吸收光檢測原理及應用

1、吸收光檢測原理及應用 1. 檢測原理 a）布格-朗伯-比爾定律，是光吸收的基本定律，適用于所有的電磁輻射和所有的吸光物質, 包括氣體、固體、液體、分子、原子和離子。比爾 -朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和 光電比色法的定量基礎。 b）朗伯-比爾定律：0D = ?C光吸收值（0D）與濃度成正比 c）比爾一朗伯定律數(shù)學表達式 ：A=lg（1/T）=Kbc A為吸光度,T為透射比，是透射光強度比上入射光強度K為摩爾吸收系數(shù)它與吸收物質的性 質及入射光的波長入有關 c為吸光物質的濃度b為吸收層厚度 d）物理意義是當一束平行單色光垂直通過某一均勻非散射的吸光物質時，其吸光度A與吸 光物質的濃度c及吸收

2、層厚度b成正比。 2. 吸收光的應用 a）生物大分子定量：基于 260nm、280吸收光檢測-核酸定量 核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。 吸收紫外光的性質是嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵系統(tǒng)所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及 一切含有它們的物質，不論是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的性質。最佳測量 值的范圍為0.1至1.0。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不 同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當于 50卩g / mL 的 dsDNA, 37 卩 g / mL 的 ssDNA, 40 卩 g/mL 的 RNA, 30 卩 g/mL 的寡核苷酸。 ii. A

3、280nm是蛋白和酚類物質最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估 純DNA的A260/A280比值為1.8,純RNA為2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳 香族）或酚類物質的污染，需要純化樣品。 iii. A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進行核酸樣品純度評估 純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于 2.0表明樣品被碳水化合物 （糖類）、鹽類或有機溶劑污染，需要純化樣品。 iv. A320nm或A340nm為檢測溶液樣品的濁度，該值應該接近0.0。假如不是，標明溶 液中有懸浮物，需要純化樣品。 v. 核酸的吸光值受 pH值和緩沖液離子濃度影響。

4、只有在一定的 pH值和低離子濃度的 條件下（如10 mM Tris-HCI pH8.0），才能得到精確的檢測結果。 b）生物大分子定量：基于260nm、280吸收光檢測-蛋白定量 i. 蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質溶液在 275280nm 具有一個吸收紫外吸收高峰。 在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質溶液在最大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，服從 朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測定蛋白質的濃度范圍為0.11.0mg/mL。 ii. 由于不同蛋白質中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋 白質溶液在280nm的光吸收值也不同。據(jù)初步統(tǒng)計，濃度為1.0

5、 mg/mL的1800種 蛋白質及蛋白質亞基在 280nm的吸光度在0.33.0之間，平均值為1.25 0.51。所 以此種方法測量的準確度差一點 。 iii. 若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質，在280nm處來測量蛋白質含 量時，會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比 280nm更強，但蛋白質卻恰 恰相反，因此可利用 280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質的含量。 iv. 常用下列經(jīng)驗公式計算：蛋白質濃度（mg/mL） =1.45A280-0.74A260 ; （A280和 A260分別為蛋白質溶液在 280nm和260nm處測得的吸光度值） v. 還可以通過下述經(jīng)驗

6、公式直接計算出溶液中的蛋白質的含量： 蛋白質濃度（mg/mL） =F* A280*D*1/d ;其中A280為蛋白質溶液在 280nm處測得 的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm） ;D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子 c）酶聯(lián)免疫吸附實驗-ELISA疾病因子，動物疫病，食品安全 i. 使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某 種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的 活性。 ii. 在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟 與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體 復

7、合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一 定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中 受檢物質的量直接相關，故可根據(jù)顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的 催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度 。 iii. 如今ELISA方法已被廣泛應用于多種細菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面， ELISA在豬傳染性胃腸炎、牛副結核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍舌病 等的診斷中已為廣泛采用的標準方法。 d）細菌、細胞生長密度及生長曲線繪制：基于OD600吸光值 i. 單細胞微生物的發(fā)酵具有四個階段，即I

8、調(diào)整期（延滯期）、n對數(shù)期（生長旺盛 期）、川平衡期（穩(wěn)定期）、w死亡期（衰亡期）。 ii. 生長曲線可表示細菌從開始生長到死亡的全過程的動態(tài)。不同的微生物有不同的生 長曲線，同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其生長曲線也不一樣。因此，測定微 生物的生長曲線對于了解和掌握微生物的生長規(guī)律是很有幫助的。 iii. 測定微生物生長曲線的方法很多，有血球計數(shù)板法、平板菌落計數(shù)法、稱重法和比 濁法等。本實驗 采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與混濁度成正比，因此，可 利用分光光度計測定細菌懸液的光密度來推知菌液的濃度。將所測得的光密度值 （OD600）與其對應的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生

9、長曲線。注 意，由于光密度表示的是培養(yǎng)液中的總菌數(shù)，包括活菌與死菌，因此所測定的生長 曲線的衰亡期不明顯。 e）細胞的毒性及增值：MTT、XTT、CCK8 i. 檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫 色結晶甲臢（Zo）（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜 （DMSO）能溶解細胞中的甲臢（Za），用酶標儀在490nm波長處（英文說明書寫的 是570nm）測定其光吸收值，在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成 正比。根據(jù)測得的吸光度值（ OD值），來判斷活細胞數(shù)量， OD值越大，細胞活性 越強（如果是測藥物毒性，則表示藥物

10、毒性越?。?。 ii. XTT作為線粒體脫氫酶的作用底物，被活細胞還原成水溶性的橙黃色甲臢產(chǎn)物。當 XTT與電子偶合劑（例如 PMS）聯(lián)合應用時，其所產(chǎn)生的水溶性的甲臢產(chǎn)物的吸光 度與活細胞的數(shù)量成正比。 優(yōu)點：1、使用方便，省去了洗滌細胞；2、檢測快速；3、靈敏度高，甚至可以測定 較低細胞密度；4、重復性優(yōu)于MTT。 缺點：XTT水溶液不穩(wěn)定，需要低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。 iii. Cell Counting Kit簡稱CCK試劑盒，是一種基于 WST-8 （化學名：2-（2-甲氧基-4-硝苯 基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒 性的

11、快速高靈敏度檢測試劑盒。 WST-8屬于MTT的升級產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以 被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色 的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450mM波長處測 定OD值，間接反映活細胞數(shù)量。 CCK法應用非常廣泛，如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗 以及生物因子的活性檢測等。 f）報告基因：B -半乳糖苷酶、GUS等 i. 報告基因（reporter gene）是一種編碼可被檢測的蛋白質或酶的基因，也就是說，是 一個其表達產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達調(diào)節(jié)

12、序列相融 合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，從而利 用它的表達產(chǎn)物來標定目的基因的表達調(diào)控，篩選得到轉化體。 ii. B半乳糖苷酶：B半乳糖苷酶由大腸桿菌lacZ基因編碼，可催化半乳糖苷水解。最 大優(yōu)勢是易于用免疫組織化學法觀測其原位表達，是最常用的監(jiān)測轉染率的報道基 因之一。以鄰一硝基苯一B D半乳吡喃糖苷（ONPG）為底物可用標準的比色法 檢測酶活性，其檢測動力學范圍為6個數(shù)量級。 氯酚紅一B D半乳吡喃糖苷（CPRG是另一個可用比色法檢測酶活性的底物， 其靈敏度比ONPG高近10倍。以MUG和熒光素二半乳糖苷（FDG）為底物則可用 熒光法檢測其活性。此法可檢測單個細胞的酶活性，并可用于流式細胞學（FACS 分析。如以二氧雜環(huán)丁烷為底物，可用化學發(fā)光法檢測酶活性，其檢測動力學范圍 最大，靈敏度最高，與用生物發(fā)光法檢測熒光素酶活性的靈敏度相似。 iii. gus基因存在于E.coli等一些細菌基因組內(nèi)，編碼B-葡萄糖苷酸酶。B -葡萄糖苷酸 酶是一個水解酶，以B -葡萄糖苷酸酯類物質為底物，其反應產(chǎn)物可用多種方法檢測 出來。由于絕大多數(shù)植物沒有檢測到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此這個基因被廣 泛應用于基因調(diào)控的研究中。 g