生化制藥工藝技術(shù)基礎(chǔ)

1、2021-7-171 l天然生物材料制備生化藥物的過程大體為： 原料的選樣和預(yù)處理；原料的粉碎； 提取，即從原料中經(jīng)溶劑分離有效成分，制成 粗品的工藝過程；純化，即粗制品經(jīng)鹽析、 有機(jī)溶劑沉淀、吸附、層析、透析、超離心、 膜分離、結(jié)晶等步驟進(jìn)行精制的工藝過程； 干燥及保存；制劑，即原料藥經(jīng)精細(xì)加工制 成片劑、針劑、凍干劑等供臨床應(yīng)用的各種劑 型。 2021-7-172 l原料選擇的基本原則 要選擇有效成分含量高的新鮮材料； 來源豐富易得； 制造工藝簡單易行； 成本比較低； 經(jīng)濟(jì)效果要好。 2021-7-173 l一、 機(jī)械法 粉碎少量原料時，可使用高速組織搗碎機(jī) (10000rmin)、勻漿器

2、、研缽等。工業(yè)生產(chǎn)上 一般常用的粉碎設(shè)備有電磨機(jī)、球磨機(jī)、萬能 粉碎機(jī)，絞肉機(jī)、擊碎機(jī)等。 二 、物理法 1反復(fù)凍融法 ； 2冷熱交替法 ； 3超聲波處理法；4加壓破碎法 。 2021-7-174 l三三 、生化和化學(xué)方法、生化和化學(xué)方法 1自溶法自溶法 2溶菌酶處理法溶菌酶處理法 3. 表面活性劑處理法表面活性劑處理法 2021-7-175 l分固-液、液-液提取 l提取條件的選擇：溶劑、PH值、溫度 l影響提取的因素：被提取物質(zhì)溶解度的大小、 擴(kuò)散作用的影響、分配作用的影響 l超臨界流體萃?。?2021-7-176 主要應(yīng)用的方法有鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法、pI沉淀 法、膜分離法、層析法、凝

3、膠過濾法、離子交換法等。 一、鹽析法 1.鹽析及方法 利用不同蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中，溶解度不同程 度的降低來進(jìn)行分離純化的方法。有Ks法和法。 2.特點(diǎn) 對設(shè)備和條件要求低，安全，應(yīng)用范圍廣泛。在高 濃度鹽存在下，蛋白質(zhì)不易發(fā)生變化，一般可在室溫下 進(jìn)行操作。 分辨率低， Ks法多用于提取液的前期分離 工作。 2021-7-177 l一、鹽析法 3.常用的中性鹽和加入方式 常用中性鹽有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸納、 氯化鈉、磷酸鈉等。硫酸銨的鹽析能力強(qiáng)， 飽和溶液濃度大，溶解度受溫度影響小，一 般不會使蛋白質(zhì)變性，缺點(diǎn)是緩沖能力差， pH常在4555之間。但價廉易得，分段 分離效果也比其他鹽類好

4、。 加入方式：分步固體鹽或飽和溶液 2021-7-178 l一、鹽析法 4.鹽析時應(yīng)注意的問題 (1) 鹽飽和度的影響；(2) pH的選擇； （3）蛋白質(zhì)濃度的影響；（4）溫度的影響； （5）鹽析沉淀物的脫鹽； 2021-7-179 l二、有機(jī)溶劑沉淀法 利用不同蛋白質(zhì)在不同濃度的有機(jī)溶劑中的 溶解度差異而分離的方法，稱有機(jī)溶劑沉淀法。 乙醇和丙酮是最常用的有機(jī)溶劑。 有機(jī)溶劑沉淀法比鹽析法分辨力強(qiáng)，沉淀也 好過濾，但對有些生物活性物質(zhì)能引起失活和 變性。應(yīng)用時還應(yīng)注意防止溶劑揮發(fā)和火災(zāi)等。 2021-7-1710 l有機(jī)溶劑沉淀時應(yīng)注意的問題 1 控制工藝過程的溫度； 2 防止溶劑局部濃度過

5、高； 3 及時處理沉淀物； 4 pH值的選擇; 5 比鹽析法條件嚴(yán)格; 2021-7-1711 l三、等電點(diǎn)沉淀法 l等電點(diǎn)： 2021-7-1712 l三、等電點(diǎn)沉淀法 利用蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時溶解度最低，而各 種蛋白質(zhì)又具有不同的等電點(diǎn)的特性進(jìn)行分 離的工藝過程，稱等電點(diǎn)沉淀法。由于各種 蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時，仍有一定的溶解度而沉 淀不完全，多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)又都十分接 近，所以單獨(dú)使用效果不理想，分辨力差， 多用于提取后除雜蛋白，實(shí)際生產(chǎn)中常與有 機(jī)溶劑沉淀法、鹽析法聯(lián)合使用。 2021-7-1713 l四、膜分離法 膜分離技術(shù)包括超濾、反滲透析、電滲析、微 孔過濾、氣體滲析和超精密過濾等，其中

6、超濾、 反滲透析、微孔過濾和超精密過濾在醫(yī)藥領(lǐng)域 中的應(yīng)用較為常見。 1超濾 在液壓（氮?dú)饣蛘婵眨?qū)動下，分離粒子的 范圍，一般為0001一001m（溶劑和小分 子透過），適用于酶和蛋白質(zhì)類生化藥物的分 離、濃縮、脫鹽、提純、除菌、除病毒和熱原 等。 2021-7-1714 l四、膜分離法 1超濾 2021-7-1715 l四、膜分離法 1超濾 參數(shù)：膜（纖維素硝酸酯或醋酸酯、芳香 酰胺纖維等）；水的流速；相對分子質(zhì)量的截 止值(截留分子量)。 超濾設(shè)備：管式、多層板式、卷式和中空 纖維型等。國外發(fā)展較快的是一種內(nèi)壓式中空 纖維型。 2021-7-1716 l四、膜分離法 2.反滲透 溶劑從溶

7、液濃度高的一側(cè)傳遞到濃度低的一 側(cè)，稱反滲透。 分離介質(zhì)：高分子透過性薄膜 ； 設(shè)備：與超濾相仿 應(yīng)用：美國Millipore設(shè)計(jì)的反滲透裝置，已 有100多套，生產(chǎn)符合美國藥典的純水或注射 用水，還用于氨基酸、激素的濃縮等 2021-7-1717 l四、膜分離法 3微孔濾膜 由高分子材料制成的薄膜過濾介質(zhì)，可以 過濾一般介質(zhì)不能截留的細(xì)菌和微粒。膜的 微孔徑在02一l0m之間。過濾器有板式和 管式兩種。廣泛應(yīng)用于濾除微粒和微生物， 如濾除大輸液和水針劑中的污染微粒；還有 熱敏性藥物的除菌，如胰島素、C0A、ATP、 血清蛋白、丙種球蛋白、激素等。 2021-7-1718 l四、膜分離法 4超

8、精密過濾 以聚乙烯醇為主體的中空多孔濾膜，分級 性能在超濾膜與微孔濾膜之間，為001 02m。用于水的精制(脫除鐵質(zhì)、菌和微 粒)、循環(huán)水的凈化、除懸浮固體離子以及 糖液、酶液的精制等。 2021-7-1719 l五、離子交換法（離子交換層析 ） 1、基本原理 離子交換樹脂 ：載體、功能團(tuán)、平衡離子 載體：樹脂（苯乙烯型、丙烯酸型、酚醛型）、 纖維素、葡聚糖凝膠。 功能團(tuán)：磺酸根、磷酸根、羧基；季胺鹽、伯 仲叔胺基；CM、DEAE等。 平衡離子：氫離子、鈉離子、氫氧根離子、 2021-7-1720 l五、離子交換法（離子交換層析 ） 2、樹脂種類 第一類 強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂； 第二類 弱酸性

9、陽離子交換樹脂； 第三類 強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂 ； 第四類 弱堿性陰離子交換樹脂； 2021-7-1721 l五、離子交換法（離子交換層析 ） 3、影響交換速度的因素 2021-7-1722 l五、離子交換法（離子交換層析 ） 3、影響交換速度的因素 樹脂顆粒大小、攪拌和流速、離子濃 度、離子的水合半徑、酸堿性的強(qiáng)弱和 溶液pH值、交聯(lián)度的大小、有機(jī)溶劑、 交換容量。 2021-7-1723 l五、離子交換法（離子交換層析 ） 4、離子交換操作方法 （1）樹脂的選擇 當(dāng)目的物具有較強(qiáng)的堿性和酸性時，宜選用弱酸性 和弱堿性的樹脂； 氨基酸多用強(qiáng)酸樹脂；蛋白質(zhì)、酶和其它生物大分 子的分離多采用弱堿

10、或弱酸性樹脂，以減少生物大分 子的變性，有利于洗脫，并提高選擇性。 另外因素：孔徑、化學(xué)穩(wěn)定性、機(jī)械性能等 2021-7-1724 l五、離子交換法（離子交換層析 ） 4、離子交換操作方法 （2）樹脂的處理和再生 （3）基本操作方法 操作方式：靜態(tài)和動態(tài) 洗脫方式：靜態(tài)和動態(tài)；洗脫液分酸、堿、 鹽、溶劑等。 2021-7-1725 l六、凝膠層析 定義：指混合物隨流動相流經(jīng)裝有凝膠作為固定 相的層析柱時，因其各種物質(zhì)分子大小不同而被分 離的技術(shù)。又稱凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩 過濾等。也稱阻滯擴(kuò)散層析、排阻層析等。 特點(diǎn)：設(shè)備簡單，操作方便，分離效果好，回收 率高，分離條件緩和，不致引起生

11、物活性物質(zhì)變性 和失活，凝膠可重復(fù)使用無需繁復(fù)的再生處理。 缺點(diǎn)是分離速度較慢。廣泛應(yīng)用于分離氨基酸、多 肽、蛋白質(zhì)、酶及多糖等生化物質(zhì)。 2021-7-1726 l六、凝膠層析 1基本原理 2021-7-1727 l六、凝膠層析 2幾種常用凝膠 葡聚糖凝膠 （Sephadex G ）是一種非離子型的無 定形或稱珠狀顆粒物質(zhì)，化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，不溶 于水、弱酸、堿和鹽溶液。含有少量的羧基，故對 陽離子有輕微的吸附作用。 聚丙烯酰胺凝膠（生物凝膠P ）在pH2一11范圍 內(nèi)使用。它由碳碳骨架構(gòu)成，完全是惰性的，適 宜作為凝膠層析的載體。缺點(diǎn)是不耐酸，遇酸時酰 胺鍵會水解成羧基，使凝膠帶有一定的離

12、子交換基 團(tuán)。 2021-7-1728 l六、凝膠層析 2幾種常用凝膠 瓊脂糖凝膠（瑞典sepharose美國稱BioGel A，英國稱Sagavac等。）是一種天然凝膠，不是共 價交聯(lián)，是以氫鍵交聯(lián)的。不同孔隙程度是以改變 瓊脂搪濃度而達(dá)到的?；瘜W(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。 疏 水 性 凝 膠 常 用 的 為 聚 甲 基 丙 烯 酸 酯 (Polmethacrylate)凝膠或以二乙烯苯為交聯(lián)劑的聚苯 乙烯凝膠(如Styroge1及BioBeadsS)。 2021-7-1729 l六、凝膠層析 2幾種常用凝膠 2021-7-1730 l六、凝膠層析 3.影響凝膠層析的因素 (1)凝膠的選擇（考慮

13、凝膠特性以及分離目的和樣品的 性質(zhì)）； (2)洗脫液流速（約在30200m1/h ）； (3)離子強(qiáng)度和pH值； (4)分離液體積通常為凝膠床總體積的5-10； (5)柱的長度和直徑（長徑之比通常為10：1或7：1 ）； （6）V0和Vi （ 裝填良好的柱，V0和Vi的值的比率應(yīng)為 40%-60% ）。 2021-7-1731 l六、凝膠層析 4、凝膠層析的應(yīng)用 （1）脫鹽； （2）分子量測定； （3）去熱原和分離純 化； 2021-7-1732 l七、親合層析 1基本原理 定義：利用生物大分子的特異親和力而設(shè)計(jì)的 層折技術(shù)。 特點(diǎn)：從粗提液中，通過一次簡便處理便可 獲得高純度的活性物質(zhì)，既可

14、分離一些生物材料中 含量極微的物質(zhì)，又能分離一些性質(zhì)十分相似的物 質(zhì)。具有設(shè)備要求不高，操作簡便，適用范圍廣， 特異性強(qiáng)，分離速度快，效果好，條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。 但親合吸附劑的通用性較差，洗脫條件較苛刻。 2021-7-1733 七、親合層析 1基本原理 配基：可逆結(jié)合 的特異性物質(zhì)。 載體：與配基結(jié) 合的層析介質(zhì)。 配體： 2021-7-1734 l七、親合層析 2幾種常用載體 （1）瓊脂糖凝膠 Sepharose 2B、4B和6B(Pharmacia)和U1trogelsA一 2，A4，A一6(LKB)。這類載體能使吸附物質(zhì)保持 活性，能迅速活化并接上各種功能基團(tuán)，結(jié)構(gòu)疏松孔 徑大，流速快，

15、非專一性吸附少; Sepharose CL是用2， 3二溴丙烷處理的交聯(lián)瓊脂糖，它的穩(wěn)定性明顯增 加，能在pH3一14中應(yīng)用，擴(kuò)大了親和柱制備時化學(xué) 反應(yīng)選用的范圍，并能經(jīng)受比較劇烈的洗脫條件。 2021-7-1735 l七、親合層析 2幾種常用載體 其他的還有葡聚糖凝膠、纖維素、聚丙烯酰胺凝膠 、 多孔玻璃珠 等。 3. 配基 特殊配基：底物、抑制劑、輔因子（酶）；抗原、 病毒、細(xì)胞（抗體）；互補(bǔ)的堿基順序、組蛋白、核 酸聚合酶（核酸）。 通用配基：蛋白質(zhì)A- Sepharose CL-4B（IgG及其系 列）、ConA- Sepharose (-D-呋喃葡萄糖、 -D-呋喃 甘露醇)等。

16、2021-7-1736 l七、親合層析 4 影響吸附劑親和力的幾個因素 (1)配基濃度（配體濃度）； (2)空間障礙（特別是親合力低或分子量大而 配基為小分子）； (3)配基與載體的結(jié)合位點(diǎn)； (4)載體孔徑； (5)微環(huán)境 ； 5洗脫條件 2021-7-1737 l濃縮 手段：蒸發(fā)、沉淀 蒸發(fā)濃縮裝置：薄膜蒸發(fā)濃縮 、減壓蒸 發(fā)濃縮 、吸收濃縮（最常用的吸收劑有 聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、凝 膠等 ） 等。 2021-7-1738 2021-7-1739 l結(jié)晶 一般生化藥物結(jié)晶的條件：純度 、濃度、 pH 、溫度、時間以及晶種等。 2021-7-1740 l干燥 干燥是從濕的固體生化藥物中除去水分或溶劑而 獲得相對或絕對于燥制品的工藝過程。通常包括原 料藥的干燥和制成的臨床制劑的干燥。 最常用的方法：常壓干燥、減壓干燥、噴霧干燥 和冷凍干燥等，其干燥設(shè)備主要有：廂式干燥器、 真空干燥器、冷凍干燥器、管式氣流干燥器、沸騰 干燥器、噴霧干燥器等等。 2021-7-1741 l一、噴霧干燥 將液體通過噴射裝置噴成霧滴后，在一定 流速的熱氣流中，迅速蒸發(fā)干燥的方法。實(shí)驗(yàn) 表明：把含水量為80左右的1L溶液，噴成 直徑約106