掃描電鏡樣品制備

1、掃描電鏡樣品制備國掃描電子顯微鏡生物樣品制備技術(shù)無論是透射電鏡或是掃描電鏡，樣品均處于電鏡鏡筒的真空之中。而大多數(shù)的生物樣品都是柔軟而且 含大量水分的。因此，也和透射電鏡的樣品一樣，在進(jìn)行掃描電鏡觀察前， 必須對(duì)生物樣品作相應(yīng)的 處理。掃描電鏡的功能很多，不同的功能對(duì)樣品的要求不同。 例如二次電子像與背散射電子像和吸收電子像 對(duì)樣品的要求基本相同，而與X射線微區(qū)分析對(duì)樣品的要求相差較遠(yuǎn)。我們首先介紹二次電子像的生物樣品制備技術(shù)。此外，由于樣品的性質(zhì)不同，其處理方法和程序也有不同。主要分兩大類，一類為 含水量少的硬組織，如毛發(fā)、牙齒及植物的花粉、 抱子、種子等。此類樣品一般含硅質(zhì)、 鈣質(zhì)，角質(zhì),

2、 砝瑯質(zhì)和纖維素等成份，所以通常只經(jīng)過表面清潔、裝臺(tái)（粘膠）、導(dǎo)電處理等簡單過程即可進(jìn)行觀察。 如要觀察其斷面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)時(shí)， 經(jīng)斷裂、解剖或酶消化、蝕刻等再裝臺(tái)、鍍膜處理，即可進(jìn)行觀察拍 照。另-類為含水分較多的軟組織，如大多數(shù)的動(dòng)植物器官、組織及細(xì)菌等均屬此類。對(duì)于此類樣品， 在金屬鍍膜前，一般都需經(jīng)過固定、脫水、干燥等處理，如不經(jīng)處理或處理不當(dāng)， 就會(huì)造成樣品損傷和變形，岀現(xiàn)各種假像，因此對(duì)每一處理步驟都應(yīng)給予重視。但是，不管是那一類樣品的制備，都應(yīng)達(dá)到以下要求：* 盡可能保持樣品活體時(shí)的形貌和結(jié)構(gòu)，以便如實(shí)地反映樣品本來面目。*在樣品的干燥過程盡可能減少樣品變形。 樣品表面應(yīng)有良好導(dǎo)電性

3、能和二次電子發(fā)射率，以防止和減少樣品的荷電效應(yīng)。樣品的前期處理掃描電鏡樣品的前期處理主要包括表面清潔、固定、漂洗和脫水等過程。而每一過程的處理方法基本 上都是沿用透射電鏡樣品的處理方法的，所以，這里不一一再作詳述。但是，由于兩種電鏡觀察的要 求不同，因此，在處理中也有不同之處：1. 透射電鏡主要研究樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)要求內(nèi)部結(jié)構(gòu)保存好，因而樣品宜盡可能小使固定液能迅時(shí)滲入固定。掃描電鏡觀察表面形貌，而且為了操作方便選取較大樣品。一般在810mm2左右，高度可達(dá)5mm。2. 掃描電鏡要求完整且清潔表面，但是在許多樣品的表面常附有粘液、血液、組織液及灰塵等 雜物，妨礙著觀察，以致造成對(duì)圖像的錯(cuò)誤解釋，

4、所以，在固定前都必須特別做好表面的清 潔工作。以下簡介前期處理方法：清潔：對(duì)樣品的清潔可根據(jù)不同的樣品采用不同的方法，其中常用的方法有： 表面正常干燥的樣品如葉、花瓣、莖等蠟葉標(biāo)本，可用吹氣球或用除塵器吹凈，也可用軟毛 筆輕掃等方法除去表面的灰塵和其它雜物，但需注意不要損傷樣品，吹風(fēng)和清掃的力量取決 于樣品的硬度和污染的程度。一般動(dòng)植物組織，可用蒸餾水、生理鹽水或緩沖液漂洗或沖洗。至于采用何種清潔液清洗， 要視組織本身對(duì)清洗液滲透壓變化的敏感程度而定，如用緩沖液清洗時(shí)，應(yīng)與配制固定液的 緩沖液一致，否則會(huì)因性質(zhì)不同而產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)從而影響固定效果。 對(duì)有油脂分泌物和蠟質(zhì)覆蓋層的樣品如毛發(fā)、蚧蟲等

5、，應(yīng)采用有機(jī)溶劑反復(fù)浸洗。 對(duì)一些附有粘液的組織可采用酶解法或其它試劑處理來清洗，如一般組織可用木瓜蛋白酶和 淀粉酶清洗；腸粘膜可用糜蛋白酶清洗；用胰蛋白酶可分離和清洗胃粘膜的細(xì)胞。有些組織 也可用試劑進(jìn)行清洗，如要分離神經(jīng)細(xì)胞可用稀釋的乙二胺四醋酸處理，用甘油和稀釋的乙 醇延長浸漬時(shí)間可以從分泌乳腺中除去乳汁等。 對(duì)微小的樣品要用離心法或放在用鎳過濾網(wǎng)制的小容器中清洗。 對(duì)于特殊的樣品還須用特殊的方法進(jìn)行清洗。固定：樣品的固定、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同，但由于掃描 電鏡觀察的是樣品的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脫水過程也與透 射電

6、鏡樣品處理有不同之處。除采用戊二醛、四氧化鋨、高錳酸鉀等固定液進(jìn)行固定外，還可采用下列幾種固定液： Sjodstrand 固定液：A液：氯化鈉40.3g+氯化鉀2.1g+鈣0.9g+雙蒸鎦水500mlB液：醋酸鈉9.714g+凡羅那鈉(Veronal)14.74g+雙蒸餾水500m1使用時(shí)吸取 A液10ml, B液3.4ml，再加0/1mol/L鹽酸11ml和鋨酸05g+50ml 蒸餾水Dalton氏固定液:此種固定液為4%重鉻酸鉀（pH7.2）與3.4 %氯化鈉等量混和后，再與2%四氧 化鋨等量混使即得。這種固定液無沉渣，對(duì)樣品損傷少。在能保持樣品不變形的前提下，不少樣品（特別是植物樣品）采

7、用戊二醛單固定即可。（尤其是動(dòng)物樣品）；為了加強(qiáng)固定效果，還可將幾種不同的固定液配合使用，進(jìn)行雙固定或多次固定 如用用戊二醛作前固定，用鋨酸作后固定。脫水：脫水劑常用乙醇和丙酮。丙酮能使組織塊變硬，是它的優(yōu)點(diǎn)。樣品的干燥生物樣品的制備中，干燥是最關(guān)鍵的步驟。干燥過程除引起樣品收縮之外，水的表面張力會(huì)使樣品表面形貌發(fā)生很大的變化， 這對(duì)掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水，是為了包埋劑的滲透（因水不與包埋劑互溶，而乙醇則能互溶 ）。而在掃描電鏡的樣品制備中，脫 水是用表面張力小的乙醇取代表面張力很大的水，從而使干燥過程對(duì)樣品表面產(chǎn)生的影響較少。然后就是如何設(shè)法使樣品表

8、面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇，這就是干燥。目前常用的干燥方法主要有空氣干燥法、臨界點(diǎn)干燥法、冰凍干燥法、真空干燥法和莰烯干燥法等?？諝飧稍锓諝飧稍锓ㄓ址Q自然干燥法，就是將經(jīng)過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。此 法的最大優(yōu)點(diǎn)是簡單易行和節(jié)省時(shí)間，它的致命缺點(diǎn)是在干燥過程中， 組織會(huì)因脫水劑揮發(fā)時(shí)表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，此種方法一般只適用于外殼（表面）較為堅(jiān)硬的樣品。在采用空氣干燥時(shí)，為了減少樣品的收縮變形，除使用易揮發(fā)和表面張力小的脫水劑如乙醇、丙酮等外，還應(yīng)使樣品得到充分固定，特別是須經(jīng)四氧化鋨固定效果才較好。 因?yàn)樗鼤?huì)使組織變得較為堅(jiān)硬， 使收縮變

9、形減少。然而，空氣干燥引起的收縮并非完全不利，有時(shí)可以通過收縮使細(xì)胞之間相互剝離，從而能清楚地觀 察到一個(gè)個(gè)單獨(dú)存在的細(xì)胞及其表面結(jié)構(gòu)。此外，還可通過細(xì)胞成份在干燥時(shí)的收縮，觀察到細(xì)胞內(nèi)的線粒體、細(xì)胞核等成份的存在。但這種機(jī)會(huì)很少，而且因收縮帶來的不利是主要的，所以，目前很少采用。臨界點(diǎn)干燥法 臨界點(diǎn)干燥法是一種消除了物相界面 （液相氣相 ），也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方 法由于沒有表面張力的影響， 所以樣品不易收縮和損傷，此法所用的儀器結(jié)構(gòu)不甚復(fù)雜， 操作較為方 便，所用的時(shí)間也不算長，一般約 2h 左右即可完成，所以，是最為常用的方法。物質(zhì)的臨界點(diǎn)是 1822 年由 Char

10、les cagridde La Tour 發(fā)現(xiàn)的。他將不同的液體分別裝進(jìn)玻璃試管并 密封起來，然后一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊加熱，這時(shí)，他發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高， 試管內(nèi)的液相和氣相之間的彎月 面開始變得模糊起來，只有在試管冷卻之后， 彎月面才又重新出現(xiàn)。每種液體都存在某一溫度， 在這 一溫度時(shí)，液相的彎月面完全消失。那么，彎月面的消失意味著什么呢 ?它意味著液相和氣相之間的界面沒有了，之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象， 是因?yàn)樵诿芊獾娜萜骼铮?液體受熱膨脹，而氣體本身被壓縮，最后在某一特定的溫度和壓力下， 液體 由于膨脹，氣體由于被壓縮而使兩者的密度相同，因而相互混合成一種均一的流體，原先存在它們之 間的彎月面 （即液面

11、）就消失了，表面張力也自然消失了。因此，所謂臨界點(diǎn)，就是指使物質(zhì)的氣態(tài)和 液態(tài)兩相之間達(dá)到相同密度， 成為均一流體狀態(tài)時(shí)的溫度和壓力的總稱。此時(shí)的溫度稱臨界溫度；此 時(shí)的壓力稱臨界壓力。不同的物質(zhì)都有其特定的臨界點(diǎn)， 一般用于掃描電鏡樣品臨界點(diǎn)干燥的置換劑的臨界溫度和壓力見表 10-1。如果在臨介點(diǎn)進(jìn)行干燥，由于表面張力消失就不會(huì)造成樣品表面的損傷。但進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥， 需用專用的臨界點(diǎn)干燥器。具體處理步驟如下：1. 固定脫水 按透射電鏡常規(guī)制樣方法進(jìn)行。2. 純丙酮置換乙醇 如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100 %后，用純丙酮置換1520min。3. 中間液處理 即在用丙酮置換乙醇后，用醋酸異

12、戊酯（乙酸異戊B8）處理15-80min（也可以過夜） 置換丙酶。由于醋酸異戊酯與液態(tài)二氧化碳能互溶，使液態(tài)二氧化碳容易滲入樣品中。4. 裝樣 將樣品從醋酸異戊酯中挑入 （或倒入）樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯 （高壓容器 ）內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣。 （注：在裝樣前，應(yīng)先打 開儀器電源，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0C處預(yù)冷1015min，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進(jìn)入樣品杯中 ）。5. 注入液體二氧化碳 依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進(jìn)氣閥在010 C下，向樣品杯注入液體二氧化碳。6. 漂洗 當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的 50%（通過刻度尺觀察，以液面超過樣

13、品籠為度 ）時(shí)， 關(guān)閉儀器進(jìn)氣閥，靜置1520min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散，然后，打開 儀器排氣流量計(jì)閥門和進(jìn)氣閥門，讓其邊排氣邊充液 10min 左右， （讓含有醋酸異戊酯的二 氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳 ）再關(guān)閉排氣閥；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的 80%左右，關(guān)閉進(jìn)液閥，停止充液。7. 加溫置換 將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20C處經(jīng)1520min后，由于溫度升高，杯內(nèi)液體二氧化碳逐 漸氣化，因此，壓力也隨之上升至 7000Pa 左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置 換。8. 氣化將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上（3540C ），此時(shí)隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸 增加

14、，達(dá)到二氧化碳的臨介點(diǎn)，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)到 7134Pa 時(shí)，經(jīng) 5min 后，即 可排氣。9. 排氣 在保持溫度不變的條件下 （即不關(guān)電源 ），打開流量計(jì)的排氣閥門，以 1.0 1.51min 的速度排氣 （速度慢些更好 ）。約經(jīng) 4560min 后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，將溫 度調(diào)節(jié)至室溫約 5rain 后，即可取出樣品裝臺(tái)鍍膜 （若不能立即裝臺(tái)，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存 ）臨界點(diǎn)干燥的成敗如何；與每一步的操作有很大關(guān)系，因此，操作時(shí)應(yīng)注意以下事項(xiàng)：1. 在樣品放進(jìn)樣品杯前，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至010C，因?yàn)闇囟冗^高，充入的液體二氧化碳會(huì)立即氣化膨脹，壓力增加，妨礙二氧化碳液體繼

15、續(xù)進(jìn)入樣品杯。2. 樣品不宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應(yīng)在半干半濕時(shí)送入樣品杯。因?yàn)檫^濕表明乙酸異 戊脂太多會(huì)干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會(huì)因空氣干燥而造成樣 品己變形，再進(jìn)行臨介點(diǎn)干燥也沒有意義了。3. 一次加入的樣品不宜過多，以免帶進(jìn)過多的中間液，使樣品干燥不完全，另外，樣品過多使 二氧化碳量充入不足而達(dá)不到臨界點(diǎn)。4. 充入液體二氧化碳的量要足。因?yàn)槌湟毫坎蛔?，達(dá)不到臨界值，起不到臨界點(diǎn)干燥作用，一 般充液量應(yīng)達(dá)樣品杯容積的 2/3 左右。5. 在加溫氣化時(shí)，實(shí)際操作溫度應(yīng)超過臨界值，以保證達(dá)到充分的臨界狀態(tài)。6. 開、閉閥門時(shí)，動(dòng)作要輕緩，盡量防止二氧化碳液對(duì)樣

16、品產(chǎn)生突然沖擊而造成樣品損傷。 因此，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或?yàn)V紙。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢，一般放氣時(shí)間應(yīng) 在 4Omin 以上，有時(shí)也可以放氣過夜或過中午。二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除用液體二氧化碳外，也有用固體二氧化碳（干冰 ）作干燥介質(zhì)的。與液體二氧化碳比較，固體二氧化碳有以下優(yōu)點(diǎn) :1. 有利于微小樣品的干燥，例如像玻璃片上的游離細(xì)胞，若用液體二氧化碳干燥，由于二氧化 碳?xì)怏w急劇地噴入樣品杯內(nèi)很可能使樣品被吹掉，而用固體二氧化碳干燥，則完全沒有這種 危險(xiǎn)。2. 不需要用鋼瓶，鋼瓶很重，搬運(yùn)麻煩；用固體二氧化碳時(shí)，有適當(dāng)大小的保溫瓶（如冰壺 ）就可以了，因此很方便。3. 能保證二氧化碳裝滿

17、樣品室，即使用固體二氧化碳時(shí)，每次都能準(zhǔn)確地放入足夠酌量，而不 會(huì)像使用液體二氧化碳時(shí)由于鋼瓶中二氧化碳不足，充不進(jìn)樣品杯內(nèi)，使樣品干燥不完全而 造成損傷。4. 夏天使用方便 在使用液體二氧化碳時(shí)，若室溫超過臨界溫度，液體二氧化碳難以從鋼瓶進(jìn) 入樣品室，而固體二氧化碳則不受室溫高低的影響，即無論多熱的天氣也能放進(jìn)足夠量。5. 不污染樣品 使用液體時(shí)，往往由于鋼瓶內(nèi)有鐵銹粉末充進(jìn)樣品杯而污染樣品，而固體二氧 化碳則無此種污染。固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除使用專門裝置外， 也可用任何一種液體臨界點(diǎn)干燥器， 不過由于液體臨 界點(diǎn)干燥器的樣品室較小，操作起來不大方便。固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法的樣品處理固

18、定、脫水等）與液體二氧化碳臨界干燥法相同，所不同的是在于干燥時(shí)的具體操作。其操作步驟是：先將干冰 用加熱器切成樣品杯容積大小的圓柱體 （也可敲成碎塊或粉末 ），放于樣品籠的頂部，蓋好樣品杯蓋， 然后加熱到15C，使干冰熔化成液體二氧化碳，這時(shí)干燥器內(nèi)的壓力上升，再加熱到40C，使液體二氧化碳逐漸氣化，壓力繼續(xù)上升達(dá)到臨界值，幾分鐘后即可排氣（溫度不變 ）。當(dāng)氣體全部排出，壓力回到零后，即取出樣品，裝臺(tái)鍍膜觀察。冰凍干燥法冰凍干燥是將經(jīng)冰凍的樣品置于高真空中通過升華， 除去樣品中的水分或脫水劑的過程。 冰凍干燥的 基礎(chǔ)是冰 （或固態(tài)溶劑 ）從樣品中升華， 也就是使水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)， 不經(jīng)

19、過中間的液態(tài) ,不存 在氣相和液相之間的表面張力對(duì)樣品的作用， 因此， 能較好地避免或減少了在干燥過程中對(duì)樣品的損 傷。冰凍干燥方法有兩種，即含水樣品直接冰凍干燥和樣品脫水后從有機(jī)溶劑中冰凍干燥。含水樣品直接冰凍干燥法 :此法相對(duì)于臨界點(diǎn)干燥有其明顯優(yōu)點(diǎn)， 即能直接使含水樣品冰凍干燥， 不需要用有機(jī)溶劑脫水和置換， 避免了無極性溶劑對(duì)樣品成份的抽提作用， 因此，不會(huì)使樣品收縮和膜結(jié)構(gòu)或表面物質(zhì)產(chǎn)生穿蝕。如 用此法干燥植物葉的樣品，葉面角質(zhì)層能保持自然狀態(tài)，從而得到好的實(shí)驗(yàn)樣品。含水樣品冰凍干燥的步驟如下：1. 取材固定，按常規(guī)方法進(jìn)行。2. 冰凍保護(hù)劑滲透 將樣品置于10%20 %的二甲基亞砜

20、（DWSO）水溶液或15%40 %的甘 油水溶液，或氯仿中浸泡數(shù)小時(shí)。3. 驟冷 將經(jīng)保護(hù)劑處理過的樣品迅速投入到用液氮預(yù)冷到一150 C的氟利昂12或氟利昂22冷凍劑中，使樣品中的水分在片刻間凍結(jié)。4. 升華干燥 將已驟冷凍結(jié)的樣品移到冰凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣臺(tái)上（保持一 70C 以下）,抽真空（真空度為1010-1Pa），經(jīng)幾小時(shí)或數(shù)天后，樣品即達(dá)到干燥；5. 裝臺(tái)鍍膜 先將冰凍干燥器的樣品臺(tái)加熱至室溫，然后將干燥器放氣，取出樣品迅速裝臺(tái)粘 樣，送入鍍膜儀中鍍膜。但是這種方法也有其不足之處，就是干燥時(shí)間太長，如單層細(xì)胞也要幾小時(shí)才能達(dá)到干燥，而幾毫米 厚的組織塊可能要持續(xù)干燥一至數(shù)天，同時(shí)要

21、判斷是否干燥也較為困難，冰凍過程中會(huì)形成冰晶，使 細(xì)胞成份因受冰晶擠壓而產(chǎn)生移位和變形， 造成人為的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 因此必須采取一些防止這一不良情 況產(chǎn)生的措施，以使樣品的損傷減少到可以忽略的程度。為了防止冰晶的形成，可采用以下辦法：用驟冷劑提高冰凍速度。常用的驟冷劑有氟利昂12和氟利昂22 ;此外，液態(tài)一固態(tài)氮的半凝固狀混合物的溫度可低至-210 C,因此可作為驟冷劑；用冷凍保護(hù)劑如二甲基亞砜、甘油、明膠或氯仿處理樣品，能抑制水分子集合成冰晶和限制冰晶的大小， 以保護(hù)樣品免受冰晶的損傷，尤其以氯仿處理的效果為好，因?yàn)槁确乱子趽]發(fā)，不留在樣品表面而影 響觀察。此外，透射電鏡冰凍制樣技術(shù)中的冷凍方法

22、，也適用于掃描電鏡。樣品脫水后的冰凍干燥：這種方法是用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機(jī)溶劑如乙醚、氯仿、氟利昂113等中，然后連同這些溶劑一起冰凍并在真空中升華(直接用于脫水的乙醇作為冰凍干燥劑也有效)而達(dá)到樣品干燥 的；這種方法相對(duì)于前一種方法有下列優(yōu)點(diǎn)；即有機(jī)溶劑在冰凍時(shí)形成非晶體固態(tài)，不像水那樣結(jié)冰 時(shí)膨脹，因此不會(huì)產(chǎn)生冰晶對(duì)樣品的損傷。有機(jī)溶劑能以比水快得多的速度從固態(tài)中升華，因此，干 燥時(shí)間比上一方法短得多，不需要專用的冰凍干燥裝置，只用普通的真空干燥器加一塊金屬塊作樣品 臺(tái)即可。但此法也有不足之處，就是有機(jī)溶劑對(duì)樣品成份有抽提作用，易造成部分內(nèi)含物丟失。此法的操作程序與前法基

23、本相同，只是無需用冷凍保護(hù)劑處理而已。現(xiàn)將幾種方法介紹如下： 氟利昂TF冷凍干燥法：1. 固定脫水按常規(guī)方法進(jìn)行。2. 置換按圖中所示的比例配好氟利昂 TF和酒精混合液，并通過這些混合液將樣品逐步引入100 %氟利昂TF。3. 冷凍 把樣品浸入液氮中冷凍。4. 干燥 將樣品放在預(yù)先冷卻的鋁座上，再移入真空噴鍍儀中抽真空(約1Pa)，經(jīng)020min后即完全干燥。90min后鋁座變?yōu)槭覝?，即取岀樣品、裝臺(tái)、鍍膜觀察。 乙腈(acetonitrile)真空干燥法：這是一種利用乙腈在急速蒸發(fā)時(shí)會(huì)冷卻固化這一性質(zhì)，將樣品干燥的很獨(dú)特的方法。其操作步驟如下：1. 固定、水洗按常規(guī)方法進(jìn)行。2. 脫水 使用

24、上升的系列乙腈(50 %100 %)脫水各20min。3. 滲透 在容量約Iml的鋁制容器中裝滿乙腈，并投入樣品。4. 升華 把容器放入真空噴鍍儀中抽真空，此時(shí)由于乙腈急速蒸發(fā)而使容器急劇冷卻，其中乙腈也變成冰狀固體。然后繼續(xù)抽真空，使乙腈升華，約經(jīng)30min，樣品即達(dá)干燥。5. 待容器回升到室溫后，即可取岀樣品裝臺(tái)鍍膜進(jìn)行觀察。據(jù)田中敬一報(bào)道此法干燥的效果與臨界點(diǎn)干燥沒有什么不同。茨烯干燥法莰烯是一種樟腦類無色結(jié)晶體， 能溶于醚、環(huán)乙烷、環(huán)己烯和氯仿中，室溫下呈固體狀，能在較低的溫度下升華，從固態(tài)直接變成氣態(tài)，表面張力小，故經(jīng)它干燥的樣品較松軟，變形小，操作也較簡便。莰烯干燥法是由 Warr

25、ens . Buk于1971年提岀的，其操作步驟如下:1. 取新鮮材料迅速投入 0 . 1mol/L磷酸緩沖液中漂洗，然后投入5%的戊二醛（用磷酸緩沖液配 制的pH7.4）中固定1h。2. 轉(zhuǎn)至加有5.4%蔗糖的0. 1mol/L磷酸緩沖液中，在冷凍溫度下過夜。3. 用1%的四氧化鋨（磷酸緩沖液配制）溶液中固定2h。4. 用磷酸緩沖液或雙蒸水漂洗 23次，每次、15min。5. 用 30%, 50%, 70%, 90%, 95%和 100 %丙酮脫水，每級(jí) 15min。6. 用100 %的苯脫酯。7. 在1:1苯與環(huán)氧丙烷中浸泡15min，再轉(zhuǎn)至純環(huán)氧丙烷中， 在45 C下經(jīng)20min后，轉(zhuǎn)入

26、預(yù) 先在水浴箱中加溫成液體的莰烯中浸透，取岀樣品裝臺(tái)。8. 放入真空干燥器中，在室溫下抽真空1h左右，使莰烯直接從固體中升華，然后鍍膜。樣品的裝臺(tái)粘膠將樣品裝固在樣品臺(tái)上， 最好采用導(dǎo)電膠。常用的導(dǎo)電膠有兩種：一種是銀粉導(dǎo)電膠，這是一種將很細(xì)的銀粉拌在低電阻樹脂液內(nèi)制成的膠水，使用較為方便，這種樹脂的絕緣電阻低，干后的電阻率僅為0.02 Q/mm，并可以被溶劑溶解還原，也有其它產(chǎn)品的銀粉導(dǎo)電膠。另一種是將石墨粉拌在低電阻 樹脂液內(nèi)的碳導(dǎo)電膠，它價(jià)格低廉，效果也很好。對(duì)不鍍膜而直接觀察的樣品，必須用導(dǎo)電膠來粘固，對(duì)于要鍍膜的樣品，則可以用其他膠水（如萬能膠、乳膠等）來代替，微細(xì)的樣品（如粉末、纖

27、維）也可用雙面膠紙來粘貼。樣品底面面積較小的樣品（如圓形），裝臺(tái)粘膠時(shí)，不能像圖10-3（a）那樣，膠水僅涂樣品與樣品臺(tái)接觸 的那一小部分，這樣不僅樣品不易裝固，而且鍍膜時(shí)產(chǎn)生死角，金屬膜層與樣品臺(tái)不相接，導(dǎo)性電能 差，易產(chǎn)生充電現(xiàn)象，從而影響觀察和拍照。因此，應(yīng)多涂點(diǎn)膠，像圖10-3（b）那樣，這樣就能保證鍍層在最薄的情況下也能與樣品臺(tái)形成連續(xù)的導(dǎo)電膜，同時(shí)也使樣品粘得牢；樣品粘好后應(yīng)待膠水層內(nèi)外都干透后才進(jìn)行鍍膜和觀察，否則會(huì)影響鍍膜效果和污染電鏡鏡筒，尤其是光欄。對(duì)于大塊的多角形的厚樣品，裝臺(tái)時(shí)，膠水也應(yīng)涂成斜面。對(duì)纖維類樣品，可以像牙刷那樣穿在鉆有孔的樣品臺(tái)上，齊根處涂以膠水加固（觀察

28、橫切面時(shí)）或平粘于樣品臺(tái)上，兩端用膠水固定（觀察纖維表 面時(shí)）。對(duì)于微粒、粉末類樣品粘膠時(shí)應(yīng)盡量避免成團(tuán)，以利于尋找典型圖樣和提高鍍膜效果，對(duì)于此類樣品， 可制成稀的懸浮液，然后滴在樣品臺(tái)上，或在樣品臺(tái)上粘上雙面膠紙后，用牙簽纏上棉花蘸取粉末樣品，再用吹氣球?qū)悠份p輕吹落在樣品臺(tái)上，效果也較好?？傊徽撌悄穷悩悠罚紤?yīng)達(dá)到粘膠牢固，便于鍍膜和圖像背景美觀清晰的要求。掃描電子顯微鏡生物樣品制備技術(shù) 無論是透射電鏡或是掃描電鏡，樣品均處于電鏡鏡筒的真空之中。而大多數(shù)的生物樣品都是柔軟而且 含大量水分的。因此，也和透射電鏡的樣品一樣，在進(jìn)行掃描電鏡觀察前， 必須對(duì)生物樣品作相應(yīng)的 處理。掃描電鏡的功

29、能很多，不同的功能對(duì)樣品的要求不同。 例如二次電子像與背散射電子像和吸收電子像 對(duì)樣品的要求基本相同，而與X射線微區(qū)分析對(duì)樣品的要求相差較遠(yuǎn)。我們首先介紹二次電子像的生物樣品制備技術(shù)。此外，由于樣品的性質(zhì)不同，其處理方法和程序也有不同。主要分兩大類，一類為 含水量少的硬組織，如毛發(fā)、牙齒及植物的花粉、 抱子、種子等。此類樣品一般含硅質(zhì)、 鈣質(zhì)，角質(zhì), 砝瑯質(zhì)和纖維素等成份，所以通常只經(jīng)過表面清潔、裝臺(tái)（粘膠）、導(dǎo)電處理等簡單過程即可進(jìn)行觀察。 如要觀察其斷面或內(nèi)部結(jié)構(gòu)時(shí)， 經(jīng)斷裂、解剖或酶消化、蝕刻等再裝臺(tái)、鍍膜處理，即可進(jìn)行觀察拍 照。另-類為含水分較多的軟組織，如大多數(shù)的動(dòng)植物器官、組織及

30、細(xì)菌等均屬此類。對(duì)于此類樣品， 在金屬鍍膜前，一般都需經(jīng)過固定、脫水、干燥等處理，如不經(jīng)處理或處理不當(dāng)， 就會(huì)造成樣品損傷和變形，岀現(xiàn)各種假像，因此對(duì)每一處理步驟都應(yīng)給予重視。但是，不管是那一類樣品的制備，都應(yīng)達(dá)到以下要求： 盡可能保持樣品活體時(shí)的形貌和結(jié)構(gòu)，以便如實(shí)地反映樣品本來面目。在樣品的干燥過程盡可能減少樣品變形。 樣品表面應(yīng)有良好導(dǎo)電性能和二次電子發(fā)射率，以防止和減少樣品的荷電效應(yīng)。樣品的前期處理掃描電鏡樣品的前期處理主要包括表面清潔、固定、漂洗和脫水等過程。而每一過程的處理方法基本 上都是沿用透射電鏡樣品的處理方法的，所以，這里不一一再作詳述。但是，由于兩種電鏡觀察的要 求不同，因

31、此，在處理中也有不同之處：1. 透射電鏡主要研究樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)要求內(nèi)部結(jié)構(gòu)保存好，因而樣品宜盡可能小使固定液能迅時(shí)滲入固定。掃描電鏡觀察表面形貌，而且為了操作方便選取較大樣品。一般在810mm2 左右，高度可達(dá)5mm。2. 掃描電鏡要求完整且清潔表面，但是在許多樣品的表面常附有粘液、血液、組織液及灰塵等 雜物，妨礙著觀察，以致造成對(duì)圖像的錯(cuò)誤解釋，所以，在固定前都必須特別做好表面的清 潔工作。以下簡介前期處理方法： 清潔：對(duì)樣品的清潔可根據(jù)不同的樣品采用不同的方法，其中常用的方法有 表面正常干燥的樣品如葉、花瓣、莖等蠟葉標(biāo)本，可用吹氣球或用除塵器吹凈，也可用軟毛 筆輕掃等方法除去表面的灰塵和其

32、它雜物，但需注意不要損傷樣品，吹風(fēng)和清掃的力量取決 于樣品的硬度和污染的程度。一般動(dòng)植物組織，可用蒸餾水、生理鹽水或緩沖液漂洗或沖洗。至于采用何種清潔液清洗， 要視組織本身對(duì)清洗液滲透壓變化的敏感程度而定，如用緩沖液清洗時(shí)，應(yīng)與配制固定液的 緩沖液一致，否則會(huì)因性質(zhì)不同而產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)從而影響固定效果。 對(duì)有油脂分泌物和蠟質(zhì)覆蓋層的樣品如毛發(fā)、蚧蟲等，應(yīng)采用有機(jī)溶劑反復(fù)浸洗。 對(duì)一些附有粘液的組織可采用酶解法或其它試劑處理來清洗，如一般組織可用木瓜蛋白酶和 淀粉酶清洗；腸粘膜可用糜蛋白酶清洗；用胰蛋白酶可分離和清洗胃粘膜的細(xì)胞。有些組織 也可用試劑進(jìn)行清洗，如要分離神經(jīng)細(xì)胞可用稀釋的乙二胺四醋酸

33、處理，用甘油和稀釋的乙 醇延長浸漬時(shí)間可以從分泌乳腺中除去乳汁等。 對(duì)微小的樣品要用離心法或放在用鎳過濾網(wǎng)制的小容器中清洗。 對(duì)于特殊的樣品還須用特殊的方法進(jìn)行清洗。固定：樣品的固定、漂洗和脫水等處理所用的試劑和方法基本上與透射電鏡的樣品相同，但由于掃描 電鏡觀察的是樣品的表面，主要是要求保持樣品表面的原貌，因此，在固定、漂洗和脫水過程也與透 射電鏡樣品處理有不同之處。除采用戊二醛、四氧化鋨、高錳酸鉀等固定液進(jìn)行固定外，還可采用下列幾種固定液： Sjodstrand 固定液：A液：氯化鈉40.3g+氯化鉀2.1g+鈣0.9g+雙蒸鎦水500mlB液：醋酸鈉9.714g+凡羅那鈉（Veronal

34、）14.74g+雙蒸餾水500m1使用時(shí)吸取 A液10ml，B液3.4ml，再加0/1mol/L鹽酸11ml和鋨酸05g+50ml 蒸餾水* Dalton氏固定液:此種固定液為4%重鉻酸鉀（pH7.2）與3.4 %氯化鈉等量混和后，再與2%四氧 化鋨等量混使即得。這種固定液無沉渣，對(duì)樣品損傷少。在能保持樣品不變形的前提下，不少樣品（特別是植物樣品）采用戊二醛單固定即可。為了加強(qiáng)固定效果，還可將幾種不同的固定液配合使用，進(jìn)行雙固定或多次固定（尤其是動(dòng)物樣品）；如用用戊二醛作前固定，用鋨酸作后固定。脫水：脫水劑常用乙醇和丙酮。丙酮能使組織塊變硬，是它的優(yōu)點(diǎn)樣品的干燥生物樣品的制備中，干燥是最關(guān)鍵的

35、步驟。干燥過程除引起樣品收縮之外，水的表面張力會(huì)使樣品表面形貌發(fā)生很大的變化， 這對(duì)掃描電鏡的表面形貌觀察特別有害。在透射電鏡的樣品制備中用乙醇脫水，是為了包埋劑的滲透（因水不與包埋劑互溶，而乙醇則能互溶 ）。而在掃描電鏡的樣品制備中，脫 水是用表面張力小的乙醇取代表面張力很大的水，從而使干燥過程對(duì)樣品表面產(chǎn)生的影響較少。然后就是如何設(shè)法使樣品表面不受或少受表面張力影響的條件下除去乙醇，這就是干燥。目前常用的干燥方法主要有空氣干燥法、臨界點(diǎn)干燥法、冰凍干燥法、真空干燥法和莰烯干燥法等?？諝飧稍锓諝飧稍锓ㄓ址Q自然干燥法，就是將經(jīng)過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發(fā)干燥。此 法的最大優(yōu)

36、點(diǎn)是簡單易行和節(jié)省時(shí)間，它的致命缺點(diǎn)是在干燥過程中， 組織會(huì)因脫水劑揮發(fā)時(shí)表面張力的作用而產(chǎn)生收縮變形。因此，此種方法一般只適用于外殼（表面）較為堅(jiān)硬的樣品。在采用空氣干燥時(shí)，為了減少樣品的收縮變形，除使用易揮發(fā)和表面張力小的脫水劑如乙醇、丙酮等外，還應(yīng)使樣品得到充分固定，特別是須經(jīng)四氧化鋨固定效果才較好。因?yàn)樗鼤?huì)使組織變得較為堅(jiān)硬，使收縮變形減少。然而，空氣干燥引起的收縮并非完全不利，有時(shí)可以通過收縮使細(xì)胞之間相互剝離，從而能清楚地觀 察到一個(gè)個(gè)單獨(dú)存在的細(xì)胞及其表面結(jié)構(gòu)。此外，還可通過細(xì)胞成份在干燥時(shí)的收縮，觀察到細(xì)胞內(nèi)的線粒體、細(xì)胞核等成份的存在。但這種機(jī)會(huì)很少，而且因收縮帶來的不利是主

37、要的，所以，目前很少采用。臨界點(diǎn)干燥法臨界點(diǎn)干燥法是一種消除了物相界面 （液相/氣相），也就是消除了表面張力來源的干燥方法。這種方 法由于沒有表面張力的影響， 所以樣品不易收縮和損傷，此法所用的儀器結(jié)構(gòu)不甚復(fù)雜，操作較為方便，所用的時(shí)間也不算長，一般約 2h左右即可完成，所以，是最為常用的方法。物質(zhì)的臨界點(diǎn)是1822年由Charles cagridde La Tour發(fā)現(xiàn)的。他將不同的液體分別裝進(jìn)玻璃試管并密封起來，然后一邊轉(zhuǎn)動(dòng)一邊加熱，這時(shí)，他發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，試管內(nèi)的液相和氣相之間的彎月面開始變得模糊起來，只有在試管冷卻之后，彎月面才又重新出現(xiàn)。每種液體都存在某一溫度，在這一溫度時(shí)，液相

38、的彎月面完全消失。那么，彎月面的消失意味著什么呢 ？它意味著液相和氣相之間的界面沒有了，之所以岀現(xiàn)這種現(xiàn)象， 是因?yàn)樵诿芊獾娜萜骼铮?液體受熱膨脹，而氣體本身被壓縮，最后在某一特定的溫度和壓力下，液體由于膨脹，氣體由于被壓縮而使兩者的密度相同，因而相互混合成一種均一的流體，原先存在它們之 間的彎月面 （即液面 ）就消失了，表面張力也自然消失了。因此，所謂臨界點(diǎn)，就是指使物質(zhì)的氣態(tài)和 液態(tài)兩相之間達(dá)到相同密度， 成為均一流體狀態(tài)時(shí)的溫度和壓力的總稱。此時(shí)的溫度稱臨界溫度；此 時(shí)的壓力稱臨界壓力。不同的物質(zhì)都有其特定的臨界點(diǎn)， 一般用于掃描電鏡樣品臨界點(diǎn)干燥的置換劑的臨界溫度和壓力見表 10-1。

39、如果在臨介點(diǎn)進(jìn)行干燥，由于表面張力消失就不會(huì)造成樣品表面的損傷。但進(jìn)行臨界點(diǎn)干燥， 需用專用的臨界點(diǎn)干燥器。具體處理步驟如下：1. 固定脫水 按透射電鏡常規(guī)制樣方法進(jìn)行。2. 純丙酮置換乙醇 如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100 %后，用純丙酮置換1520min。3. 中間液處理 即在用丙酮置換乙醇后，用醋酸異戊酯（乙酸異戊B8）處理15-80min（也可以過夜） 置換丙酶。由于醋酸異戊酯與液態(tài)二氧化碳能互溶，使液態(tài)二氧化碳容易滲入樣品中。4. 裝樣 將樣品從醋酸異戊酯中挑入 （或倒入）樣品籠中，用濾紙吸去樣品籠外圍的醋酸異戊酯，然后連籠移入儀器的樣品杯 （高壓容器 ）內(nèi)，蓋上蓋并擰緊以防漏氣

40、。 （注：在裝樣前，應(yīng)先打 開儀器電源，將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在0C處預(yù)冷1015min，以保證液態(tài)二氧化碳有足夠量進(jìn)入樣品杯中 ）。5. 注入液體二氧化碳 依次打開二氧化碳鋼瓶排氣閥和儀器的進(jìn)氣閥在010 C下，向樣品杯注入液體二氧化碳。6. 漂洗 當(dāng)液體二氧化碳充至樣品杯容積的50%（通過刻度尺觀察，以液面超過樣品籠為度 ）時(shí)，關(guān)閉儀器進(jìn)氣閥，靜置1520min，讓醋酸異戊酯向液態(tài)二氧化碳中充分?jǐn)U散，然后，打開 儀器排氣流量計(jì)閥門和進(jìn)氣閥門，讓其邊排氣邊充液 10min 左右， （讓含有醋酸異戊酯的二 氧化碳排出和充入新鮮的液態(tài)二氧化碳 ）再關(guān)閉排氣閥；繼續(xù)充入液體二氧化碳至樣品杯的 80%左右，

41、關(guān)閉進(jìn)液閥，停止充液。7. 加溫置換 將溫度調(diào)節(jié)設(shè)定在20C處經(jīng)1520min后，由于溫度升高，杯內(nèi)液體二氧化碳逐 漸氣化，因此，壓力也隨之上升至 7000Pa 左右，樣品中的醋酸異戊酯將與二氧化碳充分置 換。8. 氣化將溫度旋鈕調(diào)至臨界溫度以上（3540C ），此時(shí)隨著溫度升高，樣品杯內(nèi)的壓力也逐漸 增加，達(dá)到二氧化碳的臨介點(diǎn)，界面也隨之消失。當(dāng)壓力達(dá)到 7134Pa 時(shí)，經(jīng) 5min 后，即 可排氣。9. 排氣 在保持溫度不變的條件下 （即不關(guān)電源 ），打開流量計(jì)的排氣閥門，以 1.01.51min 的速度排氣 （速度慢些更好 ）。約經(jīng) 4560min 后，排氣完畢，樣品杯的壓力下降到零，

42、將溫 度調(diào)節(jié)至室溫約 5rain 后，即可取出樣品裝臺(tái)鍍膜 （若不能立即裝臺(tái)，應(yīng)置于干燥器內(nèi)保存 ）。臨界點(diǎn)干燥的成敗如何；與每一步的操作有很大關(guān)系，因此，操作時(shí)應(yīng)注意以下事項(xiàng)：1. 在樣品放進(jìn)樣品杯前，樣品杯應(yīng)預(yù)先冷卻至010C，因?yàn)闇囟冗^高，充入的液體二氧化碳會(huì)立即氣化膨脹，壓力增加，妨礙二氧化碳液體繼續(xù)進(jìn)入樣品杯。2. 樣品不宜過濕，但也不能讓其表面干涸，應(yīng)在半干半濕時(shí)送入樣品杯。因?yàn)檫^濕表明乙酸異 戊脂太多會(huì)干燥后樣品仍含有乙酸異戊脂，影響干燥效果。而過干又會(huì)因空氣干燥而造成樣 品己變形，再進(jìn)行臨介點(diǎn)干燥也沒有意義了。3. 一次加入的樣品不宜過多，以免帶進(jìn)過多的中間液，使樣品干燥不完全

43、，另外，樣品過多使 二氧化碳量充入不足而達(dá)不到臨界點(diǎn)。4. 充入液體二氧化碳的量要足。因?yàn)槌湟毫坎蛔悖_(dá)不到臨界值，起不到臨界點(diǎn)干燥作用，一 般充液量應(yīng)達(dá)樣品杯容積的 2/3 左右。5. 在加溫氣化時(shí)，實(shí)際操作溫度應(yīng)超過臨界值，以保證達(dá)到充分的臨界狀態(tài)。6. 開、 閉閥門時(shí)，動(dòng)作要輕緩，盡量防止二氧化碳液對(duì)樣品產(chǎn)生突然沖擊而造成樣品損傷。 因此，樣品籠的上下應(yīng)墊上一層鏡頭紙或?yàn)V紙。排氣速度也應(yīng)盡量緩慢，一般放氣時(shí)間應(yīng) 在 4Omin 以上，有時(shí)也可以放氣過夜或過中午。二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除用液體二氧化碳外，也有用固體二氧化碳（干冰 ）作干燥介質(zhì)的。與液體二氧化碳比較，固體二氧化碳有以下優(yōu)點(diǎn) :

44、1. 有利于微小樣品的干燥，例如像玻璃片上的游離細(xì)胞，若用液體二氧化碳干燥，由于二氧化 碳?xì)怏w急劇地噴入樣品杯內(nèi)很可能使樣品被吹掉，而用固體二氧化碳干燥，則完全沒有這種 危險(xiǎn)。2. 不需要用鋼瓶，鋼瓶很重，搬運(yùn)麻煩；用固體二氧化碳時(shí)，有適當(dāng)大小的保溫瓶（如冰壺 ） 就可以了，因此很方便。3. 能保證二氧化碳裝滿樣品室，即使用固體二氧化碳時(shí)，每次都能準(zhǔn)確地放入足夠酌量，而不 會(huì)像使用液體二氧化碳時(shí)由于鋼瓶中二氧化碳不足，充不進(jìn)樣品杯內(nèi)，使樣品干燥不完全而 造成損傷。4. 夏天使用方便 在使用液體二氧化碳時(shí)，若室溫超過臨界溫度，液體二氧化碳難以從鋼瓶進(jìn) 入樣品室，而固體二氧化碳則不受室溫高低的影響

45、，即無論多熱的天氣也能放進(jìn)足夠量。5. 不污染樣品 使用液體時(shí)，往往由于鋼瓶內(nèi)有鐵銹粉末充進(jìn)樣品杯而污染樣品，而固體二氧 化碳則無此種污染。固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法除使用專門裝置外， 也可用任何一種液體臨界點(diǎn)干燥器， 不過由于液體臨 界點(diǎn)干燥器的樣品室較小，操作起來不大方便。固體二氧化碳臨界點(diǎn)干燥法的樣品處理固定、脫水等）與液體二氧化碳臨界干燥法相同，所不同的是在于干燥時(shí)的具體操作。其操作步驟是：先將干冰 用加熱器切成樣品杯容積大小的圓柱體 （也可敲成碎塊或粉末 ），放于樣品籠的頂部，蓋好樣品杯蓋， 然后加熱到15C，使干冰熔化成液體二氧化碳，這時(shí)干燥器內(nèi)的壓力上升，再加熱到40C，使液體二氧

46、化碳逐漸氣化，壓力繼續(xù)上升達(dá)到臨界值，幾分鐘后即可排氣（溫度不變 ）。當(dāng)氣體全部排出，壓力回到零后，即取出樣品，裝臺(tái)鍍膜觀察。冰凍干燥法冰凍干燥是將經(jīng)冰凍的樣品置于高真空中通過升華， 除去樣品中的水分或脫水劑的過程。 冰凍干燥的 基礎(chǔ)是冰 （或固態(tài)溶劑 ）從樣品中升華， 也就是使水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)， 不經(jīng)過中間的液態(tài) ,不存 在氣相和液相之間的表面張力對(duì)樣品的作用， 因此， 能較好地避免或減少了在干燥過程中對(duì)樣品的損 傷。冰凍干燥方法有兩種，即含水樣品直接冰凍干燥和樣品脫水后從有機(jī)溶劑中冰凍干燥。含水樣品直接冰凍干燥法此法相對(duì)于臨界點(diǎn)干燥有其明顯優(yōu)點(diǎn)，即能直接使含水樣品冰凍干燥，不需要用

47、有機(jī)溶劑脫水和置換, 避免了無極性溶劑對(duì)樣品成份的抽提作用，因此，不會(huì)使樣品收縮和膜結(jié)構(gòu)或表面物質(zhì)產(chǎn)生穿蝕。如用此法干燥植物葉的樣品，葉面角質(zhì)層能保持自然狀態(tài)，從而得到好的實(shí)驗(yàn)樣品。含水樣品冰凍干燥的步驟如下：1. 取材固定，按常規(guī)方法進(jìn)行。2. 冰凍保護(hù)劑滲透 將樣品置于10%20 %的二甲基亞砜（DWSO）水溶液或15%40 %的甘 油水溶液，或氯仿中浸泡數(shù)小時(shí)。3. 驟冷 將經(jīng)保護(hù)劑處理過的樣品迅速投入到用液氮預(yù)冷到一150 C的氟利昂12或氟利昂22冷凍劑中，使樣品中的水分在片刻間凍結(jié)。4. 升華干燥 將已驟冷凍結(jié)的樣品移到冰凍干燥器內(nèi)已預(yù)冷的樣臺(tái)上（保持一 70C以下）,抽真空（真空

48、度為1010-1Pa），經(jīng)幾小時(shí)或數(shù)天后，樣品即達(dá)到干燥；5. 裝臺(tái)鍍膜先將冰凍干燥器的樣品臺(tái)加熱至室溫，然后將干燥器放氣，取出樣品迅速裝臺(tái)粘 樣，送入鍍膜儀中鍍膜。但是這種方法也有其不足之處，就是干燥時(shí)間太長，如單層細(xì)胞也要幾小時(shí)才能達(dá)到干燥，而幾毫米 厚的組織塊可能要持續(xù)干燥一至數(shù)天，同時(shí)要判斷是否干燥也較為困難，冰凍過程中會(huì)形成冰晶，使 細(xì)胞成份因受冰晶擠壓而產(chǎn)生移位和變形，造成人為的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。因此必須采取一些防止這一不良情況產(chǎn)生的措施，以使樣品的損傷減少到可以忽略的程度。為了防止冰晶的形成，可采用以下辦法：用驟冷劑提高冰凍速度。常用的驟冷劑有氟利昂12和氟利昂22 ;此外，液態(tài)一固態(tài)氮

49、的半凝固狀混合物的溫度可低至-210 C,因此可作為驟冷劑；用冷凍保護(hù)劑如二甲基亞砜、甘油、明膠或氯仿處理樣品，能抑制水分子集合成冰晶和限制冰晶的大小， 以保護(hù)樣品免受冰晶的損傷，尤其以氯仿處理的效果為好，因?yàn)槁确乱子趽]發(fā)，不留在樣品表面而影 響觀察。此外，透射電鏡冰凍制樣技術(shù)中的冷凍方法，也適用于掃描電鏡。樣品脫水后的冰凍干燥：這種方法是用乙醇或丙酮脫水后過渡到某些易揮發(fā)的有機(jī)溶劑如乙醚、氯仿、氟利昂113等中，然后連同這些溶劑一起冰凍并在真空中升華（直接用于脫水的乙醇作為冰凍干燥劑也有效）而達(dá)到樣品干燥 的；這種方法相對(duì)于前一種方法有下列優(yōu)點(diǎn)；即有機(jī)溶劑在冰凍時(shí)形成非晶體固態(tài)，不像水那樣結(jié)冰 時(shí)膨脹，因此不會(huì)產(chǎn)生冰晶對(duì)樣品的損傷。有機(jī)溶劑能以比水快得多的速度從固態(tài)中升華，因此，干 燥時(shí)間比上一方法短得多，不需要專用的冰凍干燥裝置，只用普通的真空干燥器加一塊金屬塊作樣品 臺(tái)即可。但此法也有不足之處，就是有機(jī)溶劑對(duì)樣品成份有抽提作用，易造成部分內(nèi)含物丟失。此法的操作程序與前法基本相同，只是無需用冷凍保護(hù)劑處理而已。現(xiàn)將幾種方法介紹如下：