CMV啟動子之歐陽引擎創(chuàng)編

1、CM V啟動子歐陽引擎(2021.01.01)質(zhì)粒設(shè)計時都需要加入啟動子序列，以保證目的基因的表達(dá)。 啟動子可分為誘導(dǎo)型啟動子和組成型啟動子兩大類，后者包括 CMV, SV40, T7, pMCl, PGK 啟動子等。zhengzzh 對 CMV 和 T7的來源做了介紹。啟動子是基因(gene)的一個組成部分，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn) 錄)的起始時間和表達(dá)的程度。啟動子(Promoters)就像“開 夫”,決定基因的活動。既然基因杲成序列的核昔酸 (nucleotides),那么啟動子也應(yīng)由DNA組成。啟動子本身并 不控制基因活動，而是通過與稱為轉(zhuǎn)錄(inscription)因子的 這種蛋白質(zhì)(pro

2、teins)結(jié)合而控制基因活動的。轉(zhuǎn)錄因子就像 廂旗子”，指揮著酶(enzymes) (RNA聚合酶polymerases) 的活動。這種酶制造著基因的RNA復(fù)制本?；虻膯幼硬糠?發(fā)生改變(突變)，則導(dǎo)致基因表達(dá)的調(diào)節(jié)障礙。T7啟動子杲 當(dāng)今大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的主流，這個功能強(qiáng)大兼專一性高的啟 動子經(jīng)過氏妙的設(shè)計而成為原核表達(dá)的首選，尤其以Novagen 公司的pET系統(tǒng)為杰出代表。強(qiáng)大的T7啟動子完全專一受控于 T7 RNA聚合酶，而高活性的T7 RNA聚合酶合成mRNA的速 度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍一一當(dāng)二者同時存在時，宿主 本身基因的轉(zhuǎn)錄競爭不過T7表達(dá)系統(tǒng)，幾乎所有的細(xì)胞資源都

3、 用于表達(dá)目的蛋白；誘導(dǎo)表達(dá)后僅幾個小時目的蛋白通?？梢?占到細(xì)胞總蛋白的50%以上。由于大腸桿菌本身不含T7 RNA 聚合酶，需要將外源的T7 RNA聚合酶引入宿主菌，因而T7 RNA聚合酶的調(diào)控模式就決定了 T7系統(tǒng)的調(diào)控模式非誘 導(dǎo)條件下，可以使目的基因完全處于沉默狀態(tài)而不轉(zhuǎn)錄，從而 避免目的基因毒性對宿主細(xì)胞以及質(zhì)粒穩(wěn)定性的影響；通過控 制誘導(dǎo)條件控制T7 RNA聚合酶的量，就可以控制產(chǎn)物表達(dá) 量，某些情況下可以提高產(chǎn)物的可溶性部分。有幾種方案可用 于調(diào)控T7 RNA聚合酶的合成，從而調(diào)控T7表達(dá)系統(tǒng)。1.噬菌 體DE3是lambda噬菌體的衍生株，含有l(wèi)ad抑制基因和位于 lacUV

4、5啟動子下的T7 RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如 BL21(DE3)就是最常用的表達(dá)菌株，構(gòu)建好的表達(dá)載體可以直 接轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株中，誘導(dǎo)調(diào)控方式和lac樣都是IPTG誘導(dǎo)。2.號一種策略杲用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因， 即可完全避免因目的蛋白對宿主細(xì)胞的潛在毒性而造成的質(zhì)粒 不穩(wěn)定。然后用XCE6噬菌體侵染宿主細(xì)胞 E6是lambda 噬菌體含溫度敏感突變(cI857ts)和pL/pR啟動子控制T7 RNA聚 合酶表達(dá)的衍生株，在熱誘導(dǎo)條件下可以激活T7 RNA聚合酶 的合成。此了噬菌體之外，還可以通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒提供T7 RNA 聚合酶。比如有人用受溶氧濃度控制的啟動子

5、調(diào)控T7 RNA聚 合酶合成，據(jù)說這比較適合工業(yè)化發(fā)酵的條件控制。由于T7 RNA聚合酶的調(diào)控方式仍有可能有痕量的本底表達(dá)，控制基礎(chǔ) 表達(dá)的手段之一是培養(yǎng)基外加葡萄糖，有助于控制本底表達(dá)水 平；之二杲采用帶有T7 lac啟動子的載體在緊鄰T7啟動子 的下游有一段lad操縱子序列編碼表達(dá)lac阻遏蛋白(lad), lac 阻遏蛋白可以作用于宿主染色體上T7 RNA聚合酶前的lacUV5 啟動子并抑制其表達(dá)，也作用于載體T7 lac啟動子，以阻斷任 何T7 RNA聚合酶導(dǎo)致的目的基因轉(zhuǎn)錄。pLacI轉(zhuǎn)化也是同樣的 原理。如果這還不夠，更為嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控手段還有在宿主菌中 表達(dá)另一個可以結(jié)合并抑制T7 R

6、NA聚合酶的基因T7溶菌 酶基因，降低本底。常用的帶溶菌酶質(zhì)粒有pLysS和pLysE,相 容的ori都不會影響后繼的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，前者表達(dá)的溶菌酶的 水平要比后者低得多，對細(xì)胞生長影響小，而pLysE會明顯降 低宿主菌的生長水平，容易出現(xiàn)過度調(diào)節(jié)，增加蛋白表達(dá)的滯 后時間，從而降低表達(dá)水平。通過幾種不同方法來巧妙調(diào)控T7 聚合酶合成，T7啟動子發(fā)展出了史上功能最強(qiáng)大，最豐富的表 達(dá)系統(tǒng)。CMV： CMV基因組有229kb,屬皰疹病毒亞卩科。CMV DNA只有一個單向性的IE啟動子復(fù)合體，可指導(dǎo)多個基 因的表達(dá)1。在IE94基因上游存在一個強(qiáng)啟動子，IE94的上游 區(qū)比SV40病毒的72bp重

7、復(fù)序列具有更高的增強(qiáng)子功能。IE94 基因啟動子區(qū)序列分析證明這一區(qū)段內(nèi)有多個回文結(jié)構(gòu)，并相 間著保守的序列。在這一區(qū)段的-50-580bp之間至少有4套 13_18bp的重復(fù)序列。IE1和IE2蛋白的表達(dá)受增強(qiáng)子的調(diào)控， 此增強(qiáng)子也稱為主要增強(qiáng)子立即早期啟動了一增強(qiáng)子.IE1/IE2 增強(qiáng)子或CMV增強(qiáng)子，是上游調(diào)節(jié)區(qū)復(fù)合體的一部分。因集中 了細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)而具有異常高的活性，并且在多種類 型的細(xì)胞的影響條件下均有活性。根據(jù)對基因表達(dá)的影響可將 此增強(qiáng)子分為3個區(qū)。在CMV感染中，增強(qiáng)子調(diào)控的表達(dá)先激 活后抑制。在CMV復(fù)制早期可誘導(dǎo)NF-kB. AP-1和 CREB/ATF等細(xì)胞轉(zhuǎn)錄

8、因子與增強(qiáng)子中多位點(diǎn)結(jié)合。感染后可 誘導(dǎo)產(chǎn)生NF-kB和aPJ。在感染晚期，ATF的結(jié)合受影響，其 活性受病毒基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。CMV啟動子/增強(qiáng)子被廣泛應(yīng)用 于構(gòu)建高效真核表達(dá)載體，用于基因工程、基因治療和DNA免 疫9。用基因小鼠分析CMV增強(qiáng)子活性，其主要立即早期啟 動子（MIEP）的轉(zhuǎn)錄活性可能部分決定病毒在子宮內(nèi)特異性感 染胎兒組織的能力10o MIEP不是廣泛特異性的啟動子，因在 轉(zhuǎn)基因小鼠中，表達(dá)由MIEP調(diào)控的報告基因的組織和CMV自 然感染的組織一致的CMV是大家公認(rèn)的啟動真核基因表達(dá)的最有力量的啟動子。也 可以作為II型啟動子啟動shRNA的表達(dá)。但是它的啟動效應(yīng)不 會被六個

9、T終止，所以如何構(gòu)建啟動shRNA的表達(dá)的CMV啟 動子是一個非常有意義的話題。同時，相比較Hl/u6啟動子是屬于原核啟動子，在真核細(xì)胞里 廂的啟動效率非常低，所以介導(dǎo)的干擾效應(yīng)也是非常有限的。 研就、推廣CMV啟動子介導(dǎo)干擾效應(yīng)，意義重大，希望大家踴 躍提出寶貴意見，相互交流，共同提高！ 搞笑：1)商業(yè)公司的載體上的Hl和U6啟動子不是人源就是 鼠源的；2) CMV啟動子用來表達(dá)shRNA序列只是Ambion公 司的產(chǎn)品有，而且杲修飾過的CMV啟動子，不杲常見的。 感愛好，最近也在看shRNA的問題，關(guān)于II型啟動子，我看到國 內(nèi)吉凱基因(genechem)公司推出了一系列的該型載體pGCL

10、M 系列載體，使用的是CMV等polll識別的啟動子，沒用過,想冋冋 用過的/有經(jīng)驗的大俠，效果怎樣？號外,我看吉凱的shRNA載體 的MCS是插在報告基因后的一段microRNA結(jié)構(gòu)序列“中間，不 太清楚microRNA結(jié)構(gòu)序列是指的什么我們自己設(shè)計的shRNA 不就是參照內(nèi)源的miR30-a結(jié)構(gòu)設(shè)計的么？請求高手解惑.3X A LOT另，請教樓上大俠和各位，表達(dá)siRNA的CMV啟動子和我 們常說的CMV啟動子有什么不同？“H1和U6啟動子不是人源就是鼠源的光角實(shí)如此，但是它是一 種啟動效果比交差的啟動子。比起CMV啟動子地啟動效率要 差。請教樓上大俠和各位，表達(dá)siRNA的CMV啟動子和我們常說的 CMV啟動子有什么不同？給你說一種方法，自己去找答案：1。 找ambion公司網(wǎng)站，把CMV序列根據(jù)位點(diǎn)找出來。2O找 invitrogen或者promege公司網(wǎng)站，把真核表達(dá)載體的CMV序 列找出來。3。對比。這樣，不就知道了？！要學(xué)會自己學(xué)習(xí)