花青素提取方法總結(jié)

1、1 玉米籽粒花青素提取和分析方 法 2 花青素是植物中的主要呈色物質(zhì)，屬于類(lèi) 黃酮化合物 自然狀態(tài)下很少以游離態(tài)存在，常與一個(gè) 或多個(gè)多糖通過(guò)糖苷鍵形成糖苷 已知有20多種花青素，植物中常見(jiàn)的有六 種：天竺葵色素、矢車(chē)菊色素、飛燕草色 素、芍藥色素、牽牛花色素、錦葵色素 （其最大可見(jiàn)光吸收波長(zhǎng)分別為494、506、 508、506、508和510 nm） 3 花青素的生理功能 消除自由基、抗氧化 紫玉米花色苷具有很高的抗氧化活性和抗 菌活性，甚至高于藍(lán)莓的抗氧化活性。 抗誘變、腫瘤、過(guò)敏 抑制食品誘變劑，對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有抑制作 用 降血脂 4 花青素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 現(xiàn)已查明,天然花色苷糖苷配基的基本

2、 結(jié)構(gòu)為3 ,5 ,7 - 三羥基- 2 - 苯基苯并吡喃,結(jié)構(gòu)式為: 5 花青素的穩(wěn)定性影響因素 結(jié)構(gòu) C3羥基可使分子變得不穩(wěn)定，C5上有羥基或 C4發(fā)生取代都可使顏色趨于穩(wěn)定 糖苷的形成也影響花色苷的穩(wěn)定性 花色苷的?；@著增加其在微酸性至中 性介質(zhì)中的穩(wěn)定性 6 溫度 PH 醌型 堿 黃烊鹽 陽(yáng)離子 假堿 查爾酮 7 溫度 當(dāng)花色苷溶液加熱時(shí),平衡向著無(wú)色的查耳 酮(C) 的方向進(jìn)行,同時(shí)引起有色型化合物 (AH+ + A) 的降低。當(dāng)冷卻和酸化時(shí),醌型堿 (A) 和假堿(B) 迅速變成陽(yáng)離子(AH+ ) ?；ㄉ?苷在溫度小于 60的條件下較為穩(wěn)定，當(dāng) 溫度大于 80時(shí)，溫度對(duì)花色苷

3、有較明顯 的降解作用； 光對(duì)花色 苷的穩(wěn)定性影響 很大 8 輔色劑的影響 花色苷同輔色劑聯(lián)合形成一種垂直層疊的 復(fù)合物(Goto 等1979) ,這種層疊過(guò)程產(chǎn)生一 種疏水力,從而防止親水核的加合作用和失 色。 9 提取方法： 一、萃取 溶劑法 常用的溶劑主要分為3類(lèi):水、親水性有機(jī)溶 劑和親脂性有機(jī)溶劑。為防止花色苷的降 解和提高花色苷的溶出率,常在溶劑中加少 量的無(wú)機(jī)酸或有機(jī)酸，使提取液的p H 控制 在3.15 以下。 10 l這是目前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的提取方法，多 數(shù)選擇甲醇、乙醇、丙酮或它們的混合溶 劑對(duì)材料中的花青素進(jìn)行溶解過(guò)濾，通過(guò) 酸或堿調(diào)節(jié)溶液酸堿度萃取濾液中的花青 素。 l該

4、方法原理簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求較低，不足 之處是大多數(shù)有機(jī)溶劑毒副作用大且產(chǎn)物 提取率低。 有機(jī)溶劑萃取法 11 水溶液提取法 該方法一般在常壓或高壓下用熱水浸泡含 花青素的原材料，然后用非極性大孔樹(shù)脂 進(jìn)行吸附；或直接使用脫氧熱水提取，再 采用超濾或反滲透經(jīng)濃縮得到粗提物 陸國(guó)權(quán)等 研究表明，提取腳板薯花青素的 最佳方法是：以05 硫酸溶液作浸提劑， 并使其pH440，在6O下加熱60 min。 設(shè)備簡(jiǎn)單，無(wú)污染，產(chǎn)品無(wú)毒但純度低。 12 超臨界流體萃取法 利用壓力和溫度對(duì)超臨界流體溶解能力的 影響進(jìn)行提取。 最大的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)品提取率高，可以低溫操 作，避免了不飽和脂肪酸的氧化分解，溶 劑無(wú)殘留，且

5、作為超臨界流體的CO2易得， 萃取能耗低。 時(shí)海香等人研究了超臨界CO2 萃取常山胡柚 天然色素的工藝，色素提取率可達(dá)96.187 % 13 提取方法： 二、破除細(xì)胞壁 發(fā)酵提取法 原理是:通過(guò)微生物的作用使紫甘薯中的 淀粉轉(zhuǎn)化為乙醇,將乙醇分離后,可得到紫甘 薯花色苷,原料的利用率大大提高。 其利用微生物破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,促進(jìn) 花色苷的溶出,提高提取率。通過(guò)發(fā)酵分解 色素液中的糖、有機(jī)酸和其他雜質(zhì),大大降 低了色素的純化難度。 14 酶法提取 用于花色苷提取的酶主要有纖維素酶和果 膠酶,通過(guò)酶解使植物細(xì)胞壁軟化、膨脹及 崩潰,從而促進(jìn)了花色苷的溶出。 王萍等人通過(guò)單因素和正交試驗(yàn),確定了黑

6、 加侖果渣花色苷酶法提取的的最佳工藝， 黑加侖花色苷提取率的91.109 %, 此法可以大大縮短花色苷提取時(shí)間,提高得 率。 15 輔助方法 超聲波輔助提取 在超聲波聲場(chǎng)中,振動(dòng)負(fù)壓區(qū)由于周?chē)囊后w來(lái) 不及補(bǔ)充,形成無(wú)數(shù)的微小真空泡,而當(dāng)正壓來(lái)到時(shí), 微小氣泡在壓力下突然閉合,液體間猛烈碰撞產(chǎn)生 極大的沖擊波,壓力可高達(dá)3 000 MPa ,從而使植物 細(xì)胞破裂,利于花色苷的溶出。 此法具有提取時(shí)間短,設(shè)備簡(jiǎn)單,操作方便等優(yōu)點(diǎn), 并可有效防止熱敏性成分的高溫分解。 16 微波輔助提取 當(dāng)微波加熱時(shí),細(xì)胞內(nèi)極性物質(zhì)尤其是水分 子吸收微波能,產(chǎn)生大量的熱量使細(xì)胞內(nèi)溫 度迅速上升,液態(tài)水汽化產(chǎn)生的巨

7、大壓力將 細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破,形成微小的孔洞,使胞 外溶劑容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),溶解并釋放出胞內(nèi) 物質(zhì)。 與傳統(tǒng)方法相比,微波法具有提取率高、時(shí) 間短、能耗小等優(yōu)點(diǎn),因此微波用于天然素 的提取工藝具有廣闊的應(yīng)用前景。 17 其他輔助方法 高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取 高壓脈沖電場(chǎng)輔助提取法是一種新型非熱技術(shù),它 具有提取溫度低、速率快、時(shí)間短、提取率高、 產(chǎn)品品質(zhì)好的特點(diǎn)。 液態(tài)靜高壓法輔助提取 Corrales 等人用液態(tài)靜高壓輔助提取的方法從葡萄 皮中提取花色苷,研究所得的最優(yōu)工藝參數(shù)是:100 %乙醇,溫度50 ,壓力600 MPa 。此法與未使用 HHP 法相比,產(chǎn)率提高23 %。H HP 具有提取

8、溫度低, 時(shí)間短,不破壞色素結(jié)構(gòu)等優(yōu)點(diǎn),但應(yīng)用于花色苷等 活性成分提取的報(bào)道還不多見(jiàn)。 18 提取條件比較 19 20 純化 經(jīng)過(guò)提取的花色苷粗品中往往含有很多有機(jī) 酸、糖等雜質(zhì),產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差、純度不 高。為了提高產(chǎn)品的色價(jià)和穩(wěn)定性,需要對(duì) 提取物進(jìn)一步純化。 21 柱層析法 凝膠柱層析 聚酰胺層析 硅膠層析 離子交換層析 22 大孔樹(shù)脂層析 大孔樹(shù)脂是近代發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)有機(jī)高聚 物吸附劑。分離工藝得到的提取物不吸潮， 工藝簡(jiǎn)單，成本相對(duì)較低，樹(shù)脂可反復(fù)使 用適合工業(yè)化生產(chǎn) 楊迎花等 采用大孔樹(shù)脂吸附純化葡萄籽原 花青素，結(jié)果表明大孔樹(shù)脂吸附純化工藝 簡(jiǎn)單、成本低、產(chǎn)率高、安全適用。 23

9、 膜分離法 花色苷提取中常用的膜分離技術(shù)有超濾(UF) 、反 滲透(RO) 、電滲析( ED) 等。 Patil 用酸化的乙醇提取紅蘿卜花色苷,隨后用膜分 離的方法有效的脫醇并濃縮了花色苷提取液,使花 色苷含量從37216 mg/ L 提高到62518 mg/ L 膜分離純化的花色苷色價(jià)和透明度高,穩(wěn)定性好,容 易實(shí)現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn),生產(chǎn)過(guò)程勞動(dòng)強(qiáng)度低,流程簡(jiǎn)單, 但對(duì)設(shè)備要求高,純化成本高,提取效率低。 24 鑒定 經(jīng)過(guò)加工或儲(chǔ)藏的材料會(huì)產(chǎn)生褐色降解物經(jīng)過(guò)加工或儲(chǔ)藏的材料會(huì)產(chǎn)生褐色降解物, 這些降解物和花色苷具有相同的能量吸收這些降解物和花色苷具有相同的能量吸收 范圍范圍. 這類(lèi)花色苷總量的測(cè)定

10、這類(lèi)花色苷總量的測(cè)定,通常有兩種方通常有兩種方 法法 pH示差法示差法 差減法差減法 25 鑒定方法 柱層析 薄層層析 光譜分析法 HPLC、MS、HPLCMS 核磁共振法 毛細(xì)管區(qū)帶電泳法 26 紫外可見(jiàn)光譜法 色素的紫外吸收光譜是色素的重要特征。 吸收光譜是鑒定和測(cè)量混合物中主要色素 的最簡(jiǎn)單方法。其主要原理是依據(jù)花色苷 的不同基團(tuán)的在不同的波長(zhǎng)下有不同的吸 收峰,進(jìn)而推斷出其結(jié)構(gòu)。 B環(huán)有鄰位羥基的確定。糖基位置的確 定。酰基是否存在的確定。甲基化與 羥基化 27 HPLC 高效液相色譜法( HPLC) 以經(jīng)典的色譜法為基礎(chǔ),引 入了氣相色譜法的理論和實(shí)驗(yàn)方法,流動(dòng)相改為高 壓輸送,采用

11、高效固定相及在線檢測(cè)手段發(fā)展而成 的一種高效快速分離分析技術(shù)。 HPLC 可以在30min 一個(gè)流程內(nèi)分離15種不同的花 色苷,其分辨能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)紙層析和薄層層析。但 是,由于缺乏花色苷的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品,使得僅靠HPLC 方法對(duì)花色苷進(jìn)行定性和定量分析還不夠充分。 28 出峰順序 9種花色素苷的出峰順序：花翠素3O一葡 萄糖苷、花青素3-0葡萄糖苷、3一甲花 翠素3O葡萄糖苷、甲基花青素 3O葡萄糖苷、二甲花翠素3O葡萄 糖苷、甲基花青素3O一(6一O一乙酰)葡萄 糖苷、二甲花翠素3O(6O乙酰)葡萄 糖苷、甲基花青素3O(6o-對(duì)香豆酰) 葡萄糖苷、二甲花翠素3O(60對(duì)香 豆酰)葡萄糖苷 29

12、 雙標(biāo)樣高效液相色譜法測(cè)定紫玉米 花青素的含量 設(shè)備 Agilent 1 100高效液相色譜儀和Agilent Ion TrapXCT MS：美國(guó)安捷倫公司；Waters Xbridge C18(250 mmx46 mm，5 m)柱： 美國(guó)Waters公司 色譜流動(dòng)相：A(5甲酸)，B(甲酸：水：乙 腈=5：45：50，體積比)；流速： 0.8mUmin;DAD檢測(cè)器；柱溫30；梯度洗 脫。 30 標(biāo)樣 C3G 和P3G（紫玉米花青素其主要以C3G 和 P3G 及其衍生物為主要組成部分） 結(jié)果 C3G 的加標(biāo)回收率為93.7 %（RSD 為0.804 %）， 可以確定以C3G 為標(biāo)樣測(cè)定樣品C

13、3G 含量更加準(zhǔn) 確。同理，樣品中P3G 及其衍生物以P3G 為標(biāo)樣 獲得的結(jié)果更可靠。因此，使用雙標(biāo)樣高效液相 色譜法獲得的紫玉米花青素含量（93.77 mg/g）更 加準(zhǔn)確。 P3G：芍藥色素-3-葡萄糖 CG：矢車(chē)菊色素-3-葡萄糖苷 31 32 紫玉米花青素種類(lèi) 近年來(lái), 采用溫和的提取分離方法和現(xiàn)代分析儀器手段如 TLC、HPLC、MS、NMR 等, Aok i等研究發(fā)現(xiàn)紫玉米籽粒中 含有8種花青苷: 矢車(chē)菊素- 3-葡萄糖苷、天竺葵素- 3-葡萄 糖苷、芍藥素- 3-葡萄糖苷、兩個(gè)矢車(chē)菊素- 3-丙二酸?；?葡萄糖苷同分異構(gòu)體、天竺葵素- 3-丙二酸?；咸烟擒?、 芍藥素- 3-丙

14、二酸?；咸烟擒?、矢車(chē)菊素- 3-二丙二酸酰 基葡萄糖苷。 Zhao等對(duì)中國(guó)紫玉米雜交品種的籽粒進(jìn)行了質(zhì)譜分析, 初 步發(fā)現(xiàn)9個(gè)花青苷單體物質(zhì), 包括矢車(chē)菊素- 3-葡萄糖苷、 天竺葵素- 3-葡萄糖苷、芍藥素- 3-葡萄糖苷、兩個(gè)矢車(chē)菊 素- 3-丙二酸?；咸烟擒胀之悩?gòu)體、天竺葵素- 3-丙二 酸?；咸烟擒?、兩個(gè)芍藥素- 3-丙二酸?；咸烟擒胀?分異構(gòu)體、天竺葵素- 3-二丙二酸?；咸烟擒铡?33 含量 每100 g秘魯紫玉米中含色素物質(zhì)為1 640mg , 遠(yuǎn)遠(yuǎn) 高于鮮藍(lán)莓花青苷的( 73 430mg) 。 籽粒表皮含大部分的花青苷, 通常為504 1473mg, 而Moreno等 發(fā)現(xiàn), 在一些南美紫玉米品種( Arro cillo, Con ico, Peruano 和Purepecha)的脫胚芽玉 米籽粒中, 含54 115mg的花青苷。 Zhao等發(fā)現(xiàn)中國(guó)紫玉米雜交品種的籽粒中, 花青苷 高達(dá)305mg(以100 g干質(zhì)量計(jì), 下同)。 敬璞等研究發(fā)現(xiàn)秘魯紫玉米芯花青苷含量高達(dá) 1333mg 34 初步的提取方案 提取(1): 酸醇提