一株微生物采油菌的16SrDNA鑒定和綠色熒光蛋白分子標記

1、第 卷 第 期 徐 州 工 程 學 院 學 報 （自 然 科 學 版 ） （ ） 年 月一株微生物采油菌的 鑒定和綠色熒光蛋白分子標記王 欲 曉，莊 文 昌，王靖（徐 州 工 程 學 院 ，江 蘇 徐 州 ；中 國 石 油 大 學 化 工 學 院 ，北 京 ）摘 要 ：篩選到一 株 高效生產(chǎn)多糖的 菌 ，油田先導試驗證明該菌可 以 用于微 生 物 調(diào) 剖 提 高 原油 采 收 率 （，）經(jīng) 分 析 鑒 定 ， 菌 屬 于 腸 內(nèi) 桿 菌 屬（），為跟 蹤 監(jiān)測其動態(tài)信息 ，構(gòu) 建 表達綠色熒光蛋白 （， ）的 重 組 質(zhì) 粒 （），利 用 法 將 其 轉(zhuǎn) 化 至 菌 ，利用熒光顯微鏡可以觀 察

2、 到 重 組 （）工 程 菌 的 綠 色 熒 光 結(jié) 果 表 明 菌可以被綠色熒光蛋 白 基 因標 記 ，用 于 微 生 物 采 油 研 究 關(guān) 鍵 詞 ：微 生 物 采 油 菌 ； 鑒 定 ；綠 色 熒 光 蛋 白 ；重 組 質(zhì) 粒中 圖 分 類 號 ： 文 獻 標 志 碼 ：文 章 編 號 ：（）微 生 物 提 高 原 油 采 收 率 （，簡 稱 ）是 一 種 新 型 提 高 原 油 采 收 率 的方 法 它 適 用 范 圍 廣 、工 藝 簡 單 、投 資 少 、見 效 快 、功 能 多 、無 污 染 、注 入 的 微 生 物 和 營 養(yǎng) 物 既 便 宜 又 容 易 獲 得，在 礦 場 條

3、 件 下 易 于 監(jiān) 測 ，是目前具有發(fā)展前景的一項采油 技 術(shù) 從 世 紀 年 代 起 ，前 蘇 聯(lián) 和 東 歐 一些國 家進 行了多次 微生物采油現(xiàn)場試驗 ，普 遍 取 得 成 功 ，結(jié)果表明細菌 采 油對 低 產(chǎn) 井 效果較好篩 選 優(yōu) 秀 菌 種 是 技 術(shù) 的 關(guān) 鍵 所 在 ， 的 快 速 分 析 鑒 定 可 以 了 解 菌 種 的 種 屬 關(guān) 系，而 熒光 標記 可以快速 跟蹤和研究優(yōu)勢菌的動 態(tài) 信 息 ，更 好 的 為 技 術(shù) 服 務 年 等克 隆 了 基 因 的 ，并 分 析 了 的 一 級 結(jié) 構(gòu) ；年 等首 次 在 大 腸 桿 菌 細 胞 和 線 蟲 中 表 達 了 目

4、 前 研 究表 明 ，綠 色 熒 光 蛋 白 可以作為分子標記物 ，通 過 基 因 工 程 手 段 ，在 不 影 響 微 生 物 自 身 性 狀 的 前 提 下 ，導 入 生 物 體 ，使得新構(gòu)建的生物產(chǎn)生易于觀察的現(xiàn)象 材 料 與 方 法材 料菌 種 和 質(zhì) 粒 菌 ，本 實 驗 室 篩 選 ，可 以 高 效 生 產(chǎn) 多 糖 ，用于微生物采油 ，購 自 公 司 ，用 于 高效 轉(zhuǎn) 化 外 源 基 因 的 菌 株 質(zhì) 粒 ，購 自 華 美 生 物 技 術(shù) 公 司 ，克 隆 載 體 ，用 于 高 效 率 連 接 產(chǎn) 物 包 含 基 因 的 重 組 質(zhì) 粒 （），本 實 驗 室 構(gòu) 建 培 養(yǎng) 基

5、 和 主 要 試 劑完 全 培 養(yǎng) 基 （）：蛋 白 胨 ，葡 萄 糖 ，酵 母 粉 ，牛 肉 膏 ， 值 ； 培 養(yǎng) 基（）：胰 蛋 白 胨 ，酵 母 粉 ，氯 化 鈉 ， ； 加 葡 萄 糖 液 體 培 養(yǎng) 基 ： 培 養(yǎng) 基 加 葡 萄糖 限 制 性 內(nèi) 切 酶 、 、 購 自 大 連 ；、（）、溶 菌 酶 、（）購 自 上 海收 稿 日 期 ：基 金 項 目 ：國家高科技研究發(fā)展計劃 （ 計 劃 ）項 目 （）作 者 簡 介 ：王 欲 曉 （），男 ，江 蘇 徐 州 人 ，碩 士 ，講 師 ，主要從事微生物采油研究 通 訊 作 者 ：王 靖 （），女 ，北 京 人 ，博 士 ，教 授

6、，主要從事生物化學和微生物研究 （ ）生 物 工 程 有 限 公 司 ；其 他試劑為國 產(chǎn)分析純或優(yōu)級純 ，試劑用水均為重 蒸 去離 子 水 方 法 菌 的 分 子 鑒 定 菌 提 取 基 因 組 和 反應體系參考文獻 ， 擴 增 上 游 引 物 ： ，下 游 引 物 ： ， 預 變 性 ， ， ， ，共 反 應個 循 環(huán) ； ， 停 止 瓊 脂 糖 膠 中 回 收 純 化 片 段 ， 產(chǎn) 物 純 化 后 ，連 接 到 質(zhì) 粒 上 ， 序 列 測 定 委 托 上 海 生 物 工 程 有 限 公 司 完 成 將 測 定 得 到 的 的 序 列 與 數(shù) 據(jù) 庫 中 的 相 關(guān) 菌 的 用 進 行

7、比 對 分 析 ，分 析 各 序 列 間 的 相 似 性 ；利 用 分析不同菌株的 之間的進化距離 ，構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進 化 樹 重 組 質(zhì) 粒 （） 轉(zhuǎn) 化 菌和綠色熒光檢 測 及 分 子 檢 測 法 將 用 包 含 基 因 的 重 組 質(zhì) 粒 （） 轉(zhuǎn) 化 菌 ，參 考 文 獻 ，篩 選 陽 性 克 隆菌 落 綠 色 熒 光 檢 測 ：在 培 養(yǎng) 基 中 ， 培 養(yǎng) 菌的陽性重組克隆 ，在 為時 加 入 至 終 物 質(zhì) 的 量 濃 度 為 ，繼 續(xù) 誘 導 培 養(yǎng) ，熒 光 顯 微鏡 檢測到顯熒光的 菌 最 多 陽 性 菌克隆小提質(zhì)粒 ， 擴 增 基 因 ，引 物 合 成 由 上 海 生

8、物 工 程 有 限 公 司 合 成上 游 引 物：；下 游 引 物： 所 使用的退火溫度一般低于引物 值 的溫度引物 值估算根據(jù)公式 （）（）一般反應程序： ， ， ，共 個 循 環(huán)， 延 伸 產(chǎn) 物 經(jīng) 瓊 脂 糖 電 泳 檢 測基因陽性 菌轉(zhuǎn)化子擴大培養(yǎng)，離心后收集菌體，超聲破碎細胞，表達蛋白經(jīng) 電泳檢測結(jié) 果 和 分 析 野 生 菌 的 分 子 鑒 定根 據(jù) 的 通 用 引 物 ，在 最 佳 的 條 件 下 擴 增 出 菌 的 序 列 經(jīng) 大 連 寶 生 物 公 司 測 序 ，得 到 的 序 列 ，如 圖 將 此 序 列 與 、 數(shù) 據(jù) 庫 中 的 序列 進 行 （），得 到 了 種 與

9、 菌 株 同 源 性 較 高 的 菌 株 序 列 ，見 表 用 軟件比對分析序 列 之 間 的 相 似 值 ，然 后 用 軟 件 計 算 出 序 列 的 系 統(tǒng)進 化 距 離 ，采 用 鄰 位 相 連 法 構(gòu) 建 出 菌 株 和 中 個親緣關(guān)系較近 的 桿菌的系統(tǒng)發(fā)育樹 如 圖 所 示 分 析 表 明 ，菌 株 和 、 的 相 似 值 較 高 ，進 化 距 離 較 小 ，其中 與 （）相 似 值 最 高 為 菌 的 序 列 與 和 的 相 似 性 較 高 ，表明該菌屬于腸內(nèi)桿菌屬 （） 重 組 菌 的 熒 光 檢 測重 組 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 化 菌 ，經(jīng)鑒定及純化后 ，挑 取 單 菌 落 ，接 種

10、表 達 培 養(yǎng) 基 （含 終 質(zhì) 量 濃 度 為 ）液 體 培 養(yǎng) 基 中 ， 振 搖 過 夜 以 體 積 分 數(shù) 的 接 種量轉(zhuǎn)接至新鮮的 表 達 培 養(yǎng) 基 中 （含 終 質(zhì) 量 濃 度 為 ） 培 養(yǎng) 至 值 之 間 ，加 入 誘 導 劑 至 終 物 質(zhì) 的 量 濃 度 為 繼 續(xù) 誘 導 培 養(yǎng) 一 定 時 間 后 取 樣 ，用 熒 光 顯 微 鏡 觀 察 ， 的 熒 光 檢 測 使 用 日 本 熒 光 顯 微 鏡 （ 顯 微 鏡 數(shù) 碼 相 機 ， 汞 燈 ， 濾 光 片 ，吸 收 濾 鏡 ，分 光 鏡 ， 藍 光 激 發(fā) ，目 鏡 ，物 鏡 ），使 用 軟 件 獲 取 圖 像 熒

11、光 檢 測 結(jié) 果 見 圖 ，說 明 重 組 菌成功表達綠色熒 光 蛋白 重 組 菌 檢 測 菌 的陽性轉(zhuǎn)化子擴大培養(yǎng)后 ，小 提 質(zhì) 粒 ， 檢 測 基 因 檢 測 結(jié) 果 如 圖 ，在 左 右 處 ，出 現(xiàn) 明 顯 的 基 因 條 帶 ，表 明 菌的陽性轉(zhuǎn)化子含有 基 因 徐州工程學院學報 （自 然 科 學 版 ） 年 第 期 圖 野 生 菌 的 全 序 列表 與 菌同源性較高的 株 菌 的 的 序 列 號菌 株特性序 號 圖 基 于 序 列 同 源 性 的 菌 株 間 的 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹（） 基 因 標 記 的 菌 陽 性 轉(zhuǎn) 化 子（）野 生 菌圖 重 組 菌的熒光顯微鏡照片 （）

12、經(jīng) 誘 導 的 菌 陽 性 轉(zhuǎn) 化 子 ，離 心 后 收 集 菌 體 ，超 聲 破 碎 細 胞 ，表 達 蛋 白 經(jīng) 電 泳 檢測 ，見 圖 ，表 明 ： 菌 轉(zhuǎn) 化 子 在 相 對 分 子 質(zhì) 量 萬處有一明顯條帶 ，和 報 道 的 的 相 對 分 子 質(zhì) 量 一 致 ，說 明 菌 轉(zhuǎn) 化 子 已 經(jīng) 成 功 表 達 出 蛋 白 注 ： 為相對分子質(zhì)量標記 ； 為 左 右 的 基 因 條 帶 圖 重 組 菌 陽 性 轉(zhuǎn) 化 子 質(zhì) 粒 的注 ： 為相對分子質(zhì)量標記 ；為 野 生 菌表達的總蛋白 ；為 重 組 菌 陽 性 轉(zhuǎn) 化 子 經(jīng) 誘導表達的總蛋白 徐州工程學院學報 （自 然 科 學 版

13、 ） 年 第 期結(jié) 語經(jīng) 分 析 鑒 定 ， 菌屬于腸內(nèi)桿菌屬 （），利 用 法 成 功 轉(zhuǎn) 化 重 組 質(zhì) 粒 （） 至 菌 ，利用熒光顯微鏡可以觀察到 重 組 工程菌高效表達 綠 色 熒 光 本 研 究 為 跟 蹤 監(jiān)測 采 油 優(yōu) 勢 菌 種 ，為微 生物提高原 油采收率提供參考 參 考 文 獻 ：李 希 明 ，馮 時 林 ，曾 慶 坤 ，等 微生物采油技術(shù)研究 油氣采收率技術(shù) ，（）：羅 躍 ，佘 躍 惠 微生物采油技術(shù)研究的國內(nèi)外動態(tài)及本源微生物采油技術(shù) 國內(nèi)外油田工程 ，（）：周 琳 ，張 杰 群 落 分 析 中 的 及 其 基 因 優(yōu) 化 擴 增 微 生 物 學 報 ，（）： ， ， ，（）： ，（）：鄧 超 ，黃 大 昉 ，宋 福 平 綠色熒光蛋白及其應用 中