E-鈣粘素在結直腸癌中的表達及其與淋巴結微轉移的關系(一).doc

1、E-鈣粘素在結直腸癌中的表達及其與淋巴結微轉移的關系(一)作者 :張翼飛姜立新鄭海濤【摘要】目的檢測結直腸癌組織中E-鈣粘素的表達及其淋巴結微轉移,探討兩者間的關系。方法以CK20mRNA為標記物 ,應用 RT-PCR對 60 例結直腸癌根治性手術切除的淋巴結標本共782 例進行檢測 ;免疫組化法(SP 法)檢測結直腸癌組織、癌旁組織、淋巴結微轉移及正常對照組中E-鈣粘素的表達。通過二者的綜合分析,試圖發(fā)現(xiàn)抑癌基因E-鈣粘素在結直腸癌淋巴結微轉移的生物學行為中的作用。結果CK20 法檢出 45例(75.0%)患者有淋巴結轉移 ,陽性淋巴結總數(shù)為 436 個(55.8%);常規(guī)病理學檢出 34

2、例(56.7%)患者有淋巴結轉移 ,檢出陽性淋巴結數(shù)為 356 個(45.5%);兩組比較 ,差異具有統(tǒng)計學意義 ( 2=16.72,P0.05)。11 例檢出淋巴結微轉移患者癌組織中6 例(54.5%)E-Cadherin表達陰性 ,而 15 例未檢出淋巴結微轉移癌組織中僅有1 例(6.67%)表達陰性 ,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義 ( 2=4.160,P=0.041)。結論 E-Cadherin的表達減弱或消失參與了結直腸癌淋巴結微轉移的發(fā)生?！娟P鍵詞】結直腸癌 ;E-鈣粘素 ;淋巴結轉移 ;逆轉錄聚合酶鏈反應【Abstract】ObjectivePurposeTodetecttheexpr

3、essionofE-cadherinincolorectalcarcinomaandlymphnodemicrometastases,andinvestigatetheirrelationship.Methods82casesoflymphnodesimplewasdectectedwithRT-PCRmethodusingCK20mRNAacridiniumester.inscreeningcolorectalcarcinomalymphnodemicrometastases.E-Cadherinexpressionanalysedbyimmuno-histochemicalstaining

4、(theSPmethod)incolorectalcancertissue,tissuenearbycancer,thenormalcontroltissue.ResultsIn60casesofcolorectalcarcinoma,theexpressionofE-Cadherinwas71.67%.Numberofpositivenodeswas55.8%,theexpressionofE-cadherinwas56.7%(34cases)andnumberofpositivenodeswas45.5%(356cases)throughroutinepathologicalexamina

5、tion.ThelowlevelexpressionofE-CadherinwaspositivelycorrelatedwiththeDukesstaging,serosainfiltration,lymphnodeandlivermetastasisofcolorectalcarcinoma( 2=16.72,P0.05).TheexpressionofE-Cadherinwasnegativein6ofthe11patientswithlymphnodemicrometastases,andin6.67%1ofthe15patientswithoutlymph nodemicrometa

6、stases( 2=4.160,P=0.041).ConclusionThenegativeexpressionofE-Cadherinmaycontributetolymphnodemicrometastasesincolorectalcarcinoma.【Keywords】colorectalcarcinoma;E-Cadherin;Lymphaticmetastasis;Rt-pcr結直腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一。每年有10%的惡性腫瘤患者死于結直腸癌 1,2。術后復發(fā)和轉移是影響結直腸癌預后的最主要因素之一。在實施了根治性手術的結直腸癌患者中,仍有 20%50%的患者死于術后腫瘤的

7、局部復發(fā)和轉移3,4,有研究認為該現(xiàn)象與結直腸癌淋巴結微轉移有關。 E-Cadherin粘附分子介導細胞粘附的紊亂涉及腫瘤的發(fā)展和轉移。E-Cadherin表達或功能的喪失與癌細胞喪失分化和較高的侵襲能力有關。本研究通過免疫組化方法檢測E-Cadherin 粘附分子在結直腸癌和轉移灶的表達 ,以 CK20為靶目標 ,應用 RT-PCR法檢測結直腸癌淋巴結的微小轉移 ,以探討結直腸癌浸潤轉移相關基因的表達與臨床分期、浸潤轉移的關系。探討結直腸癌組織中E-Cadherin 的表達及其與淋巴結微轉移的關系,試圖對結直腸癌轉移做出預測和早期診斷,為臨床治療提供依據(jù)和手段。1 實驗材料及方法1.1 實驗

8、材料1.1.1 病例與標本收集我院20052007 年散發(fā)性結直腸癌根治術后標本60 例,其中男 32 例,女 28 例;年齡 2879,平均 58.4 歲。所有患者術前均未行放、化療 ;剔除遺傳性非息肉病性散發(fā)性結直腸癌和家族性腺瘤性息肉病。分化程度 :高分化 23 例,中分化 21 例,低分化 16 例;淋巴結轉移 34 例,無淋巴結轉移 26 例;TNM 分期 I 期 6 例,II 期 26 例,III 期 22 例,IV期 6 例。術中采集散發(fā)性結直腸癌患者腫瘤周圍腫大淋巴結共782 個,剖開 ,一半行常規(guī)術后病理 ,另一半保存于 -80冰箱備用。選擇遠癌“正常”大腸黏膜組織 (距癌灶

9、 4cm)和癌旁 (距癌灶 2cm)大腸黏膜組織各10例作為對照觀察。所有標本經(jīng)10%福爾馬林液固定 ,常規(guī)石蠟包埋。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者本人均簽署知情同意書。1.1.2 試劑鼠抗人 E-Cadherin單克隆抗體和 S-P試劑盒 (Zymed 公司 )。 TRIzolReagent(Invitrogen 公司 ),TAKARAAMV逆轉錄試劑盒 (Takara 公司 ),TAKARALATaq(Takara公司 ),PCR 試劑 (Takara 公司 ),DNA 分子量Marker(晶美公司 )。1.2 方法1.2.1 總 RNA 的抽提采用標準 TRIzol法(參照說明書

10、 )提取術后淋巴結標本的總 RNA,凝膠電泳和分光光度計檢測 RNA濃度和純度。1.2.2cDNA制備總RNA樣品1 l, 依次加入mmol/LdNTP1 l,RNaseInhibitor0.25 l,AMVReverseTranscriptase0?？?5l反應混合物于30反應10min,42反應30min,99反應5min,5反應5min。1.2.3 引物的合成在 NCBI數(shù)據(jù)庫中查找編碼人類基因 CK20的核酸序列 , 其 登 錄 號 為 NM_019010, 該 序 列 長 1817bp, 編 碼 序 列CDS(CodingSequence)位于 43-1317bp 間。以此序列為基礎

11、 ,在 CDS區(qū)內設 計引 物 。 上游 引物 5-ACCTAAATGACCGTCTAGCGAGC3下游- 引物5-CACATTGACAGTGTTGCCCAGAT3擴增-片段為 449bp 大小 ,引物由上海英俊公司合成。1.2.4PCR反應和分析采用RT-PCR方法 ,以人結直腸癌淋巴結cDNA 為模版 . 反 應 體 系 為 50l:cDNA 模 版 1l,10 LAPCR緩 沖 液5 l,25mmol/LMgCl25 l,20pmol/ 上l游 和 下 游引 物 各1 l,10mmol/LdNTPMixture2 l,LATag酶0.5 補l,去離子水至50l。PCR反應條件 :94 預

12、變性 3min;94 變性 30s,58.5 退火30s,72 延伸1min,30 個循環(huán) ;72再延伸 5min。反應完畢后進行電泳分析。1.2.5 結直腸癌組織切片厚4 m,0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復,S-P免疫組化染色。染色步驟按說明書進行 ,DAB 顯色 ,蘇木精復染胞核。 PBS代替第 1 抗體作陰性對照。1.3 統(tǒng)計學方法資料的統(tǒng)計分析在SPSS13.0軟件包中進行 ,數(shù)值變量以均數(shù) (95%可信區(qū)間 )表示 ,計數(shù)資料用率來表示 ,兩組間率的比較采用2檢驗法。并采用診斷性實驗分析方法計算CK20與傳統(tǒng)病理切片技術診斷結直腸癌淋巴結轉移的準確度、敏感度和特異度。實

13、驗結果 :圖 AE-Cadherin在正常大腸黏膜上皮細胞中的表達 40 圖 BE-Cadherin在結直腸癌組織中的表達 402 結果2.160 例散發(fā)性結直腸癌患者的782 個受檢淋巴結經(jīng)常規(guī)病理學檢查,34 例(56.7%)患者有淋巴結轉移 ,陽性淋巴結總數(shù)為 356 個(45.5%)。而采用 RT-PCR法檢測 CK20mRNA的表達情況來判斷淋巴結轉移,結果顯示,45 例(75.0%)患者有淋巴結轉移 ,較病理學檢查結果新增 11 例,差異具有統(tǒng)計學意義 ( 2=4.483,P=0.034)。陽性淋巴結總數(shù)為 436 個(55.8%),較病理學檢查結果新增 80 個,差異具有統(tǒng)計學意義 ( 2=16.371,P0.001)。2.2E-Cadherin 表達與結