生物樣品的制備與提取12頁

1、第二章 生物樣品的制備2. 1 生物分析化學(xué)分析對象的復(fù)雜性生物樣品往往是一種具有高度復(fù)雜性的體系，這種復(fù)雜性表現(xiàn)在組成、含量、動力學(xué)范圍、時空依存性等各個方面，這使得生物樣品的處理有很大的難度。因此，與經(jīng)典分析化學(xué)的樣品制備相比，生物分析化學(xué)的樣品制備有以下特點：（1）生物樣品的組成極其復(fù)雜，常常包含有數(shù)百種乃至幾千種化合物。如人類血漿蛋白質(zhì)組學(xué)的階段性研究結(jié)果表明，正常人血漿中的蛋白質(zhì)至2005年時已鑒定了3020種。有的生物分子在分離過程中還在不斷的代謝，所以生物分子的分離純化方法差別極大，想找到一種適合各種生物大分子分離制備的標準方法是很困難的。（2）許多生物分子在生物材料中的含量極微

2、，只有萬分之一、幾十萬分之一，甚至幾百萬分之一。分離純化的步驟繁多，流程長，有的目的產(chǎn)物要經(jīng)過十幾步、幾十步的操作才能達到所需純度的要求。（3）生物分子往往有很寬的動力學(xué)濃度范圍。如不同的蛋白質(zhì)在細胞內(nèi)的濃度分布范圍相差1061010倍，而同一種蛋白質(zhì)在不同的生理或病理狀態(tài)下濃度相差有時也很大。（4）許多生物分子一旦離開了生物體內(nèi)的環(huán)境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物分子提取制備最困難之處。過酸、過堿、高溫、劇烈的攪拌、強輻射及本身的自溶等都會使生物大分子變性而失活。（5）生物分子的分離和制備幾乎都是在溶液中進行的，很難準確估計和判斷溫度、pH值、離子強度等各種參數(shù)對溶液中

3、各種成分的綜合影響，因而實驗結(jié)果常常帶有很大的經(jīng)驗成份，實驗的重復(fù)性較差，分析儀器、分析方法學(xué)、乃至個人的實驗技術(shù)水平和經(jīng)驗對實驗結(jié)果會有較大的影響。制備生物分子的基本原則是：以盡可能少的步驟、盡可能短的時間，獲得盡可能多的目標產(chǎn)品。通常包括以下步驟：確定要制備的生物分子的目的和要求；通過文獻調(diào)研和預(yù)備性實驗，掌握目標產(chǎn)物的物理、化學(xué)以及生物學(xué)性質(zhì)；生物材料的破碎和預(yù)處理；分離純化方案的選擇和探索；選擇相應(yīng)的、可靠的分析技術(shù)，建立鑒定生物分子制備物的均一性（即純度）的方法；產(chǎn)物的濃縮、干燥和保存。在進行樣品處理時，需要考慮的生物分子的物理、化學(xué)及生物學(xué)性質(zhì)主要有：在水和各種有機溶劑中的溶解性；

4、在不同溫度、pH值和各種緩沖液中的穩(wěn)定性；固態(tài)時對溫度、含水量和凍干時的穩(wěn)定性；各種物理性質(zhì)：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、等電點、在電場中的行為、離心沉降的表現(xiàn)、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數(shù)等；其它化學(xué)性質(zhì)，如對各種蛋白酶、水解酶的穩(wěn)定性和對各種化學(xué)試劑的穩(wěn)定性；對其他生物分子的特殊親和力；在細胞內(nèi)的定位等。生物大分子和生物小分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間在物理、化學(xué)及生物特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其它分子的親和性等。各種方法的基本原理基本上可以歸納為兩個方面：一是利用混合物中幾個組分分配系數(shù)的差異，把它們分配到兩個

5、或幾個相中，如鹽析、有機溶劑沉淀、層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，通過物理力場的作用，使各組分分配于不同的區(qū)域，從而達到分離的目的，如電泳、離心、超濾等。目前純化蛋白質(zhì)等生物大分子的關(guān)鍵技術(shù)是電泳、色譜和高速與超速離心。由于生物大分子不能加熱熔化和汽化，因而所能分配的物相只限于固相和液相，在此兩相之間交替進行分離純化。在實際工作中往往要綜合運用多種方法，才能制備出高純度的生物大分子。制備物的均一性（即純度）的鑒定，通常只采用一種方法是不夠的，必須同時采用23種不同的純度鑒定法才能確定。如蛋白質(zhì)和酶制成品純度的鑒定最常用的方法是：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳，

6、如能再用高效液相色譜（HPLC）和毛細管電泳（CE）進行聯(lián)合鑒定則更為理想，必要時再做N末端氨基酸殘基的分析鑒定。核酸的純度鑒定通常采用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，但最方便的還是紫外吸收法，即測定樣品在pH 7.0時260nm與280nm的吸光度（A260和A280），從A260/A280的比值即可判斷核酸樣品的純度。2. 2 生物材料的選擇生物材料來源于動物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。應(yīng)盡可能選擇選擇含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低的生物材料，但往往這幾方面的要求不能同時具備，含量豐富但來源困難，或含量來源較理想，但材料的分離純化方法繁瑣，流程很長，反倒不如含量低些但易于獲得純

7、品的材料，由此可見，必須根據(jù)具體情況，抓住主要矛盾決定取舍。植物材料的選材應(yīng)注意季節(jié)性、地理位置和生長環(huán)境等。動物材料的選材要注意其年齡、性別、營養(yǎng)狀況、遺傳素質(zhì)和生理狀態(tài)等。動物在饑餓時，脂類和糖類含量相對減少，有利于生物大分子的提取分離。微生物材料的選材要注意菌種的代數(shù)和培養(yǎng)基成分等之間的差異，例如在微生物的對數(shù)期，酶和核酸的含量較高，可獲得較高的產(chǎn)量。2. 3 激光捕獲顯微切割技術(shù)激光捕獲顯微切割技術(shù)（laser-capture microdissection，LCM）是在顯微狀態(tài)或顯微鏡直視下通過顯微操作系統(tǒng)對欲選取的材料（組織、細胞群、細胞、細胞內(nèi)組分或染色體區(qū)帶等）進行切割、分離，

8、獲取均勻性很好的目標細胞，以用于后續(xù)研究的顯微分離收集技術(shù)。2. 3. 1 LCM的特點（1）LCM可以從任何組織中快速、精準地分離出純的特異細胞及細胞群。每次粘附的直徑在7.530m可調(diào)，既能分離任何形狀的單細胞，又能分離大面積組織。因此利用顯微切割技術(shù)可以分離收集到像核仁和包涵體及染色體特異區(qū)帶這樣細微的對象。（2）利用顯微切割技術(shù)是在組織細胞或染色體的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究對象的歷史背景明確。例如何杰金氏淋巴瘤中瘤組織成分多樣，特征性的瘤細胞(R-S細胞及其變異型)占細胞成分的2%左右，且呈散在性分布,如果常規(guī)地用組織勻漿的方式從組織中提取蛋白質(zhì)或核酸，則既包含了來自瘤

9、細胞的成分，又包含了來自淋巴細胞、漿細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、組織細胞等多種非瘤細胞的成分，這樣所提的蛋白質(zhì)或核酸來自何種細胞并不清楚，而如果用顯微切割技術(shù)則可以選擇我們需要的細胞，以使研究對象的歷史背景明確。（3）顯微切割技術(shù)可以保證所取材料一定層次上的同質(zhì)性。雖然流式細胞技術(shù)也是一種強有力的同質(zhì)細胞分離技術(shù)，但是它只能處理懸浮液中的細胞，不可能用于各種處于固態(tài)的組織中的同質(zhì)細胞的分離；而且，流式細胞技術(shù)需要各種特殊的標記物才能完成分離。因此，可以認為，LCM是對流式細胞技術(shù)的一種重要的完善和補充。由于LCM的取材具有高度的均勻性，因此與從其它制備來源的樣品細胞所得到的研究結(jié)果相比，其

10、獲取的數(shù)據(jù)更為精確和具有代表性。（4）LCM適用于H&E染色、免疫組化、熒光標記等多種染色方式，可以與多種分子生物學(xué)、免疫學(xué)及病理學(xué)技術(shù)結(jié)合使用。LCM分離的特異細胞或組織可以進行測序、PCR、QPCR、生物芯片、質(zhì)譜、二維凝膠電泳等分析。因此，在蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)以及分子生物學(xué)的研究中，LCM日益受到重視，已成為許多深入研究工作中起始的重要一步。2. 3. 2 LCM的儀器與基本操作 （略）2. 3. 3 LCM的實例激光捕獲顯微切割的材料可以是以各種方式貼附于固相支持物上的各種組織細胞成分，如石蠟組織切片、冰凍組織切片、細胞鋪片、細胞爬片、細胞甩片、培養(yǎng)細胞、常規(guī)制備的染色體等。2. 4

11、 細胞的破碎除了某些細胞外的多肽激素和某些蛋白質(zhì)與酶以外，對于細胞內(nèi)或多細胞生物組織中的各種生物分子的分離純化，都需要事先將細胞和組織破碎，使其充分釋放到溶液中，并不丟失生物活性。不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要采取專門的細胞破碎方法。（表2.1）表2.1 各種細胞破碎方法的應(yīng)用范圍細胞破碎方法劇烈程度應(yīng)用對象機械法研磨法劇烈固體組織細胞、微生物細胞組織搗碎法（勻漿法）劇烈固體組織細胞、微生物細胞物理法反復(fù)凍融法溫和細菌細胞、組織培養(yǎng)細胞超聲波處理

12、法劇烈懸浮細胞壓榨法劇烈微生物細胞、含有細胞壁的細胞冷熱交替法溫和細菌細胞或病毒化學(xué)與生物化學(xué)方法自溶法溫和組織及各種細胞溶脹法溫和血細胞、組織培養(yǎng)細胞酶解法溫和植物細胞、細菌細胞、真菌細胞2. 5 生物大分子的提取“提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程。這一過程是將目的產(chǎn)物與細胞中其它化合物和生物大分子分離，即由固相轉(zhuǎn)入液相，或從細胞內(nèi)的生理狀況轉(zhuǎn)入外界特定的溶液中。影響提取的因素主要有：目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??；由固相擴散到液相的難易；溶劑的pH值和提取時間等。一種物質(zhì)在某

13、一溶劑中溶解度的大小與該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)及使用的溶劑的理化性質(zhì)有關(guān)。一般地說，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；溫度升高，溶解度加大；遠離等電點的pH值，溶解度增加。提取時所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。2. 5. 1 水溶液提取蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度大，是提取蛋白質(zhì)和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應(yīng)注意的幾個主要影響因素是：（1）鹽濃度（即離子強度）：離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質(zhì)，如DNA-蛋白復(fù)合物，在高離子強度下溶解

14、度增加，而另一些物質(zhì)，如RNA-蛋白復(fù)合物，在低離子強度下溶解度增加，在高離子強度下溶解度減小。絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時大大增加，稱為“鹽溶”現(xiàn)象。但中性鹽的濃度增加至一定時，蛋白質(zhì)的溶解度又逐漸下降，直至沉淀析出，稱為“鹽析”現(xiàn)象。（2）pH值：蛋白質(zhì)、酶與核酸的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有關(guān)。過酸、過堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在pH=68范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點的兩側(cè)。堿性蛋白質(zhì)選在偏酸一側(cè)，酸性蛋白質(zhì)選在偏堿的一側(cè)，以增加蛋白質(zhì)的溶解度，提高提取效果。例如胰蛋白酶為堿

15、性蛋白質(zhì)，常用稀酸提取，而肌肉甘油醛-3-磷酸脫氫酶屬酸性蛋白質(zhì)，則常用稀堿來提取。（3）溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時一般在05的低溫操作。但少數(shù)對溫度耐受力強的蛋白質(zhì)和酶，可提高溫度使雜蛋白變性，有利于提取和下一步的純化。（4）防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：在提取蛋白質(zhì)、酶和核酸時，常常受自身存在的蛋白酶或核酸酶的降解作用而導(dǎo)致實驗的失敗。為防止這一現(xiàn)象的發(fā)生，常常采用加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的pH、離子強度或極性等方法使這些水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質(zhì)、酶及核酸的降解作用。例如在提取DNA時加入EDTA絡(luò)合DNAase活化所必須的Mg+。（5）攪拌與氧

16、化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質(zhì)的變性失活。2. 5. 2 有機溶劑提取一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的有機溶劑提取。常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性，其中正丁醇在0時在水中的溶解度為10.5，40時為6.6，同時又用具有較強的親脂性，因此常用來提取與脂結(jié)合較牢或含非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)、酶和脂類。例如植物種子中的玉蜀黍蛋白、麩蛋白，常用7080的乙醇提取，動物組織中一些線粒體

17、及微粒上的酶常用丁醇提取。有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐?，并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。例如，胰島素可溶于稀酸、稀堿和稀醇溶液，但在組織中與其共存的糜蛋白酶對胰島素有極高的水解活性，因而采用6.8乙醇溶液并用草酸調(diào)溶液的pH為2.53.0，進行提取，這樣就從下面三個方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：6.8的乙醇可以使糜蛋白酶暫時失活；草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca+；選用pH2.53.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。以上條件對胰島素的溶解和穩(wěn)定性都沒有影響，卻可除去一部分在稀醇與稀酸中不溶解的

18、雜蛋白。2. 6 生物大分子的分離與純化由于生物體的組成成分是如此復(fù)雜，數(shù)千種乃至上萬種生物分子又處于同一體系中，因此不可能有一個適合于各類分子的固定的分離程序，但多數(shù)分離工作關(guān)鍵部分的基本手段是相同的。為了避免盲目性，節(jié)省實驗探索時間，要認真參考和借鑒前人的經(jīng)驗，少走彎路。常用的分離純化方法和技術(shù)有：離心法、沉淀法（包括：鹽析、有機溶劑沉淀、選擇性沉淀等）、色譜法、等電聚焦制備電泳法等。本節(jié)以介紹離心法和沉淀法為主。2. 6. 1 離心技術(shù)離心技術(shù)(Centrifuge Technique)是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運動時受到一個外向的離心力的行為而發(fā)展起來的一種分離技術(shù)。這項技術(shù)應(yīng)用很廣，諸如

19、分離出化學(xué)反應(yīng)后的沉淀物，天然的生物大分子、無機物、有機物，在生物化學(xué)以及其它的生物學(xué)領(lǐng)域常用來收集細胞、細胞器及生物大分子物質(zhì)。離心技術(shù)具有比較溫和、分離樣品量大等特點，在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥工業(yè)等方面是最常用的技術(shù)之一。2. 6. 1. 1 離心力與相對離心力離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運動的任何物體都受到一個向外的離心力進行的。離心力（centrifugal force，F(xiàn)c）等于離心加速度2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：Fc=m2X，其中是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度 秒-1為單位；X是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。由于各種離心機轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的

20、距離不同，離心力因而會發(fā)生變化，因此在文獻中常用相對離心力（relative centrifugal force，RCF）或“數(shù)字g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結(jié)果。RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。RCF = F離心力/F重力 = m2X/mg = 2X / g = 1.118105nX式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度(980cm sec-2)；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)(rpm)。一般情況下，低速離心轉(zhuǎn)速以r min-1表示，高速離心以重力加速度g表示。在計算顆粒的相對離心力時，應(yīng)注意離心管與中心軸之間的距離，即離心

21、半徑r（cm）的長度，離心管所處的位置不同，沉降顆粒所承受的離心力也不同。因此，超速離心常用重力加速度的倍數(shù)（g）代替轉(zhuǎn)速（r min-1），這樣可以真正反映顆粒在離心管中所受到的離心力。離心力的數(shù)據(jù)通常是指相對離心力的平均值，也就是指離心管中點的離心力。為了便于相對離心力和轉(zhuǎn)速之間換算，人們對半徑、相對離心力和轉(zhuǎn)速三者之間進行換算，設(shè)計了相對離心力的轉(zhuǎn)換列線圖。2. 6. 1. 2 沉降系數(shù)、沉降速度與K系數(shù)2. 6. 1. 3 離心技術(shù)的分類按照實際工作的需要，目前已設(shè)計出許多離心方法，綜合起來大致可分三類：平衡離心法。根據(jù)粒子大小、形狀不同進行分離，包括差速離心法和速率區(qū)帶離心法。等密度

22、離心法又稱等比重離心法，依粒子密度差進行分離。等密度離心法和上述速率區(qū)帶離心法又合稱為密度梯度離心法。經(jīng)典式沉降平衡離心法，用于對生物大分子分子量的測定、純度估計、構(gòu)象變化研究等。（1）差速離心法它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級分離出所需要的物質(zhì)。差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個數(shù)量級內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。（2）速

23、率區(qū)帶離心法這種方法是根據(jù)分離的粒子在梯度液中沉降系數(shù)s的不同，使具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內(nèi)分成一系列區(qū)帶，達到彼此分離的目的。在離心前，于離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分離的樣品鋪在梯度液的頂部、離心管底部或梯度層中間，同梯度液一起離心。離心后在近旋轉(zhuǎn)軸處（X1）的介質(zhì)密度最小，離旋轉(zhuǎn)軸最遠處（X2）介質(zhì)的密度最大，但最大介質(zhì)密度必須小于樣品中粒子的最小密度，即Pm。梯度液在離心過程中以及離心完畢后，取樣時起著支持介質(zhì)和穩(wěn)定劑的作用，避免因機械振動而引起已分層的粒子再混合。由于Pm，可知s 0，因此該離心法的離心時間要嚴格控制，既要有足夠

24、的時間使各種粒子在介質(zhì)梯度中形成區(qū)帶，又要控制在任一粒子達到沉淀前結(jié)束離心。如果離心時間過長，所有的樣品可全部到達離心管底部；離心時間不足，樣品還沒有分離。由于此法是一種不完全的沉降，沉降受物質(zhì)本身大小的影響較大，一般是應(yīng)用在物質(zhì)大小相異而密度相同的情況。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。（3）等密度離心法這種方法是根據(jù)顆粒密度的不同來進行分離的。在離心前，預(yù)先配制介質(zhì)的密度梯度液，此種密度梯度液包含了被分離樣品中所有粒子的密度，待分離的樣品鋪在梯度液頂上或和梯度液先混合，離心開始后，梯度液由于離心力的作用逐漸形成管底濃而管頂稀的密度梯度，與此同時，原來分布均勻的粒子也發(fā)生重新

25、分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于粒子的密度，即mP時，粒子上??；在管頂處Pm時，則粒子沉降，最后粒子進入到一個它本身的密度位置即Pm，此時dx/dt為零粒子不再移動，粒子形成純組份的區(qū)帶。區(qū)帶與樣品粒子的密度有關(guān)，而與粒子的大小和其他參數(shù)無關(guān)，因此只要轉(zhuǎn)速、溫度不變，則延長離心時間也不能改變這些粒子的成帶位置。2. 6. 2 沉淀法沉淀是溶質(zhì)從溶液中析出的過程。沉淀法操作簡便、成本低廉，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質(zhì)和酶時最常用的方法。此方法的基本原理是根據(jù)不同物質(zhì)在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，不同溶解度的產(chǎn)生是由于溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與

26、溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)有關(guān)，溶劑組分的改變或加入某些沉淀劑以及改變?nèi)芤旱膒H值、離子強度和極性都會使溶質(zhì)的溶解度產(chǎn)生明顯的改變。通過沉淀，將目的生物大分子轉(zhuǎn)入固相沉淀或留在液相，而與雜質(zhì)得到初步的分離。在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法是：中性鹽沉淀（鹽析法）：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。有機溶劑沉淀：多用于蛋白質(zhì)和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。選擇性沉淀（熱變性沉淀和酸堿變性沉淀）：多用于除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。等電點沉淀：用于氨基酸、蛋白質(zhì)及其他兩性物質(zhì)的沉淀，但此法單獨應(yīng)用較少，多與其他方法結(jié)合使用。有機聚合物沉淀： 是發(fā)展較快的一種新方法，

27、主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol，PEG）作為沉淀劑。2. 6. 2. 1 中性鹽沉淀（鹽析法）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為“鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉淀分離，2040飽和度的硫酸銨可以使許多病毒沉淀，43飽和度的硫酸銨可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清液中。鹽析法應(yīng)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點是：成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。操作簡單、安全。對許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（04）進行。（1）中性鹽

28、的選擇常用的中性鹽中，最重要的是(NH4)2SO4，其突出的優(yōu)點是溶解度大，即使是在低溫條件下，仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。（2）鹽析的操作方法（3）鹽析的影響因素蛋白質(zhì)的濃度。中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時，溶液中蛋白質(zhì)的實際濃度對分離的效果有較大的影響。通常高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度即可將其沉淀下來，但若蛋白質(zhì)濃度過高，則易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用，除雜蛋白的效果會明顯下降。對低濃度的蛋白質(zhì)，要使用更大的硫酸銨飽和度，其共沉淀作用小，分離純化效果較好，但回收率會降低。通常認為比較適中的蛋白質(zhì)濃度是2.53.0，相當(dāng)于2530 mg mL-1。pH值。蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多，它的

29、溶解度就越大。改變pH值可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)，因而就改變了蛋白質(zhì)的溶解度。遠離等電點處溶解度大，在等電點處溶解度小，因此用中性鹽沉淀蛋白質(zhì)時，pH值常選在該蛋白質(zhì)的等電點附近。溫度。對于多數(shù)無機鹽和小分子有機物，溫度升高溶解度加大，但對于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨濃度升高而增加的。在一般情況下，對蛋白質(zhì)鹽析的溫度要求不嚴格，可在室溫下進行。但對于某些對溫度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力喪失。2. 6. 2. 2 有機溶劑沉淀法（1）基本原理有機溶劑可以使許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多

30、糖和小分子生化物質(zhì)發(fā)生沉淀作用，其作用的原理主要是降低水溶液的介電常數(shù)。溶劑的極性與其介電常數(shù)密切相關(guān)，極性越大，介電常數(shù)越大，如20時水的介電常數(shù)為80，而乙醇和丙酮的介電常數(shù)分別是24和21.4，因而向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，增加了蛋白質(zhì)分子間的相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。另一方面，由于使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解于水的同時從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。有機溶劑沉淀法的優(yōu)點是：分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個比較窄的有機溶劑濃度

31、范圍內(nèi)沉淀。沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。（2）有機溶劑的選擇和濃度的計算（3）有機溶劑沉淀的影響因素溫度：多數(shù)蛋白質(zhì)在有機溶劑與水的混合液中，溶解度隨溫度的降低而下降。值得注意的是大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此有機溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。樣品濃度：樣品濃度對有機溶劑沉淀生物大分子的影響與鹽

32、析的情況相似，即低濃度樣品要使用比例更大的有機溶劑進行沉淀，且樣品的回收率低，具有生物活性的樣品易產(chǎn)生稀釋變性。但對于低濃度的樣品，雜蛋白與樣品共沉淀的作用小，有利于提高分離效果。反之，對于高濃度的樣品，可以節(jié)省有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉淀作用大，分離效果下降。通常，使用520 mg mL-1的蛋白質(zhì)初濃度為宜，可以得到較好的沉淀分離效果。pH值：有機溶劑沉淀適宜的pH值，要選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH值，通常是選在等電點附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。離子強度：離子強度是影響有機溶劑沉淀生物大分子的重要因素。以蛋白質(zhì)為例，鹽濃度太大或太小都

33、有不利影響，通常溶液中鹽濃度以不超過5為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的倍體積為宜，少量的中性鹽對蛋白質(zhì)變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)的效果，通常是在低鹽或低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。有機溶劑沉淀法經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶、多糖和核酸等生物大分子的沉淀分離，使用時先要選擇合適的有機溶劑，然后注意調(diào)整樣品的濃度、溫度、pH值和離子強度，使之達到最佳的分離效果。沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，減少其中有機溶劑的含量，如若必要可以用透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。2. 6. 2. 3 選

34、擇性變性沉淀法這一方法是利用蛋白質(zhì)、酶與核酸等生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純，稱為選擇性變性沉淀法。常用的有熱變性、選擇性酸堿變性和有機溶劑變性等。（1）熱變性利用生物大分子對熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最為簡便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子的初期分離純化。（2）表面活性劑和有機溶劑變性不同蛋白質(zhì)和酶等對于表面活性劑和有機溶劑的敏感性不同，在分離純化過程中使用它們可以使那些敏感性強的雜蛋白變性沉淀，而目的物仍留在溶液中。使用此法時通常

35、都在冰浴或冷室中進行，以保護目的物的生物活性。（3）選擇性酸堿變性利用蛋白質(zhì)和酶等對于溶液中酸堿不同pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀，通常是在分離純化流程中附帶進行的一個分離純化步驟。2. 6. 2. 4 等電點沉淀法等電點沉淀法是利用具有不同等電點的兩性電解質(zhì)，在達到電中性時溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進行初步的沉淀分離。但是，由于許多蛋白質(zhì)的等電點十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨使用此法分辨率較低，效果不理想，因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合

36、使用，以提高沉淀能力和分離效果。此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。2. 6. 2. 5 有機聚合物沉淀法有機聚合物最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。其中應(yīng)用最多的是聚乙二醇PEGHOCH2(CH2OCH2)nCH2OH（n4），它的親水性強，溶于水和許多有機溶劑，對熱穩(wěn)定，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為600020000的PEG。PEG的沉淀效果主要與其本身的濃度和分子量有關(guān)，同時還受離子強度、溶液pH和溫度等因素的影響。在一定的pH值下，鹽濃度越高，所需PEG時濃度越低，溶液的pH越接近目的物的等電點，沉淀所需PE

37、G的濃度越低。在一定范圍內(nèi)，高分子量和濃度高的PEG沉淀的效率高。對于聚乙二醇沉淀作用的解釋主要有：聚合物與生物大分子發(fā)生共沉淀作用。由于聚合物有較強的親水性，使生物大分子脫水而發(fā)生沉淀。聚合物與生物大分子之間以氫鍵相互作用形成復(fù)合物，在重力作用下形成沉淀析出。通過空間位置排斥，使液體中生物大分子被迫擠聚在一起而發(fā)生沉淀。本方法的優(yōu)點是：操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。沉淀后有機聚合物容易去除。2. 6. 3 透析自Thomas Graham 1861年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學(xué)實驗室最簡便最常用的分離純化

38、技術(shù)之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質(zhì)和濃縮樣品等都要用到透析的技術(shù)。透析只需要使用專用的半透膜即可完成。通常是將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達到平衡為止。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。透析的動力是擴散壓，擴散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶質(zhì)在膜內(nèi)外兩邊的濃度梯度，還正比于膜的面積和溫度，通常是4透

39、析，升高溫度可加快透析速度。透析膜可用動物膜和玻璃紙等，但用的最多的還是用纖維素制成的透析膜，目前常用的是美國Union Carbide （聯(lián)合碳化物公司）和美國光譜醫(yī)學(xué)公司生產(chǎn)的各種尺寸的透析管。截留分子量（molecular weight cut off，MWCO），即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，通常為1萬左右。2. 6. 4 超濾超濾現(xiàn)已成為一種重要的生化實驗技術(shù)，廣泛用于含有各種小分子溶質(zhì)的各種生物大分子（如蛋白質(zhì)、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。超濾是一種加壓膜分離技術(shù)，即在一定的壓力下，使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過一定孔徑的特制的薄膜，而使大分子溶質(zhì)不能透過，留在膜的一邊，從而

40、使大分子物質(zhì)得到了部分的純化。超濾技術(shù)的優(yōu)點是操作簡便，成本低廉，不需增加任何化學(xué)試劑，尤其是超濾技術(shù)的實驗條件溫和，與蒸發(fā)、冰凍干燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。在生物大分子的制備技術(shù)中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制劑。對于蛋白質(zhì)溶液，一般只能得到1050的濃度。2. 6. 5 冰凍干燥冰凍干燥是指將生物大分子的水溶液冰凍，然后在低溫和高真空下使冰升華，留下固體干粉的過程。生物大分子分離純化后的最終產(chǎn)品多數(shù)是水溶液，要從水溶液中得到固體產(chǎn)品，最好的辦法就是冰凍干燥。冰凍干燥得

41、到的生物大分子固體樣品有突出的優(yōu)點：由于是由冰凍狀態(tài)直接升華為汽態(tài)，所以樣品不起泡，不暴沸。得到的干粉樣品不粘壁，易取出。冰干后的樣品是疏松的粉末，易溶于水。冰凍干燥特別適用于那些對熱敏感、易吸濕、易氧化及溶劑蒸發(fā)時易產(chǎn)生泡沫而引起變性的生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶、核酸、抗菌素和激素等。冰凍干燥的過程在冰凍干燥機內(nèi)完成。冰凍干燥機的國產(chǎn)品牌近年來發(fā)展很快，如北京的軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生產(chǎn)的小型、中型和大型工業(yè)用冰干機，已可以取代昂貴的進口產(chǎn)品。冰凍干燥操作十分簡單，但以下的注意事項卻必須認真記?。海?）樣品溶液（2）樣品溶液的容器（3）溶液冰凍（4）凍干2. 7 固相萃取與固相微萃取固相萃?。⊿oli

42、d Phase Extraction SPE）是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達到分離和富集目標化合物的目的。與液液萃取相比，固相萃取有很多優(yōu)點：固相萃取不需要大量互不相溶的溶劑，處理過程中不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，它采用高效高選擇性的吸附劑（固定相），能顯著減少溶劑的用量，簡化樣品于處理過程，同時所需費用也有所減少。一般說來固相萃取所需時間為液液萃取的1/2，費用為液液萃取的1/5。其缺點是：目標化合物的回收率和精密度要低于液液萃取。SPE可用于氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC）、紅外光譜（IR）、質(zhì)譜（MS）、核磁

43、共振（NMR）、紫外可見光譜（UV/VIS）和原子吸收（AAS）等各種分析方法的樣品預(yù)處理。SPE在較復(fù)雜的有機化合物分析方面有著廣闊的發(fā)展前景。2. 7. 1 固相萃取的模式及原理固相萃取實質(zhì)上是一種液相色譜分離，其主要分離模式也與液相色譜相同，可分為正相（吸附劑極性大于洗脫液極性），反相（吸附劑極性小于洗脫液極性），離子交換等幾種類型。固相萃取所用的吸附劑也與液相色譜常用的固定相相同，只是在粒度上有所區(qū)別。正相固相萃取所用的吸附劑都是極性的，用來萃取（保留）極性物質(zhì)。在正相萃取時，目標化合物在保留吸附劑上的保留程度取決于目標化合物的極性官能團與吸附劑表面的極性官能團之間相互作用，其中包括了

44、氫鍵，鍵相互作用，偶極偶極相互作用和偶極誘導(dǎo)偶極相互作用以及其他的極性極性作用。正相固相萃取可以從非極性溶劑樣品中吸附極性化合物。反相固相萃取所用的吸附劑通常是非極性的或極性較弱的，所萃取的目標化合物通常是中等極性到非極性化合物。目標化合物與吸附劑間的作用是疏水性相互作用，主要是非極性非極性相互作用，是范德華力或色散力。離子交換固相萃取所用的吸附劑是帶有電荷的離子交換樹脂，所萃取的目標化合物是帶有電荷的化合物，目標化合物與吸附劑之間的相互作用是靜電吸引力。2. 7. 2 固相萃取常用的吸附劑鑒于固相萃取實質(zhì)上是一種液相色譜的分離，故原則上講，可作為液相色譜柱填料的材料都可用于固相萃取。固相萃取

45、中吸附劑（固定相）的選擇主要是根據(jù)目標化合物的性質(zhì)和樣品基體（即樣品的溶劑）性質(zhì)。目標化合物的極性與吸附劑的極性非常相似的時，可以得到目標化合物的最佳保留（最佳吸附）。兩者極性越相似，保留越好（即吸附越好），所以要盡量選擇與目標化合物極性相似的吸附劑。例如：萃取碳氫化合物（非極性）時，要采用反相固相萃?。ù藭r是非極性吸附劑）。當(dāng)目標化合物極性適中時，正反相固相萃取都可使用。吸附劑的選擇還要受樣品的溶劑強度（即洗脫強度）的制約。樣品溶劑的強度相對該吸附劑應(yīng)該是較弱的，弱溶劑會增強目標化合物在吸附劑上的保留（吸附）。溶劑強度在正反固相萃取中的順序是不同的。如果樣品溶劑的強度太強，目標化合物將得不到保留（吸附）或保留很弱。例如：樣品溶劑是正己烷時用反相固相萃取就不合適了，因為正己烷對反相固相萃取是強溶劑，目標化合物將不會吸附在吸附劑上；當(dāng)樣品溶劑是水時就可以用反相固相萃取，因為水對反相固相萃取是弱溶劑