醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-整理筆記

1、-作者xxxx-日期xxxx醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)-整理筆記【精品文檔】第2章 基因、基因組和基因組學(xué)基因 (gene)：攜帶有遺傳信息的 DNA或 RNA序列，也稱為遺傳因子?；蚴呛铣捎泄δ艿牡鞍踪|(zhì)或 RNA所必需的全部 DNA，包括編碼蛋白質(zhì)或 RNA的核酸序列，也包括為保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列?；虻墓δ埽簜鬟f遺傳信息，控制個(gè)體性狀表現(xiàn)。 結(jié)構(gòu)基因 (structural genes)：可被轉(zhuǎn)錄形成 mRNA，并轉(zhuǎn)譯成多肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，催化各種生化反應(yīng)的酶和激素等。調(diào)節(jié)基因 (regulatory genes) ：某些可調(diào)節(jié)控制結(jié)構(gòu)基因表達(dá)的基因。其突變可影響一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的功能

2、，或?qū)е乱粋€(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)(或酶)量的改變。 eg. miRNA, siRNA, piRNA種類IIIIII分布核仁核基質(zhì)核基質(zhì)產(chǎn)物rRNAmRNA, microRNA5S rRNA, tRNA, siRNA 核糖體 RNA 基因 (ribosomal RNA genes) 與轉(zhuǎn)運(yùn) RNA 基因 (transfer RNA genes)：只轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生相應(yīng)的RNA而不翻譯成多肽鏈。 真核生物的RNA聚合酶 ( 3種)：RNA 聚合酶 I, II, III. 開放閱讀框架 (open reading frame，ORF)：在DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開始，到終止密碼為止的一個(gè)連續(xù)編碼序列。斷裂

3、基(split gene)：真核生物結(jié)構(gòu)基因，由若干個(gè)編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔開但又連續(xù)鑲嵌而成，去除非編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)?；蚪M (genome)：一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的全部遺傳信息，包括染色體基因組和染色體外基因組。 基因組中的 DNA包括編碼序列和非編碼序列。 部分病毒基因組-RNA。 C值 (C-value)：一種生物體單倍體基因組DNA的總量，用以衡量基因組的大小。通常，進(jìn)化程度越高的生物其基因組越大，但從總體上說，生物基因組的大小同生物在進(jìn)化上所處地位的高低無關(guān)。存在 C-value paradox （C值悖理）。生物復(fù)雜性越高，其基因的密度越低。 病毒基因

4、組的大小: 與細(xì)菌或真核細(xì)胞相比，病毒的基因組很小。不同的病毒之間基因組大小相差很大。乙肝病毒DNA：3kb，編碼4種蛋白質(zhì)；痘病毒的基因組：300kb，編碼幾百種蛋白質(zhì)。病毒基因組的大小通常與其對(duì)宿主的依賴程度有關(guān)，基因組越大，依賴性越小。 RNA 病毒基因組編碼序列具有節(jié)段性 :有些病毒的基因組 RNA由不連續(xù)的幾條核酸鏈組成（如流感病毒，輪狀病毒等）。 分段基因組的病毒一般感染效率較低 ；分段基因組容易發(fā)生重組，故病毒容易變異 。 目前未發(fā)現(xiàn)DNA病毒有此狀況。病毒基因存在基因重疊 :基因重疊：同一段DNA片段能夠參與編碼兩種甚至兩種以上的蛋白質(zhì)分子。這種現(xiàn)象在其它的生物細(xì)胞中僅見于線粒

5、體和質(zhì)粒DNA。此結(jié)構(gòu)意義在于使較小的基因組能夠攜帶較多的遺傳信息。 基因重疊的方式 :1）一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因里面。2）幾個(gè)基因部分重疊。3）兩個(gè)基因之間只有一個(gè)堿基重疊。 重疊基因的DNA序列可能大部分相同，但由于翻譯時(shí)的讀碼框架不同、或起始部位不同而產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。 有些真核病毒的部分序列，對(duì)某一個(gè)基因來說是內(nèi)含子，而對(duì)另一個(gè)基因而言卻是外顯子。 病毒基因組的大部分序列具有編碼功能：病毒基因組的大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的，只有非常小的一部份沒有編碼翻譯功能。 X174基因組中不編碼的序列只占217/5375。乳頭瘤病毒基因組約，其中不編碼的部分約為。 少數(shù)真核生物病毒的基因組也存在內(nèi)

6、含子結(jié)構(gòu)。病毒基因組的轉(zhuǎn)錄單元是多順反子 :多順反子 mRNA (polycistronie mRNA) ：病毒基因組DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或 rRNA的基因往往叢集在基因組的一個(gè)或幾個(gè)特定的部位，形成一個(gè)功能單位或轉(zhuǎn)錄單元。它們可被一起轉(zhuǎn)錄成含有多個(gè) mRNA 的分子。病毒基因組都是單倍體：除了逆轉(zhuǎn)錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個(gè)基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次。 逆轉(zhuǎn)錄病毒帶有逆轉(zhuǎn)錄酶，能使RNA反向轉(zhuǎn)錄生成DNA，因此其基因組可擁有兩個(gè)拷貝。 噬菌體基因具有連續(xù)性：噬菌體的基因是連續(xù)的，而真核細(xì)胞病毒的基因是不連續(xù)的，具有內(nèi)含子。 原核生物基因組通常比較簡(jiǎn)單，其基因組大

7、小在106bp107bp之間，所包含的基因數(shù)目幾百個(gè)到數(shù)千個(gè)之間。 原核生物基因組通常由一條環(huán)狀的雙鏈DNA分子組成，在細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體的形式，在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)致密的區(qū)域，稱為類核（nucleoid）. 大腸桿菌染色體基因組的結(jié)構(gòu)和功能 :大腸桿菌基因組序列中的基因密度非常高，編碼區(qū)所占的比例較大。大腸桿菌中總共有4288個(gè)基因，平均編碼長(zhǎng)度為 950bp，基因之間的間隔區(qū)長(zhǎng)度為 118bp，而且這些結(jié)構(gòu)基因沒有內(nèi)含子。大腸桿菌DNA分子中的重復(fù)序列很少，但在大腸桿菌基因組中不同部位可以有稱為 轉(zhuǎn)座子 的50kb的重復(fù)片段。 轉(zhuǎn)座因子：原核生物轉(zhuǎn)座因子主要有二類：插入序列 (inse

8、rtion sequence，IS) : IS：2000bp以內(nèi)，兩端都有正向重復(fù)序列（direct repeats，DR）和反向重復(fù)序列（inverted repeats，IR），中間1kb左右的編碼序列，僅編碼和轉(zhuǎn)座有關(guān)的轉(zhuǎn)座酶。 只有當(dāng) IS 轉(zhuǎn)座到某一基因中使該基因失活或插入位點(diǎn)旁邊的染色體發(fā)生畸變等效應(yīng)時(shí)才會(huì)被發(fā)現(xiàn)。 復(fù)合型轉(zhuǎn)座子 ( composite transposon, Tn) : Tn ：200020000bp之間，兩端由一對(duì) IS 元件組成，帶有與轉(zhuǎn)座作用有關(guān)的基因以及其他基因。 根據(jù)轉(zhuǎn)座的的機(jī)制和結(jié)果，可將轉(zhuǎn)座分為：復(fù)制型轉(zhuǎn)座，保守型轉(zhuǎn)座大腸桿菌染色體外基因組的結(jié)構(gòu)和功

9、能：質(zhì)粒（plasmid）：一類染色體外具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子，屬染色體外基因組。 大腸桿菌質(zhì)粒是雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的 DNA 分子?？梢杂泄矁r(jià)閉合環(huán)狀 DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）、缺口的環(huán)狀 DNA、線性DNA 三種結(jié)構(gòu)狀態(tài)。質(zhì)粒對(duì)宿主細(xì)胞的生存一般不是必需的，但質(zhì)粒帶有某些特殊的不同于宿主細(xì)胞的遺傳信息，其存在賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。質(zhì)粒能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子（autonomous replicon）。嚴(yán)緊控制（stringent control）型質(zhì)粒：其復(fù)制常與宿主的繁殖偶聯(lián)，拷貝數(shù)較少，每個(gè)細(xì)胞中只有1個(gè)到

10、十幾個(gè)拷貝。松弛控制（relaxed control）型質(zhì)粒：其復(fù)制與宿主不偶聯(lián)，每個(gè)細(xì)胞中有幾十到幾百個(gè)拷貝。 質(zhì)粒的穩(wěn)定性與不相容性: 質(zhì)粒的不相容性（incompatibility）：兩種不同質(zhì)粒因利用同一復(fù)制和維持機(jī)制，在復(fù)制和隨后向子代細(xì)胞分配的過程中會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，從而不能在同一宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在，其中一種質(zhì)粒將被丟失。 攜帶不同復(fù)制和維持機(jī)制的質(zhì)粒屬于不同的不相容群，它們可以共存于同一細(xì)胞中。 影響質(zhì)粒穩(wěn)定性的因素：1.主細(xì)胞分裂時(shí)質(zhì)粒能否均衡地分配到子代細(xì)胞。2.質(zhì)粒分子自身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。 真核生物的遺傳物質(zhì)絕大部分存在于細(xì)胞核染色體，少部分存在于線粒體或葉綠體中-細(xì)胞核基因組和細(xì)

11、胞器基因組。 真核生物染色體基因組特點(diǎn) : 人類基因組中僅含有2500030000個(gè)基因，遠(yuǎn)低于預(yù)期。在人類基因組中只有很少一部份（約2-3）DNA序列用以編碼蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)RNA。人類基因組中存在大量基因間隔區(qū)序列，主要由重復(fù)DNA構(gòu)成。 在基因內(nèi)部含大量?jī)?nèi)含子。 單拷貝序列：占 40%-80%，結(jié)構(gòu)基因基本上屬于單拷貝序列。中度重復(fù)序列：重復(fù)次數(shù)10105，占 10-40%。如rRNA、tRNA、組蛋白以及免疫球蛋白的基因等，另有部分可能與基因的調(diào)控有關(guān)。高度重復(fù)序列：拷貝數(shù)大于106 ，占 10-60%。如反向重復(fù)序列 (inverted repeats) 和衛(wèi)星DNA (satellit

12、e DNA)。 反向重復(fù)序列常見于基因的調(diào)控區(qū)，可能與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)。 重復(fù)序列的多態(tài)性：DNA多態(tài)性：DNA 序列發(fā)生變異從而導(dǎo)致的個(gè)體間核苷酸序列的差異。主要包括 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）和 串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性（tandem repeats polymorphism）。 SNP-由基因組DNA上的單個(gè)堿基的變異引起的DNA序列多態(tài)性。 據(jù)估計(jì)，人類基因組中每1kp就存在一個(gè)SNP位點(diǎn)，共有約300萬(wàn)個(gè)之多，是人群中個(gè)體差異最具代表性的DNA多態(tài)性。 相當(dāng)一部分SNP還直接或間接與個(gè)體的表型差異、對(duì)疾病的易感性或抵抗能力、對(duì)

13、藥物的反應(yīng)性等相關(guān)。 大多數(shù)SNP位點(diǎn)十分穩(wěn)定，人類85%的SNP是共有的。 高度重復(fù)序列中的無間隔反向重復(fù)序列很容易形成限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，也很容易因?yàn)橥蛔儺a(chǎn)生或是失去一個(gè)酶切位點(diǎn)，可以造成 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (restriction fragment length polymorphism， RFLP).真核基因組存在多基因家族與假基因 :多基因家族 (multi gene family)：由某一祖先基因經(jīng)過重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一組基因。 假基因 (pseudo gene)：與某些有功能的基因結(jié)構(gòu)相似，但不能表達(dá)有功能的基因產(chǎn)物的某些基因。 多基因家族大致可分為兩類： 一個(gè)基因家族的不

14、同成員成簇地分布在不同染色體上，但核酸序列高度同源，編碼一組功能上緊密相關(guān)的蛋白質(zhì)，如珠蛋白基因家族。 基因家族成簇地分布在某一條染色體上，它們可同時(shí)發(fā)揮作用，合成某些蛋白質(zhì)，如組蛋白基因家族就成簇地集中在第7號(hào)染色體長(zhǎng)臂3區(qū)2帶到3區(qū)6帶區(qū)域內(nèi)，這種分布方式與DNA復(fù)制時(shí)需要大量的組蛋白有關(guān)。 假基因的產(chǎn)生有兩種方式：由突變引起的基因序列變化而失去功能，這樣產(chǎn)生的假基因帶有內(nèi)含子，稱為常規(guī)假基因（conventional pseudogene）。mRNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再插入基因組，由于插入位點(diǎn)不合適或序列發(fā)生變化而導(dǎo)致失去功能。這種類型的假基因不含內(nèi)含子，稱為已加工的假基因（proc

15、essed pseudogenes）。真核生物細(xì)胞器基因組：真核生物有兩類細(xì)胞器能攜帶遺傳物質(zhì)：線粒體和葉綠體。這些遺傳物質(zhì)獨(dú)立于細(xì)胞核基因組外，能夠自行復(fù)制和表達(dá)，又稱為染色體外基因組。 線粒體基因組編碼其自身蛋白質(zhì)合成體系的某些成員，如rRNA和tRNA等，以及呼吸鏈中的某些成員，如ATP酶、NADH還原酶、細(xì)胞色素氧化酶復(fù)合體中的某些組分。其它成員由細(xì)胞核基因組編碼。 高等動(dòng)物線粒體基因組具有獨(dú)特的特點(diǎn)：母系遺傳。子代線粒體基因組來自母親，父系的線粒體基因組在精卵結(jié)合時(shí)一般不能進(jìn)入卵細(xì)胞。 線粒體DNA損傷后不易修復(fù)，突變率較高，可能與衰老及某些疾病有關(guān)。遺傳密碼與通用遺傳密碼存在差別，

16、如UGA（終止密碼子）編碼Trp，AGA/AGG（Arg）為終止密碼子等。 基因組學(xué)（Genomics）：對(duì)生命有機(jī)體全基因組進(jìn)行序列分析和功能研究的學(xué)科。 結(jié)構(gòu)基因組學(xué)：目的是在生物體的整體水平上測(cè)定出全部蛋白質(zhì)分子、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與其他生物分子復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)。 基因定位克?。豪梦⑿l(wèi)星和SNP全基因組掃描來搜索與疾病性狀緊密相關(guān)的位點(diǎn)，從而確定疾病相關(guān)基因的位置并進(jìn)一步獲得克隆。 功能基因組學(xué)：根據(jù)已有基因的功能推測(cè)基因組中具有相似結(jié)構(gòu)的基因的功能，通過實(shí)驗(yàn)手段驗(yàn)證。有效的方法有定點(diǎn)突變、基因敲除（knock-out）和RNA干擾及過量表達(dá)技術(shù)等。 第3章 蛋白質(zhì)組學(xué)蛋白質(zhì)是一種復(fù)

17、雜的有機(jī)生物大分子，它們是生命活動(dòng)的實(shí)際執(zhí)行者。幾乎所有的生物催化劑-酶，都是蛋白質(zhì)。構(gòu)成細(xì)胞骨架和動(dòng)物大部分結(jié)構(gòu)的纖維物質(zhì)也是蛋白質(zhì)；膠原蛋白和角蛋白組成了皮膚，毛發(fā)和軟骨；肌肉大部分也是由蛋白質(zhì)組成。蛋白質(zhì)由一個(gè)一個(gè)的氨基酸首尾相接形成肽鏈，肽鏈再折疊形成一定空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)組（proteome）：指由一個(gè)基因組，或一個(gè)細(xì)胞、組織表達(dá)的所有蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）：以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成分、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，在整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成與調(diào)控的活動(dòng)規(guī)律。 功能蛋白質(zhì)組：細(xì)胞在某一階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所

18、有蛋白質(zhì)。差異蛋白質(zhì)組：不同種類或狀態(tài)下各種樣本之間蛋白質(zhì)組的區(qū)別與變化。多樣-蛋白質(zhì)數(shù)目大大超過基因數(shù)目?？勺?蛋白質(zhì)隨時(shí)間與空間變化?；谀z的工作流程是目前使用的較為廣泛的、發(fā)展最為成熟的工作流程。樣品制備：樣品來源：細(xì)胞、組織、體液等?？刹捎萌鞍?；或進(jìn)行預(yù)分級(jí)（線粒體、高爾基體、葉綠體、膜蛋白、核蛋白等）-提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量及檢測(cè)靈敏度。盡可能擴(kuò)大蛋白質(zhì)的溶解度和解聚，以提高分辨率。樣品分離：雙向凝膠電泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE）：利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與分子量差異分離之。2-DE 的缺點(diǎn)：難以有效分離極酸、極堿性蛋白質(zhì)，極大、極小

19、蛋白質(zhì)，及低豐度蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解過程費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難以與質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化聯(lián)用。第一向：等電聚焦 IEF；第二向：SDS-PAGE。染色方法：考馬斯亮藍(lán)染色；銀染（不含戊二醛）；熒光染色（Cy3,Cy5），放射性同位素標(biāo)記等。新型非凝膠技術(shù)：液相色譜法（liquid chromatography, LC）對(duì)在雙向電泳中難以分離鑒定的高分子量、低分子量、極酸性、極堿性和疏水性強(qiáng)的蛋白進(jìn)行有效的分離鑒定。LC-MS/MS：液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)。微量測(cè)序（microsequencing）：N-末端Edman降解：經(jīng)凝膠分離的蛋白質(zhì)直接印跡在PVDF膜或玻璃纖維膜上N末端氨基酸殘基經(jīng)苯異硫氰酸酯修飾從多肽鏈上切下修

20、飾的殘基再經(jīng)層析鑒定余下的多肽鏈被回收再進(jìn)行下一輪降解循環(huán)。 缺點(diǎn)：過程緩慢，消耗大，試劑昂貴。質(zhì)譜分析（Mass spectrometry）：基本原理：樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比（m/z）差異來分離并確定樣品分子量。主要質(zhì)譜類型：MALDI-TOF MS: 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)利用固體基質(zhì)分子均勻包埋樣品分子，在激光照射下，基質(zhì)分子吸收激光能量而蒸發(fā)，攜帶樣品分子進(jìn)入氣相，進(jìn)一步將能量傳遞給樣品分子，從而實(shí)現(xiàn)樣品分

21、子離子化。MALDI 最大的特點(diǎn)是離子電荷通常為1-2個(gè)，而不象ESI中為多電荷離子，對(duì)分子質(zhì)量較大的樣品而言，不會(huì)形成復(fù)雜的多電荷圖譜，因而對(duì)圖譜的解析比較清楚。 ；ESI MS: 電噴霧質(zhì)譜（ electrospray ionisation mass spectrometry ）待測(cè)分子溶解在溶劑中，以液相方式通過毛細(xì)管到達(dá)噴口。在高電壓作用下形成帶電荷的霧滴，隨著霧滴中溶劑的蒸發(fā)，其表面電場(chǎng)隨半徑減少而增加，電荷密度不斷變大，到達(dá)某一臨界點(diǎn)時(shí)，樣品以離子方式蒸發(fā)進(jìn)入氣相，從而實(shí)現(xiàn)離子化。ESI特點(diǎn)：沒有直接的外界能量作用于分子，因此對(duì)分子結(jié)構(gòu)破壞較少，是一種典型的“軟電離”方式?？尚纬啥?/p>

22、電荷離子，因此在較小的m/z范圍內(nèi)可以檢測(cè)到大分子質(zhì)量的分子。采用電噴霧質(zhì)譜目前可測(cè)定分子質(zhì)量100kDa以下的蛋白質(zhì)，最高可達(dá)150kDa。由于采用液相方式進(jìn)樣，可與蛋白質(zhì)化學(xué)中常用的液相色譜聯(lián)用，即液相色譜-電噴霧質(zhì)譜 (LC-ESI MS)。在常規(guī)電噴霧質(zhì)譜中，噴霧的過程易形成較大液滴，液滴中的樣品分子在離子源就不能完全離子化從而降低了樣品的利用率和靈敏度。鑒定與注釋蛋白質(zhì)的路線：通過肽指紋圖譜（peptide mass fingerprint, PMF）和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配通過檢測(cè)樣品中部分肽段的二級(jí)質(zhì)譜信息或氨基酸序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)：目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫(kù)是NRDB和d

23、bEST 數(shù)據(jù)庫(kù)。NRDB 由SWISS-PROT 和GENPETP等幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)組成；dbEST是由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NCBI）和歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)共同編輯，包括大量肽序列標(biāo)簽（PST）。SWISS-PROT()擁有目前世界上最大的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)。PMF或二級(jí)質(zhì)譜匹配檢索常用搜索引擎-MASCOT()抗體芯片：可用于研究在不同生理狀態(tài)或病理狀態(tài)下蛋白水平的量變。優(yōu)點(diǎn)：微型化，集成化，高通量化。如腫瘤標(biāo)志物抗體芯片等。常用熒光標(biāo)記：Cy5和Cy3等。酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）：典型的真核轉(zhuǎn)錄因子都

24、含有二個(gè)結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD）。二個(gè)結(jié)構(gòu)域功能上相互獨(dú)立又互相依賴，只有結(jié)合才具完整活性。酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報(bào)道基因的表達(dá)探測(cè)蛋白蛋白的相互作用。 利用酵母雙雜交技術(shù)篩選新的相互作用蛋白：1）DNA-BD + Bait protein；2）AD + cDNA文庫(kù)的基因。將陽(yáng)性反應(yīng)的酵母菌株中的 AD-LIBRARY載體提取分離出來，從而對(duì)載體中插入的文庫(kù)基因進(jìn)行測(cè)序和分析，研究與已知基因在生物學(xué)功能上的聯(lián)系。第4章 基因工程基因工程（gene engineeri

25、ng）：又稱為重組DNA技術(shù)，是指將外源基因通過體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。分子克隆（molecular cloning）:是指在體外將制備的DNA片段與載體重組，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞中復(fù)制、擴(kuò)增，以獲得該DNA分子的大量拷貝的技術(shù)。第一節(jié) 工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。主要用途：1）在分子克隆過程中切割DNA以獲取目的基因片段、切割載體形成切口，使目的基因能插入載體。2）分析限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP），用于遺傳病的診斷，法醫(yī)DNA指

26、紋分析等。3）用于構(gòu)建DNA的物理圖譜、基因定位及DNA同源性分析等。類酶識(shí)別序列特點(diǎn)回文結(jié)構(gòu)(palindrome)，切口 ：平端切口、粘端切口二、DNA聚合酶 1、DNA聚合酶和Klenow片段 DNA-pol是單一肽鏈的多功能酶，分子量為103kd，它具有3種酶活性：1)53聚合酶活性；2)35核酸外切酶活性；3)53核酸外切酶活性。 Klenow片段的主要功能有：1)補(bǔ)齊雙鏈DNA的3末端，同時(shí)可使3末端DNA標(biāo)記同位素；2)在cDNA克隆中，合成cDNA第二鏈；3)DNA序列分析。 2、Taq DNA聚合酶:一種耐熱的DNA聚合酶，分子量為65 kd，最佳作用溫度是7080，Taq酶

27、具有5?3? 聚合酶活性和依賴于聚合作用的5?3?外切酶活性。Taq DNA聚合酶可用于DNA測(cè)序及通過PCR對(duì)DNA分子的特定序列進(jìn)行體外擴(kuò)增。3、逆轉(zhuǎn)錄酶 依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板、4種dNTP為底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆轉(zhuǎn)錄作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依賴DNA的DNA聚合酶作用。4、末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶 分子量為60 kd，在二價(jià)陽(yáng)離子存在下，催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3末端-OH上。功能主要有：1)在載體或目的基因3末端加上互補(bǔ)的同質(zhì)多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重組連接。2)用于DNA3末端的同位素探針標(biāo)記。1）

28、底物是單鏈DNA或有3?突出末端的雙鏈DNA，需要Mg2+。2）底物是平端或3?凹端的雙鏈DNA，需要Co2+。 三、 DNA連接酶 大腸桿菌DNA連接酶和T4 DNA連接酶兩種類型，分子量分別為7500和6000，兩者的輔基不同，前者需NAD+，后者需ATP。它們催化的反應(yīng)也不盡相同，大腸桿菌DNA連接酶只能連接粘性末端，而T4DNA連接酶既能連接粘性末端，又能連接平末端。 四、 堿性磷酸酶 催化去除DNA、RNA或dNTP上的5?-磷酸基團(tuán)，其主要用途有：1)除去DNA片段上的5?磷酸，以防自身連接。2)在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標(biāo)記前，除去RNA或DNA上5?端的磷酸。五、 核

29、酸酶S1 核酸酶S1可水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交分子中的單鏈部分。其主要作用有：除去粘性末端以產(chǎn)生平末端；除去cDNA合成時(shí)形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)；分析RNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA-RNA分子的雜交情況。功能：水解雙鏈DNA、RNA或DNA-RNA雜交體中的單鏈部分。載體（vector）:指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA。制備的目的基因或外源性DNA片段必須與合適的載體連接形成重組體，才能進(jìn)入受體細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。載體包括克隆載體和表達(dá)載體。常用的載體有：質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、酵母質(zhì)粒和病毒等。載體大都經(jīng)過改造，如質(zhì)粒改造后攜帶某些選擇性標(biāo)記和克

30、隆位點(diǎn)的遺傳信息；噬菌體改造后只保留同一種限制酶的單個(gè)或兩個(gè)切點(diǎn)。在常用的克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件（DNA序列）即為表達(dá)載體，它不僅可攜帶外源基因片段進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且可在宿主細(xì)胞中表達(dá)外源基因。載體應(yīng)具備的特征：能自我復(fù)制并具較高的拷貝數(shù)。分子量一般10Kb。帶有遺傳篩選標(biāo)記。有適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c(diǎn)，便于外源基因的插入和篩選。載體上具有多個(gè)限制酶的單一位點(diǎn)（即在載體其他部位無這些酶的相同位點(diǎn)）稱為多克隆位點(diǎn)。一、克隆載體 能將載體外源基因在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增并產(chǎn)生足夠量目的基因的載體稱為克隆載體。（一）質(zhì)粒載體 質(zhì)粒（plasmid）是指細(xì)菌染色體以外的小分子環(huán)狀雙鏈DNA，能自

31、我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。主要用途：用于保存和擴(kuò)增2Kb目的DNA。構(gòu)建cDNA文庫(kù)。目的DNA的測(cè)序。作為核酸雜交時(shí)的探針來源。pBR322質(zhì)粒是由一系列大腸桿菌質(zhì)粒DNA通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的雙鏈克隆載體，長(zhǎng)為。它含有一個(gè)能保證高拷貝自我復(fù)制的復(fù)制起始點(diǎn)（Ori），并裝有四環(huán)素抗性（Tetr）基因和氨芐青霉素抗性（Ampr）基因供菌落篩選。在這兩個(gè)抗性基因中分別含有BamHI和PstI等限制酶的單一酶切位點(diǎn)，用于插入外源DNA片段。如有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致這些標(biāo)志性基因的失活。pUC系列載體是由pBR322質(zhì)粒和M13噬菌體重組構(gòu)建而成的雙鏈DNA質(zhì)粒載體。pUC18和pUC1

32、9質(zhì)粒長(zhǎng)約，除多克隆位點(diǎn)互為相反方向排列外，其它序列均相同。PUC質(zhì)粒系列還包括pUC8、pUC9和pUC118、pUC119，它們的區(qū)別在于MCS的限制酶識(shí)別位點(diǎn)數(shù)目不同，而每一對(duì)pUC質(zhì)粒的MCS中限制酶識(shí)別位點(diǎn)數(shù)目相同、順序相反。pUC質(zhì)粒含Ampr，可供菌落篩選。載體中裝入一個(gè)來自大腸桿菌乳糖操縱子的DNA片段（lacZ基因），該基因編碼-半乳糖苷酶氨基端的一個(gè)片段，IPTG可誘導(dǎo)此片段合成，而此片段能與宿主細(xì)胞所編碼的缺陷型-半乳糖苷酶實(shí)現(xiàn)基因內(nèi)互補(bǔ)（-互補(bǔ)），形成完整的-半乳糖苷酶。-半乳糖苷酶能催化指示劑底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）形成藍(lán)色菌落。pUC

33、載體的lacZ基因中含有MCS，當(dāng)外源基因插入MCS，lac-肽基因閱讀框架被破壞，細(xì)菌內(nèi)將無-半乳糖苷酶活性，菌落呈白色（即半乳糖苷酶的藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)）。（二）噬菌體載體 噬菌體（bacteriophage，phage）：指感染細(xì)菌的病毒。按其生活周期分為兩種類型：溶菌性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，連續(xù)增殖，直到細(xì)菌裂解，釋放的噬菌體又可感染其它細(xì)菌。溶原性噬菌體：指噬菌體感染細(xì)胞后，可將自身的DNA整合到細(xì)菌的染色體中去，和細(xì)菌染色體一起復(fù)制。噬菌體 野生型的噬菌體是線性雙鏈DNA，全長(zhǎng)，其中60%（約30Kb）是溶菌生長(zhǎng)所必需，中間40%的區(qū)域?yàn)榉潜匦?，可被外源DNA片段代替而不影響噬菌

34、體的生存。噬菌體5末端含12核苷酸的互補(bǔ)單鏈順序，是天然的粘性末端，稱為cos位點(diǎn)，噬菌體感染宿主菌后，其粘端通過堿基配對(duì)而結(jié)合，形成環(huán)狀DNA分子。重組噬菌體的分子量必須在野生型噬菌體的75%105%之間。重組噬菌體篩選標(biāo)記：外源基因插入型：藍(lán)白斑(LacZ)篩選外源基因置換型：噬菌斑數(shù)目（red和gam基因，轉(zhuǎn)染率高1001000倍）。用途：用作一般的克隆載體。用于構(gòu)建基因組或cDNA文庫(kù)（22Kb）。用于抗體庫(kù)或隨機(jī)肽庫(kù)的構(gòu)建。核酸的序列分析。M13噬菌體 含一約的單鏈（正鏈）閉環(huán)DNA分子。M13噬菌體在細(xì)菌內(nèi)呈溶源狀態(tài)生長(zhǎng)，成熟的子代噬菌體中只有一條含外源DNA的鏈（負(fù)鏈）。改造過的

35、M13噬菌體引入了帶有大腸桿菌LacZ的調(diào)控序列和N端部分氨基酸的編碼信息以及多克隆位點(diǎn)序列，因此也可用藍(lán)白斑篩選重組體。M13噬菌體載體主要用于目的DNA的測(cè)序和單鏈放射性探針的制備，克隆的外源DNA一般1Kb。 M13噬菌體特點(diǎn)：野生型M13噬菌體為左右的閉環(huán)正鏈DNA分子?？寺〉耐庠椿蚱?kb。M13噬菌體能以單鏈和雙鏈兩種方式存在，可用于感染(經(jīng)包裝的單鏈DNA)和轉(zhuǎn)化(雙鏈DNA)。M13中引入的多克隆位點(diǎn)，正好插入LacZ基因內(nèi)，可利用藍(lán)白色噬菌斑篩選重組體。M13噬菌體只降低宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，而不溶解宿主細(xì)胞（呈溶源狀態(tài)生長(zhǎng)，故可從細(xì)菌培養(yǎng)液中獲得噬菌體，制備單鏈DNA）。

36、（三）粘性質(zhì)粒(cosmid) 組成：質(zhì)粒復(fù)制的起始位點(diǎn)(ORI)。攜帶抗藥基因。用于插入目的基因的單一酶切位點(diǎn)。噬菌體的cos位點(diǎn)。特點(diǎn)：粘粒（粘性質(zhì)粒）載體大小為46Kb，而插入外源基因長(zhǎng)達(dá)4050kb。加入噬菌體頭部和尾部蛋白，可將粘粒包裝成類似于?噬菌體的具感染能力的顆粒，容易進(jìn)入大腸桿菌。粘粒進(jìn)入細(xì)菌后則完全失去噬菌體的功能，而表現(xiàn)質(zhì)粒的特性。用途：克隆大片段DNA；構(gòu)建基因組文庫(kù)。（四）酵母細(xì)胞中克隆基因常用載體 酵母人工染色體（yeast artificial chromosome，YAC）是利用酵母染色體DNA和大腸桿菌pBR322改造而成，可以插入長(zhǎng)達(dá)1000Kb的外源DNA

37、片斷。根據(jù)其復(fù)制方式不同分為三型：整合型（YIP）、復(fù)制型（YRP）和附加體型（YEP）載體，YRP中插入酵母著絲粒區(qū)，構(gòu)成酵母著絲粒質(zhì)粒（YCP）載體。三類載體的共同特點(diǎn):能在大腸桿菌中復(fù)制，并具有較高的拷貝數(shù)；含有在酵母細(xì)胞中便于選擇的遺傳標(biāo)記；含有合適的限制酶切位點(diǎn)，以便插入外源基因。YIP和YCP載體能穩(wěn)定遺傳但都是單拷貝、轉(zhuǎn)化率低，多用于遺傳分析；而YRP和YEP載體對(duì)酵母具有很高的轉(zhuǎn)化活性、拷貝數(shù)較高但穩(wěn)定性差，后者較前者穩(wěn)定，是基因克隆中常用的載體。 （五）動(dòng)物細(xì)胞基因克隆的載體 已構(gòu)建并經(jīng)常使用的動(dòng)物病毒克隆載體有：猿猴空泡病毒40（simian vacuolating vir

38、us 40，SV40）載體；腺病毒（adenovirus）載體；逆轉(zhuǎn)錄病毒（retrovirus）載體。二、表達(dá)載體 表達(dá)載體是指能將外源基因在受體細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄和正確翻譯的載體。外源目的基因在新宿主細(xì)胞中是否克隆成功，是通過鑒定克隆是否表達(dá)的方法來證實(shí)，即產(chǎn)生克隆基因所編碼的蛋白質(zhì)，其每個(gè)環(huán)節(jié)都至關(guān)重要。真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)需要有效轉(zhuǎn)錄及一系列調(diào)控元件，必須保證外源基因插入方向的正確性；受原核啟動(dòng)子的控制；必須能在大腸桿菌中有效轉(zhuǎn)錄和有效翻譯。基因表達(dá)、合成有功能的蛋白質(zhì)依賴于基因的有效轉(zhuǎn)錄、mRNA正確的翻譯和翻譯后加工。為了判斷某一待測(cè)DNA序列的生物活性，常采用報(bào)告基因（repor

39、ter gene）方法。報(bào)告基因（reporter gene）：是指處于待測(cè)基因下游并通過轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平來反映上游待測(cè)基因功能的基因，又稱報(bào)道基因。（一）原核細(xì)胞表達(dá)載體 原核細(xì)胞的表達(dá)載體主要是大腸桿菌表達(dá)載體。外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)需要重要調(diào)控元件。大腸桿菌表達(dá)載體是在克隆載體的基礎(chǔ)上導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控元件：?jiǎn)?dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)克隆位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。1.啟動(dòng)子（promoter）：如乳糖啟動(dòng)子（Lac）、色氨酸啟動(dòng)子（Trp）、Tac啟動(dòng)子（Trp-Lac）以及PL和PR啟動(dòng)子等。序列 終止子（terminator）：一個(gè)基因的3末端有一特定的DNA序列，它具有被RNA聚合酶識(shí)別并停止轉(zhuǎn)錄

40、的功能。該序列含有一段富含A/T和富含G/C的回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)狀局部二級(jí)結(jié)構(gòu)。1）非融合型表達(dá)載體pKK223-3。2）分泌型克隆表達(dá)載體PINlll系統(tǒng)。3）融合型表達(dá)載體pGEX系統(tǒng)（二）哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體真核表達(dá)載體的真核表達(dá)元件有：?jiǎn)?dòng)子/增強(qiáng)子克隆位點(diǎn)終止位點(diǎn)和加polyA信號(hào)。1原核DNA序列：包括能在大腸桿菌中自身復(fù)制的復(fù)制子和抗藥基因的篩選標(biāo)記。2啟動(dòng)子：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2530bp有富含AT的TATA框，TATA框的上游約100200bp處為上游啟動(dòng)子元件。3增強(qiáng)子（enhancer）：是一類顯著提高基因轉(zhuǎn)錄效率的順式作用元件。4終止子和加po

41、lyA信號(hào)。三、穿梭載體 既能在原核細(xì)胞中復(fù)制、又能在真核細(xì)胞中復(fù)制，在原核和真核細(xì)胞分子克隆中均能應(yīng)用的載體稱為穿梭載體（shuttle vector）。（一）穿梭粘粒載體：穿梭粘粒載體能攜帶真核DNA片段在細(xì)菌內(nèi)擴(kuò)增，并通過轉(zhuǎn)染進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。這類載體常用于研究目的基因表達(dá)調(diào)控的組織細(xì)胞特性以及它所編碼蛋白質(zhì)的功能，也可從粘粒基因組文庫(kù)中篩選出特殊功能基因。（二）酵母穿梭質(zhì)粒載體：酵母復(fù)制型載體是穿梭質(zhì)粒載體，它由酵母DNA片段插入到大腸桿菌質(zhì)粒中構(gòu)建而成，除有細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制子和抗藥性標(biāo)記外，還有酵母DNA片段提供的選擇標(biāo)記，同時(shí)又?jǐn)y帶了自主復(fù)制順序，由于該載體同時(shí)含有大腸桿

42、菌和酵母的自主復(fù)制基因，故能在兩種細(xì)胞中存在和復(fù)制。另外，由噬菌體、質(zhì)粒與SV40病毒DNA元件也可構(gòu)建成穿梭載體，Pac10重組病毒-質(zhì)粒載體也是穿梭載體。 分子克隆的基本步驟 一、 目的基因的獲取 （一）從基因文庫(kù)中獲取 目的基因：指被研究的某一基因或DNA序列，即需要克隆或表達(dá)的基因。基因組文庫(kù)（genomic library，G-文庫(kù)）是指含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群。構(gòu)建基因組文庫(kù)時(shí)，先將原核或真核細(xì)胞染色體DNA提純，通過機(jī)械或酶切使之成為一定大小的片段，將其與適當(dāng)?shù)妮d體相連接，經(jīng)體外包裝、轉(zhuǎn)染細(xì)菌，得到一組含不同DNA片段的重組噬菌體顆粒。這個(gè)文庫(kù)中含有基因組內(nèi)

43、全部基因片段，是一個(gè)貯存基因組全部序列的信息庫(kù)，故稱為G-文庫(kù)。轉(zhuǎn)染（transfection）是指以噬菌體、病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過程。如以細(xì)胞全部mRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄，制備出全套cDNA建庫(kù)，則稱為C-文庫(kù)。（二）逆轉(zhuǎn)錄法 是應(yīng)用得最多的獲取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。選用富含目的基因mRNA的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，有利于分離到目的基因。如胰島素基因的mRNA主要存在于胰腺組織，血紅蛋白基因的mRNA占網(wǎng)質(zhì)紅細(xì)胞總mRNA的50%90%。用此法得到的目的基因進(jìn)行克隆可獲得較完整的連續(xù)編碼順序，易在宿主細(xì)胞中表達(dá)及篩選。 （三）人工合成DNA片段 根據(jù)已

44、知某種基因的核苷酸序列或某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列，可推導(dǎo)出為該多肽編碼的核苷酸短序列，再用DNA合成儀人工合成目的基因。此法適用于合成分子量較小的目的基因（100bp以內(nèi)），如：人生長(zhǎng)激素釋放因子、血管加壓素、干擾素、胸腺素及胰島素原的基因等。（四）直接從染色體DNA中分離目基因 根據(jù)染色體DNA的限制性內(nèi)切酶圖譜，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割染色體DNA、分離目的基因。本方法較適用于制備原核生物目的基因，其原因?yàn)椋海?）真核細(xì)胞染色體DNA有豐富的內(nèi)含子，它們?cè)谠思?xì)胞中轉(zhuǎn)錄后不能被剪接。（2）真核細(xì)胞的基因多數(shù)為單拷貝，難以分離到足夠量的目的基因。 二、 載體的選擇 噬菌體和粘性質(zhì)粒載體常用來

45、構(gòu)建基因組文庫(kù)；構(gòu)建cDNA文庫(kù)和克隆較小DNA片段常用pUC系列等質(zhì)粒；M13噬菌體則用于克隆一些待測(cè)的DNA序列。三、 目的基因和載體酶切與連接四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞稱謂感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)。以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程稱為轉(zhuǎn)化（transformation）。五、重組體的篩選和鑒定（一）遺傳標(biāo)記表型特征篩選 1.抗生素抗性標(biāo)記篩選 因大多數(shù)質(zhì)粒載體帶有抗生素抗性標(biāo)記的特征（如Ampr、Tetr等），當(dāng)帶有完整抗性基因的載體轉(zhuǎn)化無抗性細(xì)菌后，被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性菌獲得抗生素抗性基因而存活并形成

46、噬菌斑，未轉(zhuǎn)化菌不能存活，但應(yīng)排除未重組的空載體。某些質(zhì)粒載體如pBR322質(zhì)粒中裝有Ampr和Tetr抗性基因，在含四環(huán)素和氨芐青霉素的平皿上都能夠生長(zhǎng)的細(xì)菌只含有空載體，此篩選方法稱為雙抗生素對(duì)照篩選。2.-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍(lán)白斑篩選）3.營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記選擇: 當(dāng)細(xì)胞生物合成途徑中某個(gè)酶的編碼基因失活后，該細(xì)胞成為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，如導(dǎo)入細(xì)胞的重組DNA能彌補(bǔ)缺陷的基因，那么，培養(yǎng)基中就不需補(bǔ)充有關(guān)的營(yíng)養(yǎng)成分，由此可挑選出含重組DNA的陽(yáng)性細(xì)菌。 （二）重組子結(jié)構(gòu)特征的篩選1重組子大小鑒別篩選:從挑選的菌落中分別提取重組載體DNA和原載體DNA，用一種限制酶切消化后直接進(jìn)行電泳，重組載體DNA

47、因分子量較大而遷移率較小。2酶切鑒定:根據(jù)已知外源基因兩端的酶切位點(diǎn)，分別用相應(yīng)的兩種內(nèi)切酶進(jìn)行切割，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，可根據(jù)DNA mark來分析插入DNA片段的分子量。3PCR篩選法。4核酸雜交技術(shù)篩選：將DNA的克隆片段或轉(zhuǎn)化細(xì)菌平板轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜上，應(yīng)用特異性的核酸探針對(duì)其進(jìn)行原位雜交，可篩選出陽(yáng)性克隆。另外，還可通過斑點(diǎn)雜交和Southern blot雜交技術(shù)篩選 。在分子生物學(xué)領(lǐng)域，利用基因工程技術(shù)，大腸桿菌體內(nèi)的基因50%以上已被定位，其DNA序列已被測(cè)出，基因表達(dá)調(diào)控關(guān)系也基本搞清。在真核生物中，利用基因工程的理論和技術(shù)已發(fā)現(xiàn)上百種癌基因和209余種抗癌基因，它們分別是

48、細(xì)胞增殖調(diào)控的正負(fù)信號(hào)。在發(fā)育生物學(xué)中精細(xì)胞的分化及受精過程所發(fā)生的變化，基因表達(dá)的發(fā)育調(diào)控的研究與基因工程技術(shù)的應(yīng)用是密不可分的 基因工程的理論和技術(shù)對(duì)人類基因組計(jì)劃的實(shí)現(xiàn)具有重大作用，將對(duì)人類基因組作圖和測(cè)序，對(duì)于了解人類的全部基因構(gòu)成，提供可資查的一個(gè)完美的基因信息庫(kù)，也為認(rèn)識(shí)人類遺傳疾病和癌發(fā)病機(jī)理提供有價(jià)值的信息。 動(dòng)植物基因工程 1.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與蛋白制藥的生產(chǎn) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可以用來代替發(fā)酵罐生產(chǎn)一些珍貴的蛋白質(zhì)。它的原理是使外來基因在動(dòng)物乳腺中表達(dá)，從乳液中提取所要的蛋白質(zhì)。英國(guó)的藥用蛋白公司用這種方法將轉(zhuǎn)基因綿羊來試行生產(chǎn)人類抗胰蛋白酶因子，在每升羊奶中可取得35克這種蛋白質(zhì)。 2

49、.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與動(dòng)物改良。 3.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與人類疾病治療 。 4.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物與基礎(chǔ)生物學(xué)研究。5.轉(zhuǎn)基因植物微生物基因工程和發(fā)酵工業(yè) 我國(guó)已有人干擾素、人白介素2、人集落刺激因子、重組人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹瀉疫苗等多種基因工程藥物和疫苗進(jìn)入生產(chǎn)或臨床試用。世界上還有幾百種基因工程藥物及其它基因工程產(chǎn)品在研制中，成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)發(fā)展的重要方向，將對(duì)醫(yī)學(xué)和工農(nóng)業(yè)發(fā)展作出新貢獻(xiàn)。第5章 基因診斷基因在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用 1、基因診斷目前應(yīng)用最多的是：癥狀前診斷（疾病易感性）。產(chǎn)前診斷（羊水、臍帶血、絨毛膜）遺傳性疾病。著床（植入）前診斷。臨床診斷（國(guó)外已用于乳腺癌、結(jié)腸癌等）。意義：優(yōu)生優(yōu)育；確

50、定與疾病有關(guān)狀態(tài)（如易感性、抗藥性、發(fā)病類型及階段）；傳染病早期（產(chǎn)生抗體前）診斷及病毒攜帶者的檢出；分析基因型，使器官移植配型精確；法醫(yī)DNA鑒定。胚胎移植前遺傳病診斷 preimplantationgenetic diagnosis, PGD 是在體外受精（in-vitro fertilization, IVF）技術(shù)、分子生物學(xué)和顯微操作的基礎(chǔ)上，對(duì)受精三天后的胚胎在種植前，檢查其正常后再移植到子宮的一項(xiàng)新技術(shù)，也即所謂第三代試管嬰兒技術(shù)。一般在卵裂期，當(dāng)胚胎發(fā)育到6-8個(gè)細(xì)胞階段，抽取1-2個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行遺傳疾病診斷。根據(jù)遺傳診斷結(jié)果，僅將正常胚胎移植至子宮?；蚝铜h(huán)境共同決定生物的性狀。

51、基因是內(nèi)因；環(huán)境是外因。環(huán)境（外因)的干擾必須通過基因(內(nèi)因)的作用來影響生物的性狀(如人的健康狀況)疾病與遺傳基因及環(huán)境之間的關(guān)系 任何疾病（外傷除外）都是遺傳與環(huán)境兩者相互作用所致。只是在不同的疾病中，兩者所起的作用不同。遺傳性疾病都與基因有關(guān)。心血管疾病、糖尿病、腫瘤都與多個(gè)基因缺陷有關(guān)。傳染性疾病主要是外部環(huán)境作用所致，如肝炎。雖然沒有肝炎病毒的感染不會(huì)得病，但是同樣得感染，不同的人表現(xiàn)不一樣而且感染得了肝炎，治療后的結(jié)果也大不相同。這些差別中的遺傳因素不容忽視。因而，不能說傳染病與遺傳無關(guān)?；虿》诸?單基因病：孟德爾遺傳性疾病，諸如：白化病、早老癥、血紅蛋白病、甲型血友病、囊性纖維

52、化病、脆性X綜合征等。多基因病或多因子復(fù)雜性狀疾?。耗[瘤、心腦血管疾病、代謝病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等。獲得性基因?。焊腥拘圆≡w，諸如：HBV、HCV、HIV、HPV等。分子（基因）診斷的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段：以DNA分子雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的診斷方法開展遺傳病的基因診斷；以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的診斷方法開展獲得性基因?。ú≡⑸铮┑幕蛟\斷；以生物芯片（biochip）技術(shù)為代表的高通量密集型技術(shù)的診斷方法開展多基因多因素疾病的基因（分子）診斷。從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達(dá)產(chǎn)物（mRNA、蛋白質(zhì)）的全面診斷與過程診斷。生物芯片（biochip）技術(shù)，將大量基因探針基因片段蛋白多肽按特

53、定的排列方式固定在玻片（硅片、塑料片）上，實(shí)現(xiàn)了高通量篩查。系統(tǒng)生物學(xué)（systems biology），推動(dòng)分子診斷的快速發(fā)展以系統(tǒng)論的觀點(diǎn)、動(dòng)態(tài)的觀點(diǎn)、多樣性的觀點(diǎn)和進(jìn)化的觀點(diǎn)來分析結(jié)果重點(diǎn)，不是在個(gè)別核酸或蛋白質(zhì)分子的序列及其功能。乳腺癌和卵巢癌是具有家族遺傳傾向的，約15-20%有家族史。與乳腺癌與卵巢癌遺傳密切相關(guān)是BRCA1和BRCA2基因。BRCA1和BRCA2基因的功能是控制細(xì)胞增生，當(dāng)它們中任一基因發(fā)生突變將大大增加個(gè)體患乳腺癌和卵巢癌的機(jī)率，并導(dǎo)致個(gè)體的發(fā)病年齡明顯提前。分子診斷的臨床意義：不僅能夠?qū)膊∽鞒鲈缙谠\斷、確切診斷；而且還能確定個(gè)體歸于疾病的易感性以及疾病的分期

54、分型、療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷等。 感染性疾病的分子診斷： 獲得性基因病的分子診斷：流感病毒與各種流感；乙肝病毒DNA的檢測(cè)；乙肝病毒YMDD突變檢測(cè)；AIDS患者HIV的檢測(cè)；SARS與SARS冠狀病毒流感病毒屬于有包膜的單鏈RNA病毒，易于變異。甲型和乙型流感病毒的基因組由8個(gè)單獨(dú)的單鏈RNA片段組成。丙型流感病毒的基因則由7個(gè)RNA片段組成，每個(gè)RNA片段編碼12個(gè)多肽。病毒變異及機(jī)制：點(diǎn)突變（antigen drift，抗原性漂移）RNA病毒的RNA聚合酶缺乏校正機(jī)制，其核酸復(fù)制的錯(cuò)誤頻率高達(dá)萬(wàn)分之一?；蚪粨Q（genetic shift，抗原性轉(zhuǎn)換）病毒基因組由8個(gè)負(fù)向RNA基因片段組成，

55、復(fù)制過程中易發(fā)生基因重配。1.分子診斷方法 可采用RT-PCR、FQ-PCR檢測(cè)流感病毒RNA所用引物常按流感病毒保守的非結(jié)構(gòu)基因NS基因序列設(shè)計(jì)。2.臨床意義 （1）流感病毒的診斷過去主要靠雞胚羊膜腔培養(yǎng)和血清學(xué)血凝抑制試驗(yàn)，這些方法比較費(fèi)時(shí)，靈敏度低，且難以作出早期診斷（2）PCR法敏感、特異、簡(jiǎn)便、快速，適合于流感病毒的臨床檢測(cè)、分型和流行病學(xué)調(diào)查。HBV DNA檢測(cè)的臨床意義 1.診斷方面：1）HBV_DNA是HBV存在最直接的依據(jù)；2）是HBV復(fù)制的標(biāo)志；3）是患者具有傳染性的標(biāo)志。2.療效判斷：HBV_DNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo)。3）預(yù)后判斷：HBV_DNA水平

56、與病情有一定的關(guān)系。乙肝病毒YMDD突變檢測(cè) 拉米夫定(Lamivudine)：硫代脫氧胞嘧啶（2-deoxy-3-thiacytidine，3TC）；核苷類似物；口服抗病毒藥物。作用：降低HBVDNA的濃度；改善肝臟組織的病變；可能阻斷肝纖維化的進(jìn)程，終止肝硬化的發(fā)展。不受人種、病毒感染的模式、野生型或基因組前C區(qū)突變的影響；口服，副作用小。YMDD突變檢測(cè)常見方法 1.基因測(cè)序法(最好的)2.熒光定量PCR方法。 熒光定量PCR檢測(cè)YMDD 基本原理：確定探針特定的TM值來區(qū)分是否突變。常用方法：覆蓋突變位點(diǎn)熒光雙探針雜交的方法檢測(cè)YMDD。TM值：在核酸加熱變性過程中，當(dāng)雙鏈DNA解鏈到

57、一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的溫度就是該核酸的TM值，也叫核酸的熔點(diǎn)。每種不同的核酸有不同的TM值。影響TM值的主要因素：1.堿基中GC含量，含量越高，TM越大。2.核酸的長(zhǎng)度，核酸越長(zhǎng)，TM越大。3.完全配對(duì)比不完全配對(duì)時(shí)TM值要大。HBV在體內(nèi)的復(fù)制過程是一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄過程?？共《緳C(jī)制；競(jìng)爭(zhēng)性阻斷逆轉(zhuǎn)錄酶（依賴RNA的DNA多聚酶）活性，有效地抑制HBV的復(fù)制；進(jìn)入細(xì)胞的拉米夫定在激酶的作用下可被磷酸化為三磷酸脫氧胞苷，可以與dCTP競(jìng)爭(zhēng)性摻入延伸的DNA，因它缺乏3羥基而使復(fù)制的病毒DNA鏈終止。HIV基因組結(jié)構(gòu) 基因結(jié)構(gòu)組為RNA雙分子，與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒基本相同。5端有帽子結(jié)構(gòu)，3端有poly(A)結(jié)構(gòu)。

58、逆轉(zhuǎn)錄病毒共同的結(jié)構(gòu)基因和側(cè)翼末端重復(fù)順序（long terminal repeats，LTRs）等。LTRs不編碼任何蛋白，可起始其他病毒基因的表達(dá)，無種屬特異性，LTR含調(diào)控病毒基因表達(dá)的DNA序列，分別位于HIV基因組的兩端。參與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因。調(diào)控病毒的感染性，成熟或釋放的基因。HIV分子診斷1.分子診斷方法（1）PCR：盡管HIV是RNA病毒，但其感染細(xì)胞后會(huì)自我反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并整合到宿主細(xì)胞基因組中復(fù)制，故可用感染細(xì)胞的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而進(jìn)行診斷。PCR擴(kuò)增時(shí)需選擇病毒基因組中的高度保守序列作為引物，如gag、LTR、tat、env和pol區(qū)段中的保守區(qū)。PCR法：特別適用于無癥狀HIV感染者。（2）病毒載量檢測(cè)：對(duì)感染者體內(nèi)HIV RNA