈的水解， 它具有35方向的外切酶活力， 和53方向的外切酶活力。 35外切酶可

9、切除錯(cuò)配的核苷 酸，即具有校對功能校對功能 (proofreading function)。53外 切酶可用于切除RNA引物。 DNA polymerase I has three enzymatic activities in a single polypeptide chain, which can be cleaved into two functional parts by mild protease treatment. Protease cleavage Crystal structure of phage T7 DNA polymerase has a right hand st

10、ructure. DNA lies across the palm and is held by the fingers and thumb. 在DNA復(fù)制時(shí)，DNA pol I的主要作用是利用其53外 切酶活力切除RNA引物，利用 其53聚合酶活力，將脫氧 核苷酸連接到相鄰DNA片段的 3-羥基上，逐漸用DNA鏈取代 RNA引物。此外，在DNA損 傷的修復(fù)中，DNA pol I可用類 似的機(jī)制切除有損傷的DNA片 斷，并用正確的DNA片段填補(bǔ) 缺口(圖4-5)。上述過程可以使 DNA鏈上的切口移動，稱切口 平移。 1970年代，先后發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶聚合酶II (DNA polymerase

11、II, DNA pol II)和DNA聚合酶聚合酶III(DNA polymeraseIII, DNA pol III)。 DNA pol I主要參與DNA損傷的修復(fù)，DNA pol III是主要的復(fù)制 酶。E.coli 3種DNA聚合酶的主要數(shù)據(jù)如表4-1所示， 表 4-1 大腸桿菌DNA聚合酶的有關(guān)數(shù)據(jù) DNA聚合酶的類型IIIIII 結(jié)構(gòu)基因polApolB(dnaA)polC(dnaE) 亞基數(shù) 1 710 Mr(kD) 10388 830 35外切酶活性有有有 53外切酶活性有無無 聚合速度(核苷酸/秒)1620402501 000 連續(xù)合成能力(核苷酸)32001500500 00

12、0 DNA pol III含有兩個(gè)核心酶核心酶 (core enzyme)，其亞基組成均為 ，其中的亞基具有聚合酶活 性，亞基具有校對活性， 亞 基二聚體將兩個(gè)核心酶連接為一 個(gè)復(fù)合物。每個(gè)核心酶連接一個(gè) -滑動夾子滑動夾子(-sliding clamp)結(jié)構(gòu)， 每個(gè)-滑動夾子由2個(gè)亞基構(gòu)成， 可將正在復(fù)制的DNA固定在夾 子中心，并能隨DNA復(fù)制沿著 模板DNA鏈滑動(圖4-7)。 1990年代末發(fā)現(xiàn)的DNA聚 合酶IV和V在DNA出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p 傷時(shí)，參與DNA損傷的修復(fù)。 4.1.2.2 參與原核生物參與原核生物DNA復(fù)制的其它酶和復(fù)制的其它酶和蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) (1) DNA解旋酶解旋酶 DN

13、A雙螺旋的解開需DNA解旋酶解旋酶(DNA helicase) 參與，該酶一般由六個(gè)亞基組成，解開雙螺旋需ATP 提供能量。 解旋酶具有內(nèi)在的依賴于DNA的NTP酶活性， DNA解旋酶都具有移位酶(translocase)活性。 解鏈的極性，解旋酶在與DNA結(jié)合以后的移位 一般是單向的。 (2) 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)合蛋白(single strand binding protein, SSB) 本身并無任何酶的活性，但通過與DNA單鏈區(qū)段的結(jié) 合，起到穩(wěn)定單鏈DNA的作用 E.coli 的SSB以四聚存在，Mr為74 KD，原核生 物的SSB與DNA單鏈的結(jié)合具有正協(xié)同

14、效應(yīng)。 （3） 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoisomerase)是一類通過催化DNA 鏈的斷裂、旋轉(zhuǎn)和再連接而直接改變DNA拓?fù)鋵W(xué)性 質(zhì)的酶。 拓?fù)洚悩?gòu)酶I(TopoI)曾 被稱作 (Omega)蛋白， 松馳酶等，可消除和減 少負(fù)超螺旋，對正超螺 旋不起作用。其作用機(jī) 制是切開DNA雙鏈中 的一條鏈，繞另一條鏈 一周后再連接，可以改 變DNA的連環(huán)數(shù)，從 而改變超螺旋的圈數(shù)， 其作用過程不需要ATP 提供能量。(圖4-8)。 拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶II(topII)可以切斷DNA的兩條鏈， 使其跨越另一段雙鏈DNA后再連接，在消耗ATP 的情況下，每作用一次可引入2個(gè)負(fù)超

15、螺旋(見圖 2-28)。在DNA復(fù)制時(shí)，引人負(fù)超螺旋有利于兩條 鏈解開。此外，DNA復(fù)制時(shí)，隨著雙鏈的解開， 會產(chǎn)生形成正超螺旋的扭曲張力，TopII引入負(fù)超 螺旋，可消除這種扭曲張力，使復(fù)制可持續(xù)進(jìn)行。 Top I 和 Top II廣泛存在于原核和真核生物， Top I主要集中在轉(zhuǎn)錄區(qū)，與轉(zhuǎn)錄有關(guān)，Top II分 布于染色質(zhì)骨架蛋白和核基質(zhì)部分，與復(fù)制有關(guān)。 （4） 引發(fā)酶引發(fā)酶 原核生物DNA復(fù)制時(shí)，首先要在引發(fā)酶引發(fā)酶(primase)的作用下 合成RNA引物，隨即在DNA聚合酶III催化下合成DNA鏈。 E.coli引發(fā)酶由一條肽鏈組成，但具有三個(gè)相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域， N-端結(jié)構(gòu)域(p1

16、2)具有鋅指結(jié)構(gòu)，是結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域。C-端 結(jié)構(gòu)域(p16)可以與復(fù)制叉內(nèi)的DnaB蛋白相互作用，通過這種 相互作用，引發(fā)酶被招募到復(fù)制叉上。核心結(jié)構(gòu)域(p35)位于中 央，是RNA聚合酶的活性中心。 （5） DNA連接酶連接酶 如前所述，DNA pol I可以催化切口平移，但不 能催化1個(gè)DNA片段的3-OH和另一個(gè)DNA片段的 5-磷酸基之間最后一個(gè)鍵的形成。在細(xì)胞中，切口 的連接是由DNA連接酶連接酶(DNA ligase)催化的。連接酶 均是基因工程中常用的工具酶。 酶或蛋白質(zhì) Mr （103） 亞基數(shù)功能結(jié)構(gòu)基因 SSB（單鏈結(jié)合蛋白）764穩(wěn)定解開的單鏈ssb Dna T663

17、預(yù)引發(fā) n蛋白282預(yù)引發(fā)引物體裝配 Dna A504在復(fù)制起點(diǎn)特異部位解開雙鏈DNAdna A Dna C291傳送Dna B至解旋的模板DNA上dna C Dna B(解旋酶)3006利用ATP水解能量解開鏈DNAdna B HU（類組蛋白）192促進(jìn)起始 DnaG(引物酶)601合成RNA引物dna G DNA聚合酶III40010合成DNA DNA聚合酶I1091修復(fù)（填充缺口）切除RNA引物pol A DNA連接酶741共價(jià)連接切口lig 拓?fù)洚悩?gòu)酶I1004松弛負(fù)超螺旋 拓?fù)洚悩?gòu)酶II4004引入負(fù)超螺旋 A亞基1052鏈的斷裂、再連接gyr A B亞基952ATP酶gry B R

18、ep蛋白66135解旋sep 解旋酶I180解鏈 解旋酶II751解鏈 解旋酶III20解鏈 表 4-3 參與原核物DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì) 4.2.2 復(fù)制的起始復(fù)制的起始 E.coli只有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)稱OriC，由245bp組成。這一順序在 大多數(shù)細(xì)菌中是高度保守的，其排列方式如圖4-11所示，關(guān)鍵順 序是3個(gè)13bp的正向重復(fù)順序，和4個(gè)9bp(TTATCCACA)的重復(fù)序 列，此外還有11個(gè)拷貝的甲基化位點(diǎn)序列GATC。 DNA復(fù)制的起始階段需要在引發(fā)體引發(fā)體(primosome)作用下合成 RNA引物。 (1) 在HU蛋白、整合宿主因子 (integration host factor

19、, IHF)的幫助下， Dna A蛋白四聚體在ATP參與下，結(jié)合 于OriC的9bp重復(fù)順序(富含A-T)。 (2) Dna A組裝成蛋白核心，DNA 則環(huán)繞其上形成類似核小體的結(jié)構(gòu)。 (3) Dna A蛋白所具有的ATP酶活 性，水解ATP以驅(qū)動13 bp重復(fù)序列內(nèi) 富含AT堿基對的序列解鏈，形成長約 45 bp的開放起始復(fù)合物。 (4) 在Dna C蛋白和Dna T蛋白的幫 助下，2個(gè)Dna B蛋白被招募到解鏈區(qū)， 此過程也需要消耗ATP。 (5) 在Dna B蛋白的作用下，OriC 內(nèi)的解鏈區(qū)域不斷擴(kuò)大，形成復(fù)制泡 和2個(gè)復(fù)制叉。隨著單鏈區(qū)域的擴(kuò)大， 多個(gè)單鏈結(jié)合蛋白(SSB)結(jié)合于解開

20、的 DNA單鏈部分，穩(wěn)定單鏈DNA (圖4- 12)。Dna B解螺旋形成的扭曲張力， 在 TOPII的作用下被消除。 4.2.3 DNA鏈的延伸鏈的延伸 DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪?平行的，但DNA合成的 原料均為5-核苷三磷酸， 形成酯鍵時(shí)，只能將5- 位的磷酸基連接到引物 的3- OH上。與此相對應(yīng)， 迄今發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶 只能催化53方向的新 鏈合成。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說 明，新鏈的合成方向是 53。 1968年岡崎等用3H標(biāo)記的脫氧胸苷短時(shí)間處理 噬菌體感染的大腸桿菌，然后分離標(biāo)記的DNA產(chǎn)物， 發(fā)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)首先合成的是較短的DNA片段，接著 很快即可出現(xiàn)較大的分子。這些DNA短片段被定名 為岡

21、崎片段岡崎片段(Okazaki fragment)。 DNA復(fù)制時(shí)，一條鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的，另一條鏈 是由間斷合成的短片段連接而成的，這樣的復(fù)制過 程稱作半不連續(xù)復(fù)制半不連續(xù)復(fù)制(semidiscontinuous replication)。 前導(dǎo)鏈前導(dǎo)鏈(leading strand)。 后隨鏈：后隨鏈：另一條鏈?zhǔn)窃?已經(jīng)形成一段單鏈區(qū)后， 先按與復(fù)制叉移動的方 向相反的方向，沿53 方向合成短片段(岡崎片 段)，再通過酶的作用將 短片段連在一起構(gòu)成完 整的鏈 (lagging strand)。 后隨鏈的模板鏈環(huán)化， (圖4-14)。 (1) 在Pri A, Pri B和PriC 蛋白的幫助下，

22、Dna G蛋白(引 發(fā)酶)被招募到2個(gè)復(fù)制叉上， 與DnaB 蛋白結(jié)合在一起， DnaA 蛋白逐漸脫離復(fù)合物。 (2) Dna G沿著DNA模板 鏈合成前導(dǎo)鏈的RNA引物。 (3) DnaG沿著DNA模板鏈 合成后隨鏈的RNA引物。 (4) DNA pol III結(jié)合到兩 個(gè)復(fù)制叉上。 (5) 由DNA pol III分別合 成前導(dǎo)鏈和后隨鏈。 DNA合成的速度是每條鏈每秒加接約1000個(gè)核苷酸。 岡崎片段一旦合成完畢，它的RNA引物被DNA pol I除去并用DNA鏈來替換。留下一個(gè)切口(mick)由 DNA連接酶連接。 由于DNA復(fù)制是半不連續(xù)性的，前導(dǎo)鏈上只需 要合成一個(gè)RNA引物，而在

23、后隨鏈上則每一個(gè)岡崎 片段均需要合成一個(gè)RNA引物。這些RNA引物隨后 要被切除，這是一個(gè)高度耗能的過程。？ 4.2.4 復(fù)制的終止復(fù)制的終止 單向復(fù)制的環(huán)狀DNA分子，其復(fù)制的終點(diǎn)就是其 原點(diǎn)。雙向復(fù)制的DNA環(huán)形分子，在兩個(gè)復(fù)制叉相遇 時(shí)即完成復(fù)制。但兩個(gè)復(fù)制叉合成新鏈的速度一旦出 現(xiàn)差異，就可能為復(fù)制的終止造成麻煩。 E.coli的順時(shí)針復(fù)制叉有4個(gè) 連續(xù)排列的稱作終止子終止子 (terminator, ter)的序列。逆 時(shí)針復(fù)制叉有3個(gè)連續(xù)排列 的終止子，當(dāng)復(fù)制叉移動到 終止子處，被稱作終點(diǎn)利用 物質(zhì)(terminus utilization substans, Tus)的蛋白質(zhì)會結(jié)

24、 合在ter序列上，阻止復(fù)制叉 的移動。這樣，當(dāng)一個(gè)復(fù)制 叉先期到達(dá)終止區(qū)時(shí)，其復(fù) 制會停止，待另一個(gè)復(fù)制叉 到達(dá)同一位置，兩個(gè)復(fù)制叉 相遇，即完成了整個(gè)DNA 的復(fù)制過程(圖4-17)。 DNA復(fù)制完成后兩個(gè)子代分子 以連環(huán)體（catenanes）的形 式存在，需要由拓?fù)洚悩?gòu)酶 將其中的一個(gè)環(huán)狀分子切開， 使兩個(gè)子代分子脫離后再將切 開的DNA連接成環(huán)狀分子。 4.3 真核生物真核生物DNA的的復(fù)制復(fù)制 研究真核生物DNA的復(fù)制是一項(xiàng)困難的工作， 目前有關(guān)的資料主要是從對SV40病毒和酵母菌的研 究中得到的。真核生物DNA復(fù)制的基本過程與原核 生物相似，但參與復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)與原核生物不 同

25、，復(fù)制起始的調(diào)控更加復(fù)雜。 4.3.1 參與真核生物參與真核生物DNA復(fù)制的酶和蛋白質(zhì)復(fù)制的酶和蛋白質(zhì) 在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶已超過15種， 其中最重要的是較早發(fā)現(xiàn)的5種，即DNA聚合酶, , , 和(表4-4)，而新發(fā)現(xiàn)的10多種DNA聚合酶，如 聚合酶, , , , , , , 和，除外均無3-外切酶 活性，也就是說沒有校對的功能，它們主要參與 DNA損傷的修復(fù)。 4.3.1.1 DNA 聚合酶聚合酶 DNA 聚合酶聚合酶(DNA pol)是一種四聚體蛋白， p180亞基具有類似原核生物DNA pol I的手型結(jié)構(gòu)。 DNA pol的三個(gè)小亞基中有兩個(gè)具有引發(fā)酶的活 性，負(fù)責(zé)合成R

26、NA引物。 DNA pol缺乏3-外切酶活性，因此無校對能力。 但在DNA復(fù)制過程中，復(fù)制蛋白A(replication protein A, RPA)與它相互作用，穩(wěn)定其與引物末端的結(jié)合， 同時(shí)降低參人錯(cuò)誤核苷酸的機(jī)會，抵消了無校對能力 對復(fù)制忠實(shí)性的不利影響。 4.3.1.2 DNA聚合酶聚合酶和和 DNA聚合酶聚合酶(DNA pol)由35個(gè)亞基組成。 DNA聚合酶聚合酶(DNA pol)由四個(gè)亞基組成。DNA pol 和都有3-外切酶活性，因此具有校對能力。 增殖細(xì)胞核抗原增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)為聚合酶的輔助蛋

27、白，其作用相當(dāng)于E.coli DNA pol III的亞基。在真核細(xì)胞DNA復(fù)制中，由 PCNA三個(gè)亞基組成滑動鉗，以提高聚合酶合成 DNA的連續(xù)性 (圖4-18) 。岡崎片段合成后，PCNA 會從聚合酶及DNA鏈上脫落，加入另一個(gè)岡崎片段 合成。 4.3.1.3 DNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶(DNA pol)是真核細(xì)胞中最小的 DNA聚合酶，由一條Mr為39 kD的多肽鏈組成。其N- 端較小的結(jié)構(gòu)域可與單鏈DNA結(jié)合，且具有5-脫氧 核糖磷酸酶(5-deoxyribose phosphatase)的活性，C-端 較大的結(jié)構(gòu)域具有聚合酶的活性。DNA pol參與 DNA損傷的修復(fù)，能夠填補(bǔ)DNA鏈上的短缺口。 4.3.1.4 DNA聚合酶聚