酶工程：第三章 酶的提取與分離純化

1、第三章第三章 酶的提取與分離純化酶的提取與分離純化 一、酶的純化的一般原則一、酶的純化的一般原則 l（1）分離純化用的原料來源要方便，成本要低，目的蛋白含量、活）分離純化用的原料來源要方便，成本要低，目的蛋白含量、活 性相對要高，可溶性和穩(wěn)定性要好；性相對要高，可溶性和穩(wěn)定性要好； l（2）提取條件盡可能溫和，盡快、盡可能多地去除雜質(zhì)；）提取條件盡可能溫和，盡快、盡可能多地去除雜質(zhì)； l（3）建立靈敏、精確的檢測手段，判斷目標(biāo)酶的產(chǎn)率、活性與純度；）建立靈敏、精確的檢測手段，判斷目標(biāo)酶的產(chǎn)率、活性與純度； l（4）純化策略的選擇依酶的性質(zhì)來選用，應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單）純化策略的選擇依酶的性質(zhì)

2、來選用，應(yīng)選擇不同機(jī)制的分離單 元組成一套工藝，一般先采用非特異、低分辨的操作單元，如沉淀、元組成一套工藝，一般先采用非特異、低分辨的操作單元，如沉淀、 超濾等，盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)品濃度，去除最主要的雜質(zhì)；然超濾等，盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)品濃度，去除最主要的雜質(zhì)；然 后是高分辨的操作單元。后是高分辨的操作單元。 1.1 1.1 酶的提取、分離純化技術(shù)路線酶的提取、分離純化技術(shù)路線 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 酶提取酶提取 酶分離純化酶分離純化 酶濃縮酶濃縮 酶貯存酶貯存 動物、植物或微生物細(xì)胞動物、植物或微生物細(xì)胞 發(fā)酵液發(fā)酵液 離心分離，過濾分離，沉淀分離心分離，過濾分離，沉淀分 離，層析分離

3、，電泳分離，萃離，層析分離，電泳分離，萃 取分離，結(jié)晶分離等。取分離，結(jié)晶分離等。 酶酶的純化過程，約可分為的純化過程，約可分為 三三個階段個階段： (1) (1) 粗粗蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) (crude (crude protein): protein): 采樣采樣 均均質(zhì)質(zhì) 打破細(xì)胞打破細(xì)胞 抽出全蛋白，抽出全蛋白， 多使用多使用 鹽析沉淀法鹽析沉淀法；可；可 以粗略去除蛋白質(zhì)以外的以粗略去除蛋白質(zhì)以外的 物質(zhì)。物質(zhì)。 (2) (2) 部分純化部分純化 (partially purified): (partially purified): 初步的純化，使用各種初步的純化，使用各種柱柱 層析法層析法

4、。 (3) (3) 均均質(zhì)酶質(zhì)酶 (homogeneous): (homogeneous): 目標(biāo)酶目標(biāo)酶 的的進(jìn)進(jìn)一步精制純化，可用一步精制純化，可用 制備式電泳制備式電泳或或 HPLCHPLC。 酶分離純化不同階段 本章 目錄 在酶的分離純化前，通常必須知道酶的以下性質(zhì)：在酶的分離純化前，通常必須知道酶的以下性質(zhì)： 1. 分子質(zhì)量（分子質(zhì)量（MW）：）：可用可用SDS-PAGE測定；測定； 2. 等電點(diǎn)（等電點(diǎn)（pI）：）：即蛋白質(zhì)靜電荷為零時(shí)的即蛋白質(zhì)靜電荷為零時(shí)的pH。可通過等電聚焦電泳法?？赏ㄟ^等電聚焦電泳法 測定；測定； 3. 輔因子：輔因子：避免丟失；避免丟失； 4. pH范圍：

5、范圍：酶的純化必須在酶穩(wěn)定的酶的純化必須在酶穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)進(jìn)行。范圍內(nèi)進(jìn)行。 分離純化過程中，每步都必須做三件事：分離純化過程中，每步都必須做三件事： （1）測定酶總活力（）測定酶總活力（IU/mL）；）； （2）蛋白質(zhì)含量（）蛋白質(zhì)含量（mg/mL）；）； （3）測總體積（）測總體積（mL） u 酶活力的測定酶活力的測定 l 定性鑒定提取物中某一酶是否存在，一般是根據(jù)此酶定性鑒定提取物中某一酶是否存在，一般是根據(jù)此酶 引起的化學(xué)反應(yīng)來判斷。引起的化學(xué)反應(yīng)來判斷。 l酶活力的測定：酶活力的測定：實(shí)際上是酶定量測定的方法，酶制劑因?qū)嶋H上是酶定量測定的方法，酶制劑因 含雜質(zhì)多易失活等原因，故不能

6、用稱重或測量體積來定含雜質(zhì)多易失活等原因，故不能用稱重或測量體積來定 量。量。 （一）酶活力的概念（一）酶活力的概念 l 指酶催化特定化學(xué)反應(yīng)的能力。指酶催化特定化學(xué)反應(yīng)的能力。其大小通常用在一定條件其大小通常用在一定條件 下酶催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的速度來表示。一定量的酶制劑催下酶催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的速度來表示。一定量的酶制劑催 化某一化學(xué)反應(yīng)速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法化某一化學(xué)反應(yīng)速度快，活力大；反之，活力小。速度表示法 常用常用-dS/dt或或dP/dt，測初速度，多用后者測初速度，多用后者（why？）。？）。 （二）酶的活力單位（二）酶的活力單位 l酶的國際單位（酶的國際

7、單位（IU）規(guī)定為：）規(guī)定為：在最適反應(yīng)條件（溫度在最適反應(yīng)條件（溫度25）下，）下， 每分鐘內(nèi)催化每分鐘內(nèi)催化1微摩爾（微摩爾（mol）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量（或）底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量（或1 分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成分鐘內(nèi)轉(zhuǎn)化底物生成1微摩爾產(chǎn)物的酶量）稱為微摩爾產(chǎn)物的酶量）稱為1標(biāo)準(zhǔn)單位。標(biāo)準(zhǔn)單位。 l測定條件：最佳的反應(yīng)條件，如最適的測定條件：最佳的反應(yīng)條件，如最適的Tm（或（或25）、）、pHm、S E、 初速度下。初速度下。 l1972年國際生化協(xié)會為了與國際單位制的反應(yīng)速率一致，又推薦一種新年國際生化協(xié)會為了與國際單位制的反應(yīng)速率一致，又推薦一種新 單位，即單位，即Katal(Ka

8、t)單位單位。規(guī)定：。規(guī)定：在最適溫度下，每秒鐘能催化在最適溫度下，每秒鐘能催化1摩爾底摩爾底 物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量定義為物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量定義為1 Kat。1 Kat=6107 IU. （三）酶的比活力（三）酶的比活力 l每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。每單位酶蛋白所含的活力單位數(shù)。 l對固體酶：用活力單位對固體酶：用活力單位/毫克酶蛋白、或活力單位毫克酶蛋白、或活力單位/毫克酶蛋白毫克酶蛋白 來表示；對液體酶：用活力單位來表示；對液體酶：用活力單位/毫升酶液來表示。毫升酶液來表示。 l很明顯，比活力越大，酶的活力越大。很明顯，比活力越大，酶的活力越大。 （四）酶反應(yīng)條件的設(shè)計(jì)（四）

9、酶反應(yīng)條件的設(shè)計(jì) l1. 初速度初速度 l2. 底物濃度底物濃度 l3. pH值值 l4. 溫度溫度 l5. 樣品（有無干擾因素）樣品（有無干擾因素） l6. 空白和對照空白和對照 （五）酶活力的測定方法（五）酶活力的測定方法 l1、分光光度法：、分光光度法：產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑生成有色物質(zhì)或產(chǎn)物與適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑生成有色物質(zhì)或 產(chǎn)物有紫外吸收的能力可采用此法（包括酶聯(lián)測定法）。產(chǎn)物有紫外吸收的能力可采用此法（包括酶聯(lián)測定法）。 l2、測壓法：、測壓法：產(chǎn)物中有氣體，測氣壓增加量。產(chǎn)物中有氣體，測氣壓增加量。 l3、滴定法：、滴定法：產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。產(chǎn)物中有酸生成，用堿滴定。 l4、熒

10、光法：、熒光法：產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑反產(chǎn)物中有熒光物質(zhì)生成或產(chǎn)物與熒光試劑反 應(yīng)生成熒光產(chǎn)物可用此法。應(yīng)生成熒光產(chǎn)物可用此法。 l5、旋光法：、旋光法：產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。產(chǎn)物中有旋光物質(zhì)可采用此法。 1.2 細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎 許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。許多酶存在于細(xì)胞內(nèi)。 為了提取這些胞內(nèi)酶，為了提取這些胞內(nèi)酶， 首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破首先需要對細(xì)胞進(jìn)行破 碎處理。碎處理。 1）機(jī)械破碎）機(jī)械破碎 2）物理破碎）物理破碎 3）化學(xué)破碎）化學(xué)破碎 4）酶解破碎）酶解破碎 JY92-II D超聲波超聲波 細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞粉碎機(jī) 細(xì)胞破碎珠細(xì)胞破碎珠 高壓細(xì)胞破碎機(jī)高壓細(xì)胞破碎機(jī) D

11、Y89-I型型 電動玻璃勻漿機(jī)電動玻璃勻漿機(jī) 機(jī)械破碎機(jī)械破碎 搗碎法搗碎法 研磨法研磨法 勻漿法勻漿法 物理破碎物理破碎 溫度差破碎法溫度差破碎法 壓力差破碎法壓力差破碎法 超聲波破碎法超聲波破碎法 化學(xué)破碎化學(xué)破碎 有機(jī)溶劑：有機(jī)溶劑： 甲苯、丙酮甲苯、丙酮 丁醇、氯仿丁醇、氯仿 表面活性劑：表面活性劑： Triton、Tween 酶促破碎酶促破碎 自溶法自溶法 外加酶制劑法外加酶制劑法 通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切通過機(jī)械運(yùn)動產(chǎn)生的剪切 力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。 通過各種物理因素的作用，通過各種物理因素的作用， 使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破 壞，而使細(xì)胞

12、破碎。壞，而使細(xì)胞破碎。 通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞通過各種化學(xué)試劑對細(xì)胞 膜的作用，而使細(xì)胞破碎膜的作用，而使細(xì)胞破碎 通過細(xì)胞本身的酶系或外通過細(xì)胞本身的酶系或外 加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使 細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞， 而達(dá)到細(xì)胞破碎而達(dá)到細(xì)胞破碎 細(xì)胞破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理 l 酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗该傅奶崛∈侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗?原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。原料，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。 l 酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的

13、結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┟傅慕Y(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性 的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性 溶劑中。溶劑中。 l 大多酶都能溶解于水，通?？捎么蠖嗝付寄苋芙庥谒?，通常可用水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等水或稀酸、稀堿、稀鹽溶液等 進(jìn)行提取進(jìn)行提取。有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有。有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有 機(jī)溶劑提取。機(jī)溶劑提取。 1.3 1.3 酶的

14、提取酶的提取 提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、增大濃度差提高溫度，降低溶液粘度、增加擴(kuò)散面積、增大濃度差等都有利等都有利 于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。于提高酶分子的擴(kuò)散速度，從而增大提取效果。 為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還為了提高酶的提取率并防止酶的變性失活，在提取過程中還 要注意控制好溫度、要注意控制好溫度、pHpH值等提取條件。值等提取條件。 l（一）（一）pH l（1）首先考慮酶的穩(wěn)定性，選用的）首先考慮酶的穩(wěn)定性，選用的pH不超過酶的酸堿穩(wěn)定范圍。不超過酶的酸堿穩(wěn)定范圍。 l（2）從提取效果來看，最好遠(yuǎn)離酶的）從提取效果來看，最好遠(yuǎn)離酶的pI

15、，即酸性酶蛋白用堿性，即酸性酶蛋白用堿性 提取液，反之相反。提取液，反之相反。 （二）鹽（二）鹽 一般采用低濃度鹽溶液。如一般采用低濃度鹽溶液。如0.02-0.05mol/L的磷酸緩沖液。的磷酸緩沖液。 （三）溫度（三）溫度 通?？刂圃谕ǔ？刂圃?-4左右。如果酶比較穩(wěn)定時(shí)，可以例外。如胃蛋白酶可能左右。如果酶比較穩(wěn)定時(shí)，可以例外。如胃蛋白酶可能 性在性在37下保溫抽提。酶和雜蛋白下保溫抽提。酶和雜蛋白 （四）抽提液用量（四）抽提液用量 一般為材料的一般為材料的3-5倍。倍。 （五）其他（五）其他 細(xì)胞破碎后，有些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損傷。同時(shí)一些不穩(wěn)定因素也釋放出細(xì)胞破碎后，有些亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損傷

16、。同時(shí)一些不穩(wěn)定因素也釋放出 來了，因此（來了，因此（1）加入蛋白酶抑制劑；（）加入蛋白酶抑制劑；（2）抗氧化劑；（）抗氧化劑；（3）穩(wěn)定劑；）穩(wěn)定劑； （4）活性保護(hù)劑如底物等。）活性保護(hù)劑如底物等。 酶的主要提取方法酶的主要提取方法 提取方法提取方法使用的溶劑或溶液使用的溶劑或溶液提取對象提取對象 鹽溶液提取鹽溶液提取0.020.020.5mol/L0.5mol/L的鹽溶的鹽溶 液液 用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度 較大的酶較大的酶 酸溶液提取酸溶液提取PH2PH26 6的水溶液的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且穩(wěn)定性較好

17、的酶且穩(wěn)定性較好的酶 堿溶液提取堿溶液提取PH8PH81212的水溶液的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且用于提取在稀堿溶液中溶解度大且 穩(wěn)定性較好的酶穩(wěn)定性較好的酶 有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取可與水混溶的有機(jī)溶劑可與水混溶的有機(jī)溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含 有較多非極性基團(tuán)的酶有較多非極性基團(tuán)的酶 大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而 且在低濃度的鹽存在的條件下，且在低濃度的鹽存在的條件下， 酶的溶解度隨鹽濃度的升高而酶的溶解度隨鹽濃度的升高而 增加，這稱為增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象鹽溶現(xiàn)象。 不同的酶，其溶解度、分子大小、形狀、電荷性質(zhì)、專不同

18、的酶，其溶解度、分子大小、形狀、電荷性質(zhì)、專 一結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)有差異。純化依據(jù)：一結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)有差異。純化依據(jù)： 1）酶和雜蛋白解離或溶解度性質(zhì)的差異；）酶和雜蛋白解離或溶解度性質(zhì)的差異； 2）酶和雜蛋白在兩相中的分配性質(zhì)差異；）酶和雜蛋白在兩相中的分配性質(zhì)差異； 3）分子大小和形狀差異；）分子大小和形狀差異； 4）電荷性質(zhì)的差異；）電荷性質(zhì)的差異； 5）穩(wěn)定性的差異；）穩(wěn)定性的差異； 6）酶和底物、輔助物質(zhì)及抑制劑間具有相互親和作用）酶和底物、輔助物質(zhì)及抑制劑間具有相互親和作用 的特點(diǎn)。的特點(diǎn)。 1.4 酶的純化酶的純化 常見的常見的純化方法：純化方法： 1、沉淀分離 2、離心分離 3、過

19、濾與膜分離 4、層析分離 Go Go Go Go 5、電泳分離Go 6、萃取分離Go 評價(jià)純化方法好壞的指標(biāo)有兩個：評價(jià)純化方法好壞的指標(biāo)有兩個：一一 是總活力的回收率；二是比活力提高是總活力的回收率；二是比活力提高 的倍數(shù)。的倍數(shù)。 總活力的回收率反映了純化過程酶活總活力的回收率反映了純化過程酶活 力的損失情況；比活力的提高倍數(shù)反力的損失情況；比活力的提高倍數(shù)反 映了純化方法的效率。映了純化方法的效率。 1 1、沉淀分離、沉淀分離 沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解溶解 度降低度降低，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。與其它溶質(zhì)分離的

20、技術(shù)過程。 沉淀分離方法沉淀分離方法分離原理分離原理 鹽析沉淀法鹽析沉淀法利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過利用不同蛋白質(zhì)在不同的鹽濃度條件下溶解度不同的特性，通過 在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀，在酶液中添加一定濃度的中性鹽，使酶或雜質(zhì)從溶液中析出沉淀， 從而使酶與雜質(zhì)分離（從而使酶與雜質(zhì)分離（改變離子強(qiáng)度改變離子強(qiáng)度） 等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì)利用兩性電解質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低，以及不同的兩性電解質(zhì) 有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過有不同的等電點(diǎn)這一特性，通過調(diào)節(jié)溶液的調(diào)節(jié)溶液的pHpH值值

21、，使酶或雜質(zhì)沉，使酶或雜質(zhì)沉 淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離 有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量利用酶與其它雜質(zhì)在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，通過添加一定量 的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離的某種有機(jī)溶劑，使酶或雜質(zhì)沉淀析出，從而使酶與雜質(zhì)分離 （改變介電常數(shù)改變介電常數(shù)） 復(fù)合沉淀法復(fù)合沉淀法在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而在酶液中加入某些物質(zhì)，使它與酶形成復(fù)合物而沉淀下來，從而 使酶與雜質(zhì)分離使酶與雜質(zhì)分離 選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變

22、性沉淀，而不影響所選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所 需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離需的酶，從而使酶與雜質(zhì)分離 在鹽濃度達(dá)到某一界在鹽濃度達(dá)到某一界 限后，酶的溶解度隨限后，酶的溶解度隨 鹽濃度升高而降低，鹽濃度升高而降低， 這稱為這稱為鹽析現(xiàn)象。鹽析現(xiàn)象。 對于含有多種酶或蛋白質(zhì)的混合液，可以采用分段鹽析的方法進(jìn)行分離純化。對于含有多種酶或蛋白質(zhì)的混合液，可以采用分段鹽析的方法進(jìn)行分離純化。 在一定的溫度和在一定的溫度和pHpH值條件下（值條件下（為常數(shù)），通過改變離子強(qiáng)度使不為常數(shù)），通過改變離子強(qiáng)度使不 同的酶蛋白分離的方法稱為同的酶蛋白分離的方法稱為KsKs分段鹽析分

23、段鹽析；而在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條；而在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條 件下（件下（KsKsI I為常數(shù)），通過改變溫度和為常數(shù)），通過改變溫度和pHpH值，使不同的酶蛋白分離的方值，使不同的酶蛋白分離的方 法，稱為法，稱為分段鹽析分段鹽析。 在酶蛋白的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、在酶蛋白的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、硫酸鉀、 硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中硫酸鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在。這是由于硫酸銨在 水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分

24、離效果好，而且價(jià) 廉易得。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會廉易得。然而用硫酸銨進(jìn)行鹽析時(shí)，緩沖能力較差，而且銨離子的存在會 干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。干擾蛋白質(zhì)的測定，所以有時(shí)也用其它中性鹽進(jìn)行鹽析。 在鹽析時(shí)，溶液中硫酸銨的濃度通常以在鹽析時(shí)，溶液中硫酸銨的濃度通常以飽和度飽和度表示。表示。 硫酸銨反抽提法：將要分離的酶在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)一起先沉淀出來，然后硫酸銨反抽提法：將要分離的酶在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)一起先沉淀出來，然后 選擇適當(dāng)遞減濃度的硫酸銨溶液來抽提沉淀物。其優(yōu)點(diǎn)在于多種蛋白質(zhì)從選擇適當(dāng)遞減濃度的硫酸銨溶液來抽提沉淀物。其優(yōu)點(diǎn)在于多種蛋白質(zhì)

25、從 溶液中沉淀析出，是非特異性的，而沉淀在溶液中溶解卻是特異性的。在溶液中沉淀析出，是非特異性的，而沉淀在溶液中溶解卻是特異性的。在 提取容易失活的酶的時(shí)候比分級沉淀更具優(yōu)越性。提取容易失活的酶的時(shí)候比分級沉淀更具優(yōu)越性。 有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在有機(jī)溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機(jī)溶劑的存在 會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，2020時(shí)水的介電常數(shù)為時(shí)水的介電常數(shù)為8080，而，而 8282乙醇水溶液的介電常數(shù)為乙醇水溶液的介電常數(shù)為4040。溶液的介電常數(shù)降低，就使溶溶液的介電常數(shù)降低，就使溶 質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引

26、而易于凝集，同時(shí)，對于具質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時(shí)，對于具 有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的有水膜的分子來說，有機(jī)溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的 水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等。乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等。 2 2、離心分離、離心分離 離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使 不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。 在離心分

27、離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆顆 粒大小、密度和特性的不同粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離 心方法和離心條件。心方法和離心條件。 常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī)常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī), 其最大轉(zhuǎn)速在其最大轉(zhuǎn)速在8000 r/min以內(nèi)，以內(nèi)， 相對離心力（相對離心力（RCF）在）在1104 g 以下，在酶的分離純化過程中，以下，在酶的分離純化過程中， 主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于 酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。

28、 高速離心機(jī)高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為（的最大轉(zhuǎn)速為（12.5）104 r/min ，相對離心力達(dá)，相對離心力達(dá) 到到 11041105 g ，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和 細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的溫度升高而造成酶的 變性失活變性失活,有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置,謂之高速冷凍離心機(jī)。謂之高速冷凍離心機(jī)。 超速離心機(jī)超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)的最大轉(zhuǎn)速達(dá) (2.512)104 r/min，相對離心力可以，相對離心力可以 高達(dá)高達(dá) 5105 g甚至更高。超速離

29、心主要用于甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì) 等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測；等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測； 沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。 3 3、過濾與膜分離、過濾與膜分離 過濾過濾是借助于是借助于過濾介質(zhì)過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。 過濾介質(zhì)多種多樣，常用的過濾介質(zhì)多種多樣，常用的 有濾紙、濾布、纖維、多孔陶有濾紙、濾布、纖維、多孔陶 瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜 等，可以根據(jù)需要選用。等，可

30、以根據(jù)需要選用。 過濾過濾 非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì) 膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì) 過濾的分類及其特性過濾的分類及其特性 ( (根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同 ) ) 類別類別截留顆粒大小截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)過濾介質(zhì) 粗濾粗濾 2m 2m酵母、霉菌、動物細(xì)胞、酵母、霉菌、動物細(xì)胞、 植物細(xì)胞、固形物等植物細(xì)胞、固形物等 濾紙、濾布、纖維濾紙、濾布、纖維 多孔陶瓷、燒結(jié)金多孔陶瓷、燒結(jié)金 屬等屬等 微濾微濾0.20.22m2m細(xì)

31、菌、灰塵等細(xì)菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷微濾膜、微孔陶瓷 超濾超濾20200.2m0.2m病毒、生物大分子等病毒、生物大分子等超濾膜超濾膜 反滲透反滲透 20 20生物小分子、鹽、離子生物小分子、鹽、離子反滲透膜反滲透膜 借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和 不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)膜分離技術(shù)。 膜分離膜分離 加壓膜分離加壓膜分離 微濾微濾 超濾超濾 反滲透反滲透 電場膜分離電場膜分離 電滲析電滲析 離子交換膜電滲析離子交換膜電滲析 擴(kuò)散膜分離擴(kuò)散膜分離 透析透析

32、 膜分離所使用的薄膜主要是由膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈丙烯腈、醋酸纖維素醋酸纖維素、賽璐賽璐 玢玢以及以及尼龍尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用 動物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔動物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔 徑的物質(zhì)顆粒或分子通過，而把大于其孔徑的顆粒截留。徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。 四種常用膜分離過程的截留特性四種常用膜分離過程的截留特性 4 4、層析分離、層析分離 層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方

33、法。它是利用利用 混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分以不同程度分布 在兩個相中，其中一個相為固定的在兩個相中，其中一個相為固定的( (稱為固定相稱為固定相) )，另一個相則流過，另一個相則流過 此固定相此固定相( (稱為流動相稱為流動相) )并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離。并使各組分以不同速度移動，從而達(dá)到分離。 層析分離方法層析分離方法 層析方法層析方法分離依據(jù)分離依據(jù) 吸附層析吸附層析 利用吸附劑對不同物質(zhì)的利用吸附劑對不同物質(zhì)的吸附力吸附力不同而使混合物中各組分不同而使混合物中各組分 分離分離 分配層析分配層析

34、利用各組分在兩相中的利用各組分在兩相中的分配系數(shù)分配系數(shù)不同，而使各組分分離不同，而使各組分分離 離子交換層析離子交換層析 利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對各種離子 的的親和力親和力不同而達(dá)到分離目的不同而達(dá)到分離目的 凝膠層析凝膠層析 以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的以各種多孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各種組分的 相對分子質(zhì)量相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離不同而達(dá)到物質(zhì)分離 親和層析親和層析 利用生物分子與配基之間所具有的利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力專一而又可逆的親和力， 使生物分子分離純

35、化使生物分子分離純化 層析聚焦層析聚焦 將酶等兩性物質(zhì)的將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性等電點(diǎn)特性與離子交換層析的特性結(jié)合與離子交換層析的特性結(jié)合 在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離 吸附層析吸附層析是利用吸附劑對不同物質(zhì)是利用吸附劑對不同物質(zhì) 的吸附力不同而使混合物中各組分分的吸附力不同而使混合物中各組分分 離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù) 中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、中應(yīng)用最早的技術(shù)。吸附劑來源豐富、 價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡單。價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡單。 吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑 裝在吸附柱中，裝

36、置成裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。吸附層析柱。 層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加 入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后， 再加入洗脫劑解吸洗脫。再加入洗脫劑解吸洗脫。 在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸 附、再解吸、再吸附的過程。附、再解吸、再吸附的過程。 分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組 分分離的方法。分分離的方法。 分配系數(shù)分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到 平衡時(shí)

37、，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確 定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。 在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、 硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相固定相，這種溶劑在層析，這種溶劑在層析 過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相 溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相流動相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動相 的帶動流經(jīng)固定

38、相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)分配。的帶動流經(jīng)固定相時(shí)，該溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動態(tài)分配。 紙上層析紙上層析 分配薄層層析分配薄層層析 分配氣相層析分配氣相層析 離子交換層析離子交換層析是利用離子交換是利用離子交換 劑上的劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)） 對各種離子的親和力不同而達(dá)到對各種離子的親和力不同而達(dá)到 分離分離目的的一種層析分離方法。目的的一種層析分離方法。 離子交換劑離子交換劑是含有若干活性是含有若干活性 基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過 在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上 引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）引入若

39、干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)） 而制成。而制成。 按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離 子交換劑可以分為子交換劑可以分為陽離子交換劑陽離子交換劑 和和陰離子交換劑陰離子交換劑。 l在溶液的在溶液的pH值大于酶的等電點(diǎn)時(shí)，酶分子帶負(fù)電值大于酶的等電點(diǎn)時(shí)，酶分子帶負(fù)電 荷，可用陰離子交換劑進(jìn)行層析分離；荷，可用陰離子交換劑進(jìn)行層析分離； l當(dāng)溶液當(dāng)溶液pH值小于酶的等電點(diǎn)時(shí)，酶分子帶正電荷，值小于酶的等電點(diǎn)時(shí)，酶分子帶正電荷， 則要采用陽離子交換劑進(jìn)行分離。則要采用陽離子交換劑進(jìn)行分離。 凝膠層析凝膠層析又稱為又稱為凝膠過濾凝膠過濾，分子排分子排 阻層析阻層析，分子篩層析分子篩層析等。是指以

40、各種多等。是指以各種多 孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各孔凝膠為固定相，利用流動相中所含各 種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)種組分的相對分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì) 分離的一種層析技術(shù)。分離的一種層析技術(shù)。 凝膠層析柱中裝有凝膠層析柱中裝有多孔凝膠多孔凝膠，當(dāng)含，當(dāng)含 有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱 時(shí)，由于凝膠的微孔，這就使時(shí)，由于凝膠的微孔，這就使小分子物小分子物 質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢， 從而使混合溶液中各組分按照相對分子從而使混合溶液中各組分按照相對分子 質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，質(zhì)量由大到小的順序

41、先后流出層析柱， 而達(dá)到分離的目的而達(dá)到分離的目的。 常用的凝膠：常用的凝膠： 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠 瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠瓊脂凝膠與瓊脂糖凝膠 聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠 親和層析親和層析是利用生物分子與配基之是利用生物分子與配基之 間所具有的專一而又可逆的親和力，而間所具有的專一而又可逆的親和力，而 使生物分子分離純化的技術(shù)。使生物分子分離純化的技術(shù)。 酶與底物酶與底物,酶與競爭性抑制劑酶與競爭性抑制劑,酶與酶與 輔助因子輔助因子,抗原與抗體抗原與抗體，酶酶RNARNA與互補(bǔ)的與互補(bǔ)的 RNARNA分子或片段分子或片段,RNARNA與互補(bǔ)的與互補(bǔ)的DNADNA分子或分子或 片段片段等之間，

42、都是具有專一而又可逆親等之間，都是具有專一而又可逆親 和力的生物分子對。和力的生物分子對。親和層析在酶的純親和層析在酶的純 化中有重要應(yīng)用?；杏兄匾獞?yīng)用。 親和層析的四個要素親和層析的四個要素 層析聚焦層析聚焦是將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與柱層析是將酶等兩性物質(zhì)的等電點(diǎn)特性與柱層析 的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的技術(shù)。的特性結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)組分分離的技術(shù)。 在層析系統(tǒng)中，柱內(nèi)裝上多緩沖離子交換劑，當(dāng)加在層析系統(tǒng)中，柱內(nèi)裝上多緩沖離子交換劑，當(dāng)加 進(jìn)兩性電解質(zhì)載體的多緩沖溶液流過層析柱時(shí)，在層進(jìn)兩性電解質(zhì)載體的多緩沖溶液流過層析柱時(shí)，在層 析柱內(nèi)形成穩(wěn)定的析柱內(nèi)形成穩(wěn)定的pH梯度。梯度。 欲

43、分離酶液中的各個組分欲分離酶液中的各個組分 在此系統(tǒng)中會移動到在此系統(tǒng)中會移動到(聚焦于聚焦于)與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)呐c其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位位 置上，從而使不同等電點(diǎn)的組分得以分離。置上，從而使不同等電點(diǎn)的組分得以分離。 連續(xù)色譜連續(xù)色譜 12345 飽和樹脂柱飽和樹脂柱 新鮮樹脂柱新鮮樹脂柱 進(jìn)料進(jìn)料 排除物排除物 5 5、電泳分離、電泳分離 帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極帶電粒子在電場中向著與其本身所帶電荷相反的電極 移動的過程稱為電泳。移動的過程稱為電泳。 電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為：電泳方法按其使用的支持體的不同，可以分為： 紙電泳紙電泳 薄層電泳薄層電泳 薄膜

44、電泳薄膜電泳 凝膠電泳凝膠電泳 自由電泳自由電泳 等電聚焦電泳等電聚焦電泳 顆粒在電場中的移動速度主要決定于其顆粒在電場中的移動速度主要決定于其 本身所帶的凈電荷量本身所帶的凈電荷量，同時(shí)受，同時(shí)受顆粒形狀顆粒形狀和和顆顆 粒大小粒大小的影響。此外，還受到的影響。此外，還受到電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度、溶溶 液液pH值值、離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度及及支持體的特性支持體的特性等外界等外界 條件的影響。條件的影響。 6 6、萃取分離、萃取分離 萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的萃取分離是利用物質(zhì)在兩相中的溶解度不同而使其分離的 技術(shù)。萃取分離中的兩相一般為互不相溶的兩個液相。有時(shí)技術(shù)。萃取分離中的兩

45、相一般為互不相溶的兩個液相。有時(shí) 也可采用其它流體。也可采用其它流體。 按照兩相的組成不同，萃取可以分為：按照兩相的組成不同，萃取可以分為： 有機(jī)溶劑萃取有機(jī)溶劑萃取 雙水相萃取雙水相萃取 超臨界萃取超臨界萃取 反膠束萃取反膠束萃取 7.5 酶的組合分離純化策略酶的組合分離純化策略 Resolution（分辨率）（分辨率） Speed（速度）（速度）Capacity（容量）（容量） Recovery（回收率）（回收率） 設(shè)計(jì)分離純化工藝的基本要求設(shè)計(jì)分離純化工藝的基本要求 l（1）避免局部過酸過堿；低溫；防止泡沫形成；重金屬；避免局部過酸過堿；低溫；防止泡沫形成；重金屬； 微生物污染；蛋白酶等

46、；微生物污染；蛋白酶等； l（2）一般情況下，不要連續(xù)使用同一步驟或同種方法；）一般情況下，不要連續(xù)使用同一步驟或同種方法； l（3）在造成酶被稀釋的步驟后面要用濃縮酶的方法，如）在造成酶被稀釋的步驟后面要用濃縮酶的方法，如 沉淀法、反滲透等；沉淀法、反滲透等； l（4）每步過程的分辨能力呈遞增趨勢。）每步過程的分辨能力呈遞增趨勢。 純化要注意：純化要注意： 本章 目錄 7.6 7.6 酶的濃縮、干燥與結(jié)晶酶的濃縮、干燥與結(jié)晶 濃縮與干燥都是酶與溶劑（通常是水）分離的過程。在酶濃縮與干燥都是酶與溶劑（通常是水）分離的過程。在酶 的分離純化過程中是一個重要的環(huán)節(jié)。的分離純化過程中是一個重要的環(huán)節(jié)

47、。 離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分離等都能起 到濃縮作用。用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等到濃縮作用。用各種吸水劑，如硅膠、聚乙二醇、干燥凝膠等 吸去水分，也可以達(dá)到濃縮效果。吸去水分，也可以達(dá)到濃縮效果。 蒸發(fā)濃縮是通過加熱或者減壓方法使溶液中的部分溶劑汽蒸發(fā)濃縮是通過加熱或者減壓方法使溶液中的部分溶劑汽 化蒸發(fā)，使溶液得以濃縮的過程。由于酶在高溫條件下不穩(wěn)定，化蒸發(fā)，使溶液得以濃縮的過程。由于酶在高溫條件下不穩(wěn)定， 容易變性失活，故酶液的濃縮通常采用容易變性失活，故酶液的濃縮通常采用真空濃縮真空濃縮。即在一定的。即在一定

48、的 真空條件下，使酶液在真空條件下，使酶液在6060以下進(jìn)行濃縮。以下進(jìn)行濃縮。 在固體酶制劑的生產(chǎn)過程在固體酶制劑的生產(chǎn)過程 中，為了提高酶的穩(wěn)定性，中，為了提高酶的穩(wěn)定性， 便于保存、運(yùn)輸和使用，便于保存、運(yùn)輸和使用， 一般都必須進(jìn)行干燥。常一般都必須進(jìn)行干燥。常 用的干燥方法有：用的干燥方法有： 真空干燥真空干燥 冷凍干燥冷凍干燥 噴霧干燥噴霧干燥 氣流干燥氣流干燥 吸附干燥吸附干燥 l酶在干燥過程中的穩(wěn)定性是酶應(yīng)用中的一個問酶在干燥過程中的穩(wěn)定性是酶應(yīng)用中的一個問 題，對于飼料加工過程中溫度和擠壓對酶活性題，對于飼料加工過程中溫度和擠壓對酶活性 的影響，目前已經(jīng)提出幾種方法：的影響，目

49、前已經(jīng)提出幾種方法：冷壓制粒、冷壓制粒、 載體吸附法、浸泡或濕拌料法、微囊包被技術(shù)、載體吸附法、浸泡或濕拌料法、微囊包被技術(shù)、 制粒后噴灑等，以提高酶活性和熱穩(wěn)定性制粒后噴灑等，以提高酶活性和熱穩(wěn)定性。 結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。酶的結(jié)晶是酶結(jié)晶是溶質(zhì)以晶體形式從溶液中析出的過程。酶的結(jié)晶是酶 分離純化的一種手段。它不僅為酶的結(jié)構(gòu)與功能等的研究提供分離純化的一種手段。它不僅為酶的結(jié)構(gòu)與功能等的研究提供 了適宜的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。了適宜的樣品，而且為較高純度的酶的獲得和應(yīng)用創(chuàng)造了條件。 酶在結(jié)晶之前，酶在結(jié)晶之前，酶液必須經(jīng)過純化達(dá)到一定的純度酶液必須

50、經(jīng)過純化達(dá)到一定的純度。如果酶。如果酶 液純度太低，不能進(jìn)行結(jié)晶。通常酶的純度應(yīng)當(dāng)在液純度太低，不能進(jìn)行結(jié)晶。通常酶的純度應(yīng)當(dāng)在50%50%以上，方以上，方 能進(jìn)行結(jié)晶。總的趨勢是酶的純度越高，越容易進(jìn)行結(jié)晶。能進(jìn)行結(jié)晶?？偟内厔菔敲傅募兌仍礁?，越容易進(jìn)行結(jié)晶。 要說明的是，不同的酶對結(jié)晶時(shí)的純度要求不同。要說明的是，不同的酶對結(jié)晶時(shí)的純度要求不同。 有些酶有些酶 在純度達(dá)到在純度達(dá)到50%50%時(shí)就可能結(jié)晶，而有些酶在純度很高的條件下也時(shí)就可能結(jié)晶，而有些酶在純度很高的條件下也 無法析出結(jié)晶。所以酶的結(jié)晶并非達(dá)到絕對純化，只是達(dá)到相無法析出結(jié)晶。所以酶的結(jié)晶并非達(dá)到絕對純化，只是達(dá)到相 當(dāng)?shù)?/p>

51、純度而已。當(dāng)?shù)募兌榷选?鹽析結(jié)晶鹽析結(jié)晶 有機(jī)溶劑結(jié)晶有機(jī)溶劑結(jié)晶 透析平衡結(jié)晶透析平衡結(jié)晶 等電點(diǎn)結(jié)晶等電點(diǎn)結(jié)晶 7.7 7.7 酶的保存酶的保存 防止微生物污染！防止微生物污染！ 酶的修飾，通過多種方法，使其在結(jié)構(gòu)上更穩(wěn)定或酶的修飾，通過多種方法，使其在結(jié)構(gòu)上更穩(wěn)定或 具有一定的抗氧化能力。具有一定的抗氧化能力。 如：配體親和柱保護(hù)酶的活性；添加如：配體親和柱保護(hù)酶的活性；添加輔助因子輔助因子保護(hù)保護(hù) 酶的活性。酶的活性。 1、如果酶需要在高于室溫下使用的話，可以加入一些起熱穩(wěn)定和熱激活作用的、如果酶需要在高于室溫下使用的話，可以加入一些起熱穩(wěn)定和熱激活作用的 海藻糖。海藻糖。 2 、酶在使用時(shí)候存在凍融情況下：可以選甘露醇、右旋糖酐、酶在使用時(shí)候存在凍融情況下：可以選甘露醇、右旋糖酐40、蔗糖，另外、蔗糖，另外 40%-50%的甘油一般為必選項(xiàng)。的甘油一般為必選項(xiàng)。 3、對、對PH變化敏感的酶：可以選用一定濃度的兩性氨基酸（比如說甘氨酸）作為變化敏感的酶：可以選用一定濃度的兩性氨基酸（比如說甘氨酸）作為 一個緩沖系統(tǒng)。一個緩沖系統(tǒng)。 4、容易被氧化的酶：可以試一下、容易被氧化的酶：可