第四章 目的基因的轉(zhuǎn)化及其原理

1、第四章 目的基因的轉(zhuǎn)化及其原理 第一節(jié)第一節(jié) 植物基因工程載體及其構(gòu)建植物基因工程載體及其構(gòu)建 1 植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)植物基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)（Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體，Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載 體）體） 原生質(zhì)體原生質(zhì)體DNA直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)直接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 基因槍基因槍DNA導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng)導(dǎo)入轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 花粉粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)花粉粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 2 一、植物基因工程載體命名規(guī)則及種類一、植物基因工程載體命名規(guī)則及種類 1、植物基因工程載體命名規(guī)則：、植物基因工程載體命名規(guī)則： (1) pSC101 plasmid Stanley Cohen(人名) pTiT37/pAtT37

2、 根癌農(nóng)桿菌的質(zhì)粒類型根癌農(nóng)桿菌的質(zhì)粒類型 （Agrobacterium tumefaciens） pRiT37/pArT37 發(fā)根農(nóng)桿菌的質(zhì)粒類型發(fā)根農(nóng)桿菌的質(zhì)粒類型 （Agrobacterium rhizogenes） 3 （2）每個(gè)基因位點(diǎn)均以三個(gè)斜體小寫字母表示，）每個(gè)基因位點(diǎn)均以三個(gè)斜體小寫字母表示， 如：如：leu （亮氨酸基因位點(diǎn)）（亮氨酸基因位點(diǎn)） 基因表現(xiàn)型用正體表示，如基因表現(xiàn)型用正體表示，如Leu （3）基因中任何位點(diǎn)發(fā)生突變則在該基因符號(hào)后）基因中任何位點(diǎn)發(fā)生突變則在該基因符號(hào)后 加該位點(diǎn)斜體大寫字母，如亮氨酸加該位點(diǎn)斜體大寫字母，如亮氨酸A、B位點(diǎn)分別位點(diǎn)分別 為突變

3、型或缺陷型，表示為：為突變型或缺陷型，表示為：leuA、leuB (4)抗性和敏感性分別用抗性和敏感性分別用R或或r，S或或s表示表示 4 2 2、植物基因工程載體的種類及特性、植物基因工程載體的種類及特性 植物基因植物基因 工程載體工程載體 克隆載體克隆載體 中間載體中間載體 中間克隆載體中間克隆載體 中間表達(dá)載體中間表達(dá)載體 卸甲載體卸甲載體 onc- onc+ 轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化載體 中間黏粒載體中間黏粒載體 質(zhì)粒質(zhì)粒/黏粒載體黏粒載體 基因標(biāo)記載體基因標(biāo)記載體 一元轉(zhuǎn)化載體一元轉(zhuǎn)化載體 （順式載體）（順式載體） 雙元轉(zhuǎn)化載體雙元轉(zhuǎn)化載體 （反式式載體）（反式式載體） 共整合載體共整合載體 S

4、EV（拼接末端載體；（拼接末端載體； split-end vector） 5 二、根二、根癌農(nóng)桿菌癌農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)與功能 1、Ti質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能 2、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)與功能的基因結(jié)構(gòu)與功能 3、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能 6 一、一、TiTi質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及質(zhì)粒的遺傳特性、結(jié)構(gòu)及功能功能 1. Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型質(zhì)粒的遺傳特性及類型 Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合 的環(huán)狀的環(huán)狀DNA分子。分子。 根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠

5、癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)粒質(zhì)粒 可以被分成四種類型：可以被分成四種類型： 章魚堿型章魚堿型(octopine) 胭脂堿型胭脂堿型(nopaline) 農(nóng)桿堿型（農(nóng)桿堿型（agropine） 農(nóng)桿菌素堿型（農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型）或稱琥珀堿型(succinamopine) 7 圖圖3-1 章魚堿型章魚堿型Ti質(zhì)?；驁D。質(zhì)粒基因圖。 章魚堿基因章魚堿基因T-DNA區(qū)區(qū)結(jié)合轉(zhuǎn)移區(qū)結(jié)合轉(zhuǎn)移區(qū)冠癭堿代謝冠癭堿代謝復(fù)制起始區(qū)復(fù)制起始區(qū) 毒力區(qū)毒力區(qū)生長(zhǎng)素基因生長(zhǎng)素基因細(xì)胞分裂素基因細(xì)胞分裂素基因冠癭堿合成冠癭堿合成

6、 8 2. Ti質(zhì)粒的功能質(zhì)粒的功能區(qū)域區(qū)域 Ti質(zhì)?？煞譃樗膫€(gè)區(qū)：質(zhì)?？煞譃樗膫€(gè)區(qū)： （1）T-DNA區(qū)（區(qū)（transferred-DNA regions）：）： T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從是農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn) 移到植物細(xì)胞的一段移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該。該DNA片段上片段上 的基因與腫瘤的形成有關(guān)。的基因與腫瘤的形成有關(guān)。 （2）Vir區(qū)（區(qū)（virulence region） 該區(qū)段上的基因能激活該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒 性，故稱之為毒區(qū)。性，故稱之為毒區(qū)

7、。T-DNA區(qū)與區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相上彼此相 鄰，約占鄰，約占Ti質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的三分之一。的三分之一。 9 （3）Con區(qū)（區(qū)（regions encoding conjugations） 該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控），調(diào)控Ti 質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)質(zhì)粒轉(zhuǎn) 移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。 （4）Ori區(qū)（區(qū)（origin of replication） 該區(qū)段基因調(diào)控該區(qū)段基因調(diào)控Ti

8、質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。 10 3. Ti質(zhì)粒的生物學(xué)功能質(zhì)粒的生物學(xué)功能 參與參與寄主細(xì)胞合成植物激素吲哚乙酸（寄主細(xì)胞合成植物激素吲哚乙酸（IAA）和一些細(xì)胞分裂素的活動(dòng)）和一些細(xì)胞分裂素的活動(dòng)。 誘發(fā)誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和冠癭堿成分植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和冠癭堿成分。 賦予賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力。 賦予賦予寄主菌株對(duì)土壤桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素的反應(yīng)性寄主菌株對(duì)土壤桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素的反應(yīng)性。 為為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力農(nóng)

9、桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力。 決定決定寄主菌株的植物寄主范圍寄主菌株的植物寄主范圍。 有有的的Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長(zhǎng)與發(fā)育，即具有對(duì)噬菌質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體生長(zhǎng)與發(fā)育，即具有對(duì)噬菌 體的體的“排外性排外性”。 11 表表4-1 Ti質(zhì)粒放入部分基因及其功能質(zhì)粒放入部分基因及其功能 基因縮寫基因縮寫表型及功能表型及功能在基因圖上的位置（在基因圖上的位置（kb） pTiC58 （211kb） pTiAch5（195kb） age排斥噬菌體排斥噬菌體API111-11310-12 agr對(duì)對(duì)PAT-K84質(zhì)粒編碼的農(nóng)桿菌素敏感質(zhì)粒編碼的農(nóng)桿菌素敏感138-141

10、 arc分解精氨酸分解精氨酸4-59-10 agc分解農(nóng)桿菌分解農(nóng)桿菌54-57 noc分解胭脂堿分解胭脂堿18-20 nos合成胭脂堿合成胭脂堿0-1 occ分解章魚堿分解章魚堿39-41 ocs合成章魚堿合成章魚堿0-1 ori復(fù)制起點(diǎn)復(fù)制起點(diǎn)33-3590-95 roi（tmr）抑制長(zhǎng)根抑制長(zhǎng)根206-207190-192 shi（tms）抑制長(zhǎng)芽抑制長(zhǎng)芽202-203187-188 traTi質(zhì)粒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)移121-12321-30 inc質(zhì)粒不相容性質(zhì)粒不相容性33-3590-95 12 二、二、T-DNA的基因結(jié)構(gòu)與功能的基因結(jié)構(gòu)與功能 1.T-DNA的的發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) Chilton等

11、等人于人于1982發(fā)現(xiàn)。發(fā)現(xiàn)。(MD CHILTON, D TEPFER, A PETIT, D CHANTAL , CD FRANCINE, T JACQUES. Agrobacterium rhizogenes inserts T- DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature,1982(295):432 - 434 ） 研究研究證明，這部分證明，這部分DNA是從質(zhì)粒是從質(zhì)粒DNA上切割后，上切割后， 轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞，故稱之為轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA（transferred- DNA）。 13 G G C

12、A G G A T A T A T A T T C A A T T G T A A T G G C A G G A T A T A T A T A C C G G T T G T A A T T 圖圖3-2 Ti質(zhì)粒上幾個(gè)重要區(qū)域及其序列質(zhì)粒上幾個(gè)重要區(qū)域及其序列 LB：左邊界序列；：左邊界序列； RB：右邊界序列：右邊界序列 14 2. T-DNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) l Ti質(zhì)粒質(zhì)粒T-DNA區(qū)的長(zhǎng)度約為區(qū)的長(zhǎng)度約為23kb； l l T-DNA僅存在于植物腫瘤細(xì)胞的核僅存在于植物腫瘤細(xì)胞的核DNA中；中； l 在在T-DNA的的5 端和端和3 端都有真核表達(dá)信號(hào)。如端都有真核表達(dá)信號(hào)。如

13、 TATAbox、AATAAbox及及polyA等。等。 15 T-DNA的兩端左右邊界各為的兩端左右邊界各為25bp的重復(fù)序列，即邊界序的重復(fù)序列，即邊界序 列（列（border sequence），分別稱之為左邊界（），分別稱之為左邊界（BL或或TL） 和右邊界（和右邊界（BR或或TR）。 該該25bp邊界序列屬保守序列邊界序列屬保守序列,但通常右邊界（但通常右邊界（TR）序列更）序列更 為保守，左邊界為保守，左邊界(TL)序列在某些情況下有所變化。其核心序列在某些情況下有所變化。其核心 部分是部分是14bp，可分為，可分為10bp(CACGATATAT)及及 4bp(GTAA)兩部分兩部

14、分,是完全保守的。是完全保守的。 致瘤性：右邊界作用大于左邊界致瘤性：右邊界作用大于左邊界 16 3. T-DNA上的編碼基因及功能上的編碼基因及功能 T-DNA的轉(zhuǎn)錄有下述共同點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄有下述共同點(diǎn)： T-DNA的兩條鏈都是有意義鏈的兩條鏈都是有意義鏈,即都能被轉(zhuǎn)錄即都能被轉(zhuǎn)錄。 T-DNA上每個(gè)基因都有各自的啟動(dòng)子上每個(gè)基因都有各自的啟動(dòng)子。 基因的轉(zhuǎn)錄由植物細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄由植物細(xì)胞RNA聚合酶聚合酶完成完成。 T-DNA具典型的真核生物具典型的真核生物RNA合成起始和終止的調(diào)節(jié)信號(hào)合成起始和終止的調(diào)節(jié)信號(hào)， T-DNA的轉(zhuǎn)錄機(jī)理可能與真核生物相同的轉(zhuǎn)錄機(jī)理可能與真核生物相同。 植物或農(nóng)桿菌

15、中可能有甲基化或去甲基化的調(diào)節(jié)基因活性。植物或農(nóng)桿菌中可能有甲基化或去甲基化的調(diào)節(jié)基因活性。 17 TL TRTC iaaH iaaM aux ipt cytocsfrsmasags 圖圖4-3 章魚堿型章魚堿型Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA編碼基因結(jié)構(gòu)編碼基因結(jié)構(gòu) iaaH：吲哚乙酸胺水解酶；：吲哚乙酸胺水解酶；iaaM：色氨酸單加氧酶；：色氨酸單加氧酶； aux：生長(zhǎng)素；：生長(zhǎng)素；ipt: 異戊烯基轉(zhuǎn)移酶；異戊烯基轉(zhuǎn)移酶； cyt：細(xì)胞分裂素；：細(xì)胞分裂素；frs：琥珀堿合成酶；：琥珀堿合成酶； mas：甘露堿合成酶；：甘露堿合成酶；ags：農(nóng)桿堿合成酶：農(nóng)桿堿合成酶 18 T-DNA區(qū)基因的

16、功能區(qū)基因的功能 第一類是編碼冠癭堿合成酶及分解代謝基因，第一類是編碼冠癭堿合成酶及分解代謝基因， 如如:frs、mas、ags 第二類是致瘤基因；包括生長(zhǎng)素基因第二類是致瘤基因；包括生長(zhǎng)素基因aux和細(xì)胞分和細(xì)胞分 裂素基因裂素基因cyt 19 三、三、Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能 1、 Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)：區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)： 農(nóng)桿菌致瘤所必須的 ； Vir區(qū)僅位于T區(qū)DNA左側(cè)； 兩者之間的距離常隨Ti質(zhì)粒類型不同而有差異。 HABGCDEF tzsABGCDE 章魚堿章魚堿 胭脂堿胭脂堿 圖圖 4-5 章魚堿型和胭脂堿型章魚堿型和胭脂堿型Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的

17、Vir區(qū)編碼基因結(jié)構(gòu)區(qū)編碼基因結(jié)構(gòu) 20 表表 4-4 章魚堿型章魚堿型Ti質(zhì)粒質(zhì)粒vir基因基本結(jié)構(gòu)與功能基因基本結(jié)構(gòu)與功能 遺傳座位遺傳座位分子量（分子量（kb）基因數(shù)基因數(shù)表達(dá)方式表達(dá)方式功能功能 virA2.81組成型組成型幫助接受植物信號(hào)分子啟動(dòng)毒性區(qū)表達(dá)幫助接受植物信號(hào)分子啟動(dòng)毒性區(qū)表達(dá) virG1.01組成型組成型轉(zhuǎn)錄活化轉(zhuǎn)錄活化 virC1.52誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型T-DNA加工加工 virD4.54誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型T-DNA加工加工 virE2.22誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型T-DNA加工加工 virB9.511誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 virF1.01誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型T-DNA轉(zhuǎn)運(yùn)轉(zhuǎn)運(yùn) virH

18、94.22誘導(dǎo)型誘導(dǎo)型細(xì)胞色素細(xì)胞色素P-450單氧化酶單氧化酶 21 三、農(nóng)三、農(nóng)桿菌桿菌Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化機(jī)理質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化機(jī)理 已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。 T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn) 入植物細(xì)胞，并非整個(gè)入植物細(xì)胞，并非整個(gè)Ti質(zhì)粒都進(jìn)入植物細(xì)胞。該質(zhì)粒都進(jìn)入植物細(xì)胞。該 基因轉(zhuǎn)化過程是一個(gè)復(fù)雜的遺傳工程。基因轉(zhuǎn)化過程是一個(gè)復(fù)雜的遺傳工程。 22 1、T-DNA的加工及轉(zhuǎn)移的加工及轉(zhuǎn)移 23 四、四、T鏈整合植物鏈整合植物基因組的基因組的分子機(jī)理分子機(jī)理 1、整合位點(diǎn)

19、及其特性、整合位點(diǎn)及其特性 T-DNA在植物染色體中的插入是隨機(jī)的，可插入植物任何在植物染色體中的插入是隨機(jī)的，可插入植物任何 一條染色體一條染色體 插入位點(diǎn)常有以下特點(diǎn)：插入位點(diǎn)常有以下特點(diǎn)： T-DNA優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點(diǎn)；優(yōu)先整合到轉(zhuǎn)錄活躍的植物基因位點(diǎn)； T-DNA與植物與植物DNA連接處富含連接處富含A，T堿基對(duì)；堿基對(duì)； 植物植物DNA上的插入靶位點(diǎn)與上的插入靶位點(diǎn)與T-DNA邊界序列有一定程度邊界序列有一定程度 的同源性。的同源性。 24 2. T-DNA的整合機(jī)理的整合機(jī)理 雙鏈斷裂修復(fù)模型（雙鏈斷裂修復(fù)模型（DSBR model） 單鏈缺口修復(fù)模型（單鏈缺口修復(fù)模

20、型（SSGR model） 25 Sci，IF：9.205 26 27 Fig 4-6 Illegitimate recombination models for T-DNA integration. (a) Double-strand break- repair (DSBR) and single-strand gap-repair (SSGR) models equally explain the integration events leading to T-DNA insertion 621-x34. As outlined in the Discussion, the DSBR mo

21、del predicts a double-strand break in the target. Unwound or exonuclease processed ends of the T- DNA and of the target anneal by partial homologous pairing. Single-strand overhangs are removed by endo- or exonuclease digestion; the ends are repaired and ligated. The SSGR model predicts a nick in th

22、e target that is converted to a gap by a 5-3 exonuclease. The T-strand invades the gap and a synapsis is formed by partial pairing between T-DNA ends and target. The overhangs of the T-DNA are removed and the T-strand is ligated to the target. A nick introduced into the second strand of the target i

23、nitiates repair synthesis of the second strand of the T-DNA. (b) Application of the SSGR model for T-DNA insertion 621-36. As proposed in the model of insertion 621-x34, repair at the ends of invading T-strand may occur before ligation. Absence of an internal CAGT T-DNA sequence from the right junct

24、ion of insert 621-36 suggests that copying of the target plant DNA led to alteration of the right T-DNA end during integration. Mismatch repair may similarly explain the observed deletion. (c) A modified version of SSGR model explaining possible involvement of VirD2 protein in recombination events t

25、hat resulted in T-DNA insertions 621-37 and N6H-cs4. T-DNA invasion depicted in the model involves VirD2-mediated recognition of a nick (or gap) that is followed by ligation of the 5 end of the T- strand to the target DNA. The 3 end of the T-strand moves along the target, while the unwound target DN

26、A strand is removed by exonucleolytic digestion. At the position where the 3 end of the T-strand is stabilized by base-pairing, the T-strand is ligated to the target. At the same position a nick is introduced in the second strand of the target that defines the left break-point of target deletion and

27、 initiates the replication of the T-strand. Symbols used for presentation of putative recombination events are explained underneath the models. 28 3. T-DNA整合的遺傳效應(yīng)整合的遺傳效應(yīng) T-DNA插入的遺傳特性插入的遺傳特性： (1)T-DNA的插入不引起植物的插入不引起植物DNA大的重排。但多數(shù)插入會(huì)導(dǎo)大的重排。但多數(shù)插入會(huì)導(dǎo) 致靶位點(diǎn)處小的缺失，缺失多至致靶位點(diǎn)處小的缺失，缺失多至79個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸。 (2)另一個(gè)常見的結(jié)果是，在另一個(gè)

28、常見的結(jié)果是，在T-DNA植物植物DNA連接處，會(huì)有連接處，會(huì)有 幾個(gè)至幾個(gè)至33個(gè)核苷酸的個(gè)核苷酸的“填充填充”DNA（Filler DNA）存在，這）存在，這 些些“填充填充”DNA的序列與靠近連接處的植物的序列與靠近連接處的植物DNA序列相似序列相似。 (3)在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在在植物靶位處不要求有特異的序列，但若在T-DNA兩端和兩端和 植物靶位處之間有一段短序列（植物靶位處之間有一段短序列（510b）同源，則可以在整合）同源，則可以在整合 中起作用。中起作用。 29 五、農(nóng)桿菌五、農(nóng)桿菌TiTi質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建 1、Ti質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)

29、建質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建 2、中間載體、中間載體/表達(dá)載體的構(gòu)建表達(dá)載體的構(gòu)建 3、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建 30 1 1、TiTi質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建質(zhì)粒的改造及卸甲載體構(gòu)建 野生型野生型Ti質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙：質(zhì)粒直接作為植物基因工程載體，存在如下障礙： Ti質(zhì)粒分子量過大，一般在質(zhì)粒分子量過大，一般在160240kb，基因工程，基因工程中難以操中難以操 作作； 大型的野生大型的野生Ti質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)質(zhì)粒上分布著各種限制酶的多個(gè)切點(diǎn)，.難以難以找找 到可利用的單一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，不能通過體外到可利用的單一限制性

30、內(nèi)切酶位點(diǎn)，不能通過體外DNA重組技重組技 術(shù)直接向野生型術(shù)直接向野生型Ti質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因質(zhì)粒導(dǎo)入外源基因； T-DNA區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，區(qū)內(nèi)含有許多編碼基因，其中其中onc基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物干擾宿主干擾宿主 植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和植物中內(nèi)源激素的平衡，轉(zhuǎn)化細(xì)胞長(zhǎng)成腫瘤，阻礙細(xì)胞的分化和 植株的再生植株的再生； Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制, 即使得到重組質(zhì)粒，也只能在即使得到重組質(zhì)粒，也只能在 農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；而農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率極低（農(nóng)桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增；而農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化率極低（10左右）左右）,因此，因此， 通過通過Ti質(zhì)粒的體外操作

31、，在常規(guī)分子克隆條件下幾乎不能構(gòu)建在質(zhì)粒的體外操作，在常規(guī)分子克隆條件下幾乎不能構(gòu)建在 T-DNA中只有單一切點(diǎn)的載體中只有單一切點(diǎn)的載體； Ti質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于質(zhì)粒上還存在一些對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。轉(zhuǎn)移不起任何作用的基因。 31 為了使為了使Ti質(zhì)粒成為有效的外源基因?qū)胼d體，必須質(zhì)粒成為有效的外源基因?qū)胼d體，必須對(duì)野生對(duì)野生 型型Ti質(zhì)粒進(jìn)行一番科學(xué)的改造。質(zhì)粒進(jìn)行一番科學(xué)的改造。十分幸運(yùn)的是，大腸桿菌十分幸運(yùn)的是，大腸桿菌 具有能與農(nóng)桿菌高效地接合轉(zhuǎn)移的特性。因此，科學(xué)家們具有能與農(nóng)桿菌高效地接合轉(zhuǎn)移的特性。因此，科學(xué)家們 可以先將可以先將T-DNA片段克隆到大腸桿

32、菌的質(zhì)粒中，并插入片段克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒中，并插入 外源基因，最后通過接合轉(zhuǎn)移把外源基因引入到農(nóng)桿茵的外源基因，最后通過接合轉(zhuǎn)移把外源基因引入到農(nóng)桿茵的 Ti質(zhì)粒上，這是一種把預(yù)先進(jìn)行亞克隆、切除、插入或置質(zhì)粒上，這是一種把預(yù)先進(jìn)行亞克隆、切除、插入或置 換的換的T-DNA引入引入Ti質(zhì)粒的有效方法。帶有重組質(zhì)粒的有效方法。帶有重組T-DNA的的 大 腸 桿 菌 質(zhì) 粒 衍 生 載 體 稱 為大 腸 桿 菌 質(zhì) 粒 衍 生 載 體 稱 為 ” 中 間 載 體中 間 載 體 ” （intermediate vector），而接受中間載體的），而接受中間載體的Ti質(zhì)粒質(zhì)粒 則稱為受體則稱為受體T

33、i質(zhì)粒（質(zhì)粒（acceptor Ti p1asmid），一般是），一般是 卸甲載體（卸甲載體（disarmed vector）。）。 32 2、onc-卸甲載體卸甲載體 所謂卸甲載體就是無毒的（所謂卸甲載體就是無毒的（non-oncogenic）Ti質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體。 因?yàn)槔靡吧偷囊驗(yàn)槔靡吧偷腡i質(zhì)粒作載體時(shí)，影響植株再生的直接原因是質(zhì)粒作載體時(shí)，影響植株再生的直接原因是 T-DNA中中onc基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的基因的致瘤作用。因此，為了使野生型的Ti質(zhì)粒成質(zhì)粒成 為基因轉(zhuǎn)化的載體，必須切除為基因轉(zhuǎn)化的載體，必須切除T-DNA上的上的onc基因，即基因，即“解除解除”

34、 其其“ 武裝武裝”,構(gòu)建成所謂構(gòu)建成所謂“卸甲卸甲”或稱或稱“繳械繳械”載體（載體（disarmed vector）。在這種）。在這種onc-載體中，已經(jīng)缺失的載體中，已經(jīng)缺失的T-DNA部位被大腸桿部位被大腸桿 菌的一種常用的質(zhì)粒菌的一種常用的質(zhì)粒pBR322取代。這樣任何適合于克隆在取代。這樣任何適合于克隆在 pBR322質(zhì)粒中的外源質(zhì)粒中的外源DNA片段，都可以通過與片段，都可以通過與 pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒 DNA的同源重組，而被共整合到的同源重組，而被共整合到Onc-Ti質(zhì)粒載體上。質(zhì)粒載體上。 33 onc+卸甲載體卸甲載體 對(duì)于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)，以及對(duì)于以對(duì)于研究

35、外源基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)，以及對(duì)于以 改良農(nóng)作物為目的的植物基因工程而言，改良農(nóng)作物為目的的植物基因工程而言，onc-體系是最有體系是最有 用的。不過，人們可能還要設(shè)計(jì)一些特殊的實(shí)驗(yàn)來研究外用的。不過，人們可能還要設(shè)計(jì)一些特殊的實(shí)驗(yàn)來研究外 源基因在冠癭瘤組織中的表達(dá)問題。在這種情況下，使用源基因在冠癭瘤組織中的表達(dá)問題。在這種情況下，使用 onc+菌株載體則比較合適。由于冠癭瘤組織具有不依賴于菌株載體則比較合適。由于冠癭瘤組織具有不依賴于 激素的表型特征，所以這種載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于它可以快激素的表型特征，所以這種載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于它可以快 速地增生冠癭組織，比較快速而容易得到轉(zhuǎn)化體。速地

36、增生冠癭組織，比較快速而容易得到轉(zhuǎn)化體。 34 2 2、中間載體的構(gòu)建、中間載體的構(gòu)建 （1）中間載體的基本結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)）中間載體的基本結(jié)構(gòu)與特點(diǎn) 為解決為解決Ti質(zhì)粒不能直接導(dǎo)入目的基因的困難，構(gòu)建中間載質(zhì)粒不能直接導(dǎo)入目的基因的困難，構(gòu)建中間載 體（體（intermediate vector ）是有效方法之一。中間載體）是有效方法之一。中間載體 是一種在一個(gè)普通大腸桿菌的克隆載體（例如是一種在一個(gè)普通大腸桿菌的克隆載體（例如pBR322質(zhì)質(zhì) 粒）中插入了一段合適的粒）中插入了一段合適的T-DNA片段，而構(gòu)成的小型質(zhì)粒。片段，而構(gòu)成的小型質(zhì)粒。 中間載體通常是多拷貝的中間載體通常是多拷貝的E.

37、Coli小質(zhì)粒，這一點(diǎn)對(duì)于通過小質(zhì)粒，這一點(diǎn)對(duì)于通過 體外遺傳操作導(dǎo)入外源基因是非常必要的。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)看體外遺傳操作導(dǎo)入外源基因是非常必要的。從結(jié)構(gòu)特點(diǎn)看 可分為兩類中間載體，即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元載體可分為兩類中間載體，即共整合系統(tǒng)中間載體和雙元載體 系統(tǒng)中間載體。系統(tǒng)中間載體。 35 共整合系統(tǒng)中間載體的特征 中間載體必須含有與中間載體必須含有與Ti質(zhì)粒質(zhì)粒T-DNA區(qū)同源的序列，此外含有區(qū)同源的序列，此外含有pBR的序列，的序列， 在其被引入到根癌農(nóng)桿菌后即可高頻地與在其被引入到根癌農(nóng)桿菌后即可高頻地與Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA的同源序列進(jìn)的同源序列進(jìn) 行重組；行重組； 它應(yīng)具有一個(gè)

38、或幾個(gè)細(xì)菌選擇標(biāo)記，這將有利于篩選共整合質(zhì)粒；它應(yīng)具有一個(gè)或幾個(gè)細(xì)菌選擇標(biāo)記，這將有利于篩選共整合質(zhì)粒； 它必須它必須 有有bom位點(diǎn)，在有誘導(dǎo)質(zhì)粒存在的情況下，位點(diǎn)，在有誘導(dǎo)質(zhì)粒存在的情況下，bom位點(diǎn)的存在可位點(diǎn)的存在可 以使中間載體在不同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移；以使中間載體在不同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)移； 它應(yīng)該含有陽性植物選擇標(biāo)記，以利于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選，例如新霉它應(yīng)該含有陽性植物選擇標(biāo)記，以利于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選，例如新霉 素磷酸轉(zhuǎn)移酶素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycin phosphotransferase,Npt-)基因，其可基因，其可 賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞卡那霉素抗性；賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞卡那霉素抗

39、性； 它應(yīng)該含有單一的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，以利于外源基因的插入；它應(yīng)該含有單一的限制性內(nèi)切酶切點(diǎn)，以利于外源基因的插入； 無無Ti質(zhì)粒的邊界序列。質(zhì)粒的邊界序列。 36 雙元載體系統(tǒng)的中間載體 與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處是與共整合系統(tǒng)中間載體不同之處是: 無同源序列；無同源序列； 具有具有LB和和RB; 無無Co1E1復(fù)制點(diǎn)復(fù)制點(diǎn) 37 （2）中間表達(dá)載體）中間表達(dá)載體 啟動(dòng)子及其它調(diào)控序列啟動(dòng)子及其它調(diào)控序列 轉(zhuǎn)錄的調(diào)控對(duì)真核生物基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。就真核生物基因表轉(zhuǎn)錄的調(diào)控對(duì)真核生物基因表達(dá)起著關(guān)鍵性作用。就真核生物基因表 達(dá)調(diào)控序列而言，大多數(shù)真核生物在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的達(dá)調(diào)控序列而言，大

40、多數(shù)真核生物在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5端上游區(qū)第端上游區(qū)第30至至25bp 處具有處具有TATA盒，在盒，在70至至 80bp處還有處還有CAAT盒。在大多數(shù)真核生物基因的盒。在大多數(shù)真核生物基因的3 端具有端具有AATAA序列。這些序列。這些5和和3端的調(diào)控序列對(duì)真核生物的基因表達(dá)起著端的調(diào)控序列對(duì)真核生物的基因表達(dá)起著 關(guān)鍵性作用。關(guān)鍵性作用。Ti質(zhì)粒雖然來源于農(nóng)桿菌，質(zhì)粒雖然來源于農(nóng)桿菌， 但其但其Nos、Ocs、Tmr等基因具有等基因具有 與真核生物啟動(dòng)子類似的與真核生物啟動(dòng)子類似的TATA盒和盒和CAAT盒，均能在植物細(xì)胞中表達(dá)，并盒，均能在植物細(xì)胞中表達(dá)，并 且無組織特異性。因此，它們成為早

41、期構(gòu)建嵌合基因的啟動(dòng)子，其中以且無組織特異性。因此，它們成為早期構(gòu)建嵌合基因的啟動(dòng)子，其中以Nos 啟動(dòng)子（啟動(dòng)子（pNos）最常用。）最常用。 38 39 3、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建、植物基因轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)的構(gòu)建 （1）一元載體系統(tǒng)）一元載體系統(tǒng) （2）雙元載體系統(tǒng)）雙元載體系統(tǒng) 40 1一元載體系統(tǒng)的構(gòu)建 這一類載體是中間表達(dá)載體與改造后的受體這一類載體是中間表達(dá)載體與改造后的受體Ti質(zhì)粒之間，通過質(zhì)粒之間，通過 同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，通常亦稱為共整合載體同源重組所產(chǎn)生的一種復(fù)合型載體，通常亦稱為共整合載體 （co-intergrated vecter），又由于該載體的），又由

42、于該載體的T-DNA區(qū)與區(qū)與Ti 質(zhì)粒質(zhì)粒Vir區(qū)連鎖，因此又稱之為順式載體（區(qū)連鎖，因此又稱之為順式載體（cis-vector）。）。 一元載體的特點(diǎn)是一元載體的特點(diǎn)是:由兩個(gè)質(zhì)粒（由兩個(gè)質(zhì)粒（E.coli質(zhì)粒和質(zhì)粒和Ti質(zhì)粒）重組質(zhì)粒）重組 而成，分子量較大；共合體的形成頻率與兩個(gè)質(zhì)粒的重組頻而成，分子量較大；共合體的形成頻率與兩個(gè)質(zhì)粒的重組頻 率有關(guān)率有關(guān),相對(duì)較低；必須用相對(duì)較低；必須用Southern雜交或雜交或PCR對(duì)大的共整對(duì)大的共整 合體質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)；構(gòu)建時(shí)比較困難。一元載體系統(tǒng)目前主合體質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)；構(gòu)建時(shí)比較困難。一元載體系統(tǒng)目前主 要有兩種載體：共整合載體和拼接未端載體（

43、要有兩種載體：共整合載體和拼接未端載體（split-end vector,SEV）。）。 41 （1）共整合載體的構(gòu)建 共整合載體的特點(diǎn)是：中間表達(dá)載體與受體共整合載體的特點(diǎn)是：中間表達(dá)載體與受體Ti卸甲載體，通過同源重組共整合卸甲載體，通過同源重組共整合 而構(gòu)建；中間表達(dá)載體與受體而構(gòu)建；中間表達(dá)載體與受體Ti質(zhì)粒之間同源序列是質(zhì)粒之間同源序列是pBR322。 共整合載體的構(gòu)建共整合載體的構(gòu)建過程過程 l）中間載體）中間載體pLGV1103導(dǎo)入農(nóng)桿菌導(dǎo)入農(nóng)桿菌:目前通常采用兩種方法，即接合轉(zhuǎn)移法目前通常采用兩種方法，即接合轉(zhuǎn)移法 （conjugative transfer）和三親雜交轉(zhuǎn)移法。

44、）和三親雜交轉(zhuǎn)移法。 2）中間載體與受體）中間載體與受體Ti質(zhì)粒的同源重組。質(zhì)粒的同源重組。 3）共整合載體的選擇。）共整合載體的選擇。 42 大腸桿菌質(zhì)粒 大腸桿菌篩選標(biāo)記 農(nóng)桿菌篩選標(biāo)記 多克隆位點(diǎn) 重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 大腸桿菌 農(nóng)桿菌 細(xì)菌接合T-DNA區(qū)同源整合 農(nóng)桿菌 感染植物根部細(xì)胞T-DNA區(qū)整合在植物細(xì)胞基因組上 （2） SEV的構(gòu)建 SEV系統(tǒng)即系統(tǒng)即T-DNA邊界拼接系統(tǒng)，亦稱拼接末端載體（邊界拼接系統(tǒng)，亦稱拼接末端載體（sp1it-end vecter ,SEV）。它是由）。它是由Freley等人于等人于1985年建立的另一種共整合載體，也年建立的另一種共整合載體，也 因?yàn)樗?/p>

45、的兩個(gè)因?yàn)樗膬蓚€(gè)LIH序列在同源重組前分別處于不同質(zhì)粒上而得名。序列在同源重組前分別處于不同質(zhì)粒上而得名。SEV與與 pGV3850的差異及構(gòu)建過程如下述：的差異及構(gòu)建過程如下述： 1）SEV的受體的受體Ti質(zhì)粒的質(zhì)粒的T-DNA上的致瘤基因（上的致瘤基因（onc）及）及TR都已被缺失，都已被缺失，T- DNA的保留部分被稱為的保留部分被稱為“左邊界內(nèi)部同源區(qū)左邊界內(nèi)部同源區(qū)”（1eft inside homcology， LIH）。該受體）。該受體Ti質(zhì)粒還保留了質(zhì)粒還保留了Vir基因及其它正常的功能基因，同時(shí)還攜有基因及其它正常的功能基因，同時(shí)還攜有 用于細(xì)菌篩選的抗性基因。用于細(xì)菌篩選

46、的抗性基因。 2）SEV中間載體具有一個(gè)細(xì)菌的抗性基因，一個(gè)植物抗性基因及與受體中間載體具有一個(gè)細(xì)菌的抗性基因，一個(gè)植物抗性基因及與受體Ti 質(zhì)粒同源的質(zhì)粒同源的LIH序列及序列及TR。 3）通過三親雜交將中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，由于它們之間都具有）通過三親雜交將中間載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌后，由于它們之間都具有LIH同源序同源序 列，即可發(fā)生同源重組，形成列，即可發(fā)生同源重組，形成SEV的共整合載體。的共整合載體。 44 （3） SEV與pGV3850比較 兩者都是通過受體兩者都是通過受體Ti質(zhì)粒與中間載體同源重組而形成，故同質(zhì)粒與中間載體同源重組而形成，故同 屬于共整合的一元載體系統(tǒng)，但它們之間有著一

47、定的差異：屬于共整合的一元載體系統(tǒng)，但它們之間有著一定的差異： 1）它們的受體）它們的受體Ti質(zhì)粒與中間載體的結(jié)構(gòu)不同。質(zhì)粒與中間載體的結(jié)構(gòu)不同。pGV3850的左的左 右邊界在一個(gè)受體右邊界在一個(gè)受體Ti質(zhì)粒上，而質(zhì)粒上，而SEV來自二個(gè)質(zhì)粒，即來自二個(gè)質(zhì)粒，即TR來來 自中間載體。自中間載體。 2）同源序列不同。）同源序列不同。pGV3850重組的同源序列是重組的同源序列是pBR322， 而而SEV是是LIH。 3）SEV是更有效的共整合載體。由于是更有效的共整合載體。由于pGV3850共整合載體，共整合載體， 帶有大腸桿菌帶有大腸桿菌pBR322序列，外源基因嵌合在該序列中，因而序列，外

48、源基因嵌合在該序列中，因而 轉(zhuǎn)化的植物中也帶有重復(fù)的轉(zhuǎn)化的植物中也帶有重復(fù)的pBR322序列。此重復(fù)序列可能對(duì)序列。此重復(fù)序列可能對(duì) 轉(zhuǎn)化植物中的外源基因的穩(wěn)定性有影響，而轉(zhuǎn)化植物中的外源基因的穩(wěn)定性有影響，而SEV系統(tǒng)則排除了系統(tǒng)則排除了 這種可能。這種可能。 45 2雙元載體系統(tǒng) 雙元載體（binary vecter）系統(tǒng)是指 由兩個(gè)分別含T-DNA和Vir區(qū)的相容性 突變Ti質(zhì)粒構(gòu)成的雙質(zhì)粒系統(tǒng),又因?yàn)槠?T-DNA與Vir基因在兩個(gè)獨(dú)立的質(zhì)粒上， 通過反式激活T-DNA轉(zhuǎn)移,故稱之為反式 載體（trans vecter）. 46 （1）雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建原理 雙元載體主要包括兩個(gè)Ti質(zhì)

49、粒，即微型 Ti質(zhì)粒和輔助Ti質(zhì)粒。 Ti質(zhì)粒上的Vir基因與T-DNA具有反式 互補(bǔ)作用，Vir基因可以反式激活T-DNA的 轉(zhuǎn)移。其次，中間載體含有廣泛寄主范圍 質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)（oriV），而代替了共 整合載體中用以重組的同源區(qū)，能夠在任 何農(nóng)桿菌寄主里自發(fā)復(fù)制。 47 （4）雙元載體的構(gòu)建 將Mini Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有He1per Ti質(zhì)粒根癌農(nóng)桿 菌的途徑有兩條，一條是直接用純化的Mini Ti質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化速凍的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；另一條是與共整 合載體構(gòu)建一樣，采用三親接合的方式。Mini Ti質(zhì)粒 均能以E.coli的pRK2013為輔助質(zhì)粒，通過三親雜交 而接合轉(zhuǎn)移到含有輔助T

50、i質(zhì)粒的農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)。由于 E.coli的pRK2013不能在農(nóng)桿菌中復(fù)制最后消失，含 有Mini Ti質(zhì)粒和He1per Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌可直接 用于植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。 48 49 （5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較 雙元載體系統(tǒng)與一元載體系統(tǒng)之間有著較大的差異：雙元載體系統(tǒng)與一元載體系統(tǒng)之間有著較大的差異： 1）雙元載體不需要共整合過程，因此系統(tǒng)中的兩個(gè)質(zhì)粒不必含）雙元載體不需要共整合過程，因此系統(tǒng)中的兩個(gè)質(zhì)粒不必含 有同源序列。有同源序列。 2）Mini-Ti質(zhì)粒具有質(zhì)粒具有E.coli質(zhì)粒的復(fù)制位點(diǎn)、能在農(nóng)桿菌的寄質(zhì)粒的復(fù)制位點(diǎn)、能在農(nóng)桿菌的寄 主中復(fù)制，使其質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加主中

51、復(fù)制，使其質(zhì)粒的拷貝數(shù)增加10100倍，而且倍，而且Mini-Ti 質(zhì)粒分子量?。ㄙ|(zhì)粒分子量小（10kb），可以直接進(jìn)行體外遺傳操作。），可以直接進(jìn)行體外遺傳操作。 3）雙元載體不需經(jīng)過兩個(gè)質(zhì)粒的共整合過程，因此構(gòu)建的操作）雙元載體不需經(jīng)過兩個(gè)質(zhì)粒的共整合過程，因此構(gòu)建的操作 步驟比較簡(jiǎn)單。步驟比較簡(jiǎn)單。 4）由于）由于mini-Ti質(zhì)粒較小，并無共整合過程，因此質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒較小，并無共整合過程，因此質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到 農(nóng)桿菌比較容易，而且構(gòu)建的頻率較高。農(nóng)桿菌比較容易，而且構(gòu)建的頻率較高。 50 （5）一元載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)的比較 5）由于根癌農(nóng)桿菌感染的寄主范圍是由）由于根癌農(nóng)桿菌感染的寄主

52、范圍是由Vir基因及染色體上的基因及染色體上的 基因決定的，因此，使用雙元載體系統(tǒng)更便于根據(jù)轉(zhuǎn)化材料的基因決定的，因此，使用雙元載體系統(tǒng)更便于根據(jù)轉(zhuǎn)化材料的 來源不同選擇適宜的來源不同選擇適宜的He1per系統(tǒng)。系統(tǒng)。 6）雙元載體在外源）雙元載體在外源DNA轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞前，無需進(jìn)行同源重組，轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞前，無需進(jìn)行同源重組， 插入載體的外源基因變異可能要比插入載體的外源基因變異可能要比pGV3850系統(tǒng)來得小。系統(tǒng)來得小。 7）共整合載體系統(tǒng)比雙元載體系統(tǒng)更難以應(yīng)用，通常一個(gè)共整）共整合載體系統(tǒng)比雙元載體系統(tǒng)更難以應(yīng)用，通常一個(gè)共整 合載體在用于植物轉(zhuǎn)化之前，應(yīng)弄清合載體在用于植物轉(zhuǎn)化之前，

53、應(yīng)弄清Ti質(zhì)粒的拷貝數(shù)和大小，質(zhì)粒的拷貝數(shù)和大小， 所以必須通過所以必須通過southern雜交來鑒定。雜交來鑒定。 8) 共整合載體的重組頻率很低，而雙元載體系統(tǒng)的兩個(gè)質(zhì)粒接共整合載體的重組頻率很低，而雙元載體系統(tǒng)的兩個(gè)質(zhì)粒接 合的頻率較高，一般至少高合的頻率較高，一般至少高4倍，因此雙元載體的構(gòu)建頻率較高。倍，因此雙元載體的構(gòu)建頻率較高。 9）共整合載體構(gòu)建成功后，工程菌的穩(wěn)定性較好，雙元載體穩(wěn)）共整合載體構(gòu)建成功后，工程菌的穩(wěn)定性較好，雙元載體穩(wěn) 定性較差，容易丟失。定性較差，容易丟失。 10）雙元載體在外源基因的植物轉(zhuǎn)化中效率高于共整合載體。）雙元載體在外源基因的植物轉(zhuǎn)化中效率高于共整

54、合載體。 51 載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記及報(bào)告基因載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記及報(bào)告基因 選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因必須必須具備以下四個(gè)條件具備以下四個(gè)條件： 編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶； 基因較小，可構(gòu)成嵌合基因基因較小，可構(gòu)成嵌合基因； 能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)； 檢測(cè)容易，并且能定量分析檢測(cè)容易，并且能定量分析。 選擇選擇標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因和篩選標(biāo)記基因差異：標(biāo)記基因差異： 選擇選擇標(biāo)記基因的功能主要是該基因的產(chǎn)物給予植物細(xì)胞產(chǎn)生標(biāo)記基因的功能主要是該基因的產(chǎn)物給予植物細(xì)胞產(chǎn)生 一種選擇壓力，致使

55、未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育與分化。而一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育與分化。而 轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長(zhǎng)等，從而將轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長(zhǎng)等，從而將轉(zhuǎn)化 細(xì)胞選擇出來，例如，細(xì)胞選擇出來，例如， Cat（氯霉抗性基因）（氯霉抗性基因）。 篩選篩選標(biāo)記基因強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識(shí)別標(biāo)記基因強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識(shí)別 作用，故稱報(bào)告基因。作用，故稱報(bào)告基因。 52 1選擇標(biāo)記的應(yīng)用 選擇標(biāo)記的功能是在選擇壓力下把轉(zhuǎn)化體選擇出來。為達(dá)到這選擇標(biāo)記的功能是在選擇壓力下把轉(zhuǎn)化體選擇出來。為達(dá)到這 一目的，首先要在選擇培養(yǎng)基中加入選擇劑，產(chǎn)生一種選擇壓力，一目的，首先要在選擇培養(yǎng)基中加入選擇劑，產(chǎn)生一種選擇壓力， 致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育。其次是選擇標(biāo)記基因的產(chǎn)物對(duì)選致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育。其次是選擇標(biāo)記基因的產(chǎn)物對(duì)選 擇劑產(chǎn)生抗性，致使轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受選擇劑的影響，能正常生長(zhǎng)、發(fā)擇劑產(chǎn)生抗性，致使轉(zhuǎn)化細(xì)胞不受選擇劑的影響，能正常生長(zhǎng)、發(fā) 育、分化，從而把轉(zhuǎn)化體選擇出來。育、分化，從而把轉(zhuǎn)化體選擇出來。 近年來已研究出較多的選擇標(biāo)記基因。近年來已研究出較多的選擇標(biāo)記基因。 在選擇標(biāo)記的使用中值得注意的是標(biāo)記基因的正確選擇。沒有在選擇標(biāo)記的使用中值得注意的是標(biāo)記基因的正