pfge標(biāo)準(zhǔn)方法

1、PFGE 標(biāo) 準(zhǔn) 方 法第一天一、 膠塊的制備1、在 Falcon 2054管上標(biāo)記樣品名稱(chēng)和空白對(duì)照，分別加入約 2ml 細(xì)胞懸 濁液（ CSB）；2、在 eppendorf 管上標(biāo)記好對(duì)應(yīng)樣品的名稱(chēng)；3、在模具上標(biāo)記好對(duì)應(yīng)樣品的名稱(chēng)；4、用 CSB濕潤(rùn)接種環(huán)，從培養(yǎng)皿上刮取適量細(xì)菌，均勻懸濁于CSB中，用 bioMerieux Vitek colorimeter 測(cè)其 OD值，并調(diào)整至 。如果 OD值大于，加 入 CSB稀釋?zhuān)蝗绻?OD值小于，增加菌量提高其濃度。 OD是 optical density （光密 度）的縮寫(xiě)，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度，是檢測(cè)方法里的專(zhuān)有名詞，檢測(cè)單位用OD

2、值表示， 1OD 1og（1 trans ），其中 trans 為檢測(cè)物的透光值。光通過(guò)被檢測(cè)物，前后的能 量差異即是被檢測(cè)物吸收掉的能量， 特定波長(zhǎng)下， 同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成 定量關(guān)系。5、取 400l 細(xì)菌懸濁液于相應(yīng)的 eppendorf 管中，置于 37水浴中孵 育 5 分鐘。將剩余的細(xì)菌懸濁液置于冰上直到膠塊制備好放在水浴搖床 中。6、從水浴箱中取出 eppendorf 管，每管加入 20l 蛋白酶 K（Merk 公司 ）（儲(chǔ) 存液濃度為 20mg/ml）混勻，使其終濃度為 ml。制備好 1%Seakem Gold（Bio-RAD, 伯樂(lè)公司 ） ：1%SD（S十二烷

3、基硫酸鈉） ，放于 56水浴箱 中。SeaKemG old 瓊脂糖是一種高凝膠強(qiáng)度，低 EEO，標(biāo)準(zhǔn)膠凝溫度的瓊脂糖。這種遺傳學(xué) 術(shù)級(jí)別（ Genetic Technology Grade， GTG）瓊脂糖最適于脈沖場(chǎng)凝膠電泳法（ pulsed field gel electrophoresis ，PFGE）快速分辨 Mb（megabase） 50kb-10Mb） DNA和常規(guī)電泳方法 分辨 1-50kb 的 DNA與 PCR產(chǎn)物。因其低 EEO（電內(nèi)滲）特性， SeaKem Gold 瓊脂糖中的 DNA 電泳遷移速度要顯著的高于常規(guī)瓊脂糖凝膠。 PFGE的跑膠時(shí)間依使用的緩沖液和瓊脂糖濃度

4、的不同可減少至原電泳時(shí)間的 50%。因其高凝膠強(qiáng)度， 即使是使用低濃度 （ %）的 SeaKemG old瓊脂糖凝膠， 操作處理依然很方便， 從而允許在常規(guī)電泳中分離更大的 DNA片斷并減少 PFGE中的 DNA分離的耗時(shí)1、在 eppendorf 管中加入 400l 的 1%S eakemG old： 1%SD，S 用槍頭輕 輕混勻。 （SK=1g瓊脂+90mlTE+10ml 10SDS）2、將混合物加入模具，避免氣泡產(chǎn)生，在室溫下凝固 10-15 分鐘。 注意事項(xiàng)：（1）用后的接種環(huán)要放在指定的廢棄物容器中。（2）細(xì)胞懸濁液、蛋白酶 K 要置于冰上。（3）在混合細(xì)胞懸濁液和 1% Seak

5、em Gold：1%SDS時(shí)要避免氣泡 的產(chǎn)生。（4）混合物加入模具時(shí)不能產(chǎn)生氣泡。（5）在加 1%S eakemG old：1%SDS的過(guò)程中 1%S eakemG old：1%SDS 要一直放在 56水浴箱中。細(xì)胞的裂解1、在 50ml 的 screw-cap tube 上做好標(biāo)記。2、配制細(xì)胞裂解液（ CLB）：每 5ml 細(xì)胞裂解液加入 25 l 蛋白酶 K（ 20mg/ml），使其終濃度為 ml，然后顛倒混勻。注意：蛋白酶 K 要置于冰上，配制好的細(xì)胞 CLB也要置于冰上。3、每個(gè)管子加入 5ml 蛋白酶 K/CLB混合液。4、如果想使膠塊平齊，可以用刀片削去模具表面多余的部分。（

6、1） 可重復(fù)利用的模具： 打開(kāi)模具， 用小鏟的寬頭部分將膠塊移 入相應(yīng)的 screw-cap 管中。（2） 一次性模具： 撕掉模具下面的膠帶， 用小鏟將膠塊捅進(jìn)相應(yīng)的 screw-cap 管中，將模具、膠帶、小鏟放入廢棄物容器中。5、保證膠塊在液面下而不在管壁上。6、將管子放在 54水浴搖床中孵育 2 小時(shí)，轉(zhuǎn)速約 170 轉(zhuǎn)/ 分鐘。7、 將純水和 TE（緩沖液 tris-HCL 和 EDTA） 放在 50水浴搖床中預(yù)熱。三、洗膠塊 （為何要反復(fù)洗膠塊）1、從水浴搖床中拿出 screw-cap 管，蓋上綠色的 screened-cap （ 伯樂(lè)公 司） 。輕輕倒掉 CLB。在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上輕磕管底

7、使膠塊落在管底。注意：把管倒置在吸水紙上，使管內(nèi)液體被盡量排除干凈 。隨后的操作中也如 此。2、每管中加入 15ml 預(yù)熱的純水。3、確保膠塊在液面下而不在管壁或蓋子上，放回 50水浴搖床中，搖 10 分鐘。4、倒掉水，用純水再洗一次。 、5、倒掉水，加入 15ml預(yù)熱的 TE，在 50的水浴搖床中搖 15分鐘。6、倒掉 TE，用 TE重復(fù)洗三次，每次 1015 分鐘。7、倒掉 TE，加入 10ml TE，放在 4冰箱保存?zhèn)溆谩?注意：要確保膠塊在液面下而不在管壁或蓋子上。四、膠塊內(nèi) DNA的酶切1、在 eppendorf 管上標(biāo)記好相應(yīng)的樣品及 H9812的名稱(chēng)。2、 按照下面的比例配制緩沖

8、液 H的稀釋液，混勻。試劑l/ 膠塊l /10 膠塊純水180l1800lBuffer D20l200l總體積200l2000l注意：緩沖液要置于冰上。3、在每個(gè) eppendorf 管中加入 200l 緩沖液 H 的稀釋液。4、小心從 TE中取出膠塊放在干凈的培養(yǎng)皿上。5、用刀片切下 2mm寬的膠塊放入 eppendorf 管中。確保膠塊在液面下面。將剩余的膠塊放回原來(lái)的 TE中6、用同樣的方法處理標(biāo)準(zhǔn)株 H9812的膠塊。7、將管子放在 37水浴中孵育 10-15 分鐘。8、在用稀釋緩沖液孵育的過(guò)程中， 按照以下的比例配制酶切緩沖液， 混勻試劑l/ 膠塊l /10 膠塊純水175l1750

9、lBuffer D20l200l酶（10U/l ）5l50l總體積200l2000l（1） 將酶置于冰上，用后立即放在 20保存。（2） 用槍頭吸出緩沖液 H，避免損傷膠塊。9、每管加入 200l 混合液，輕輕在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上磕管子的底部，確保膠塊在 液面的下面。10、在 37水浴中孵育 至少 2 小時(shí)。五、加樣（一） 將膠塊直接粘在梳子齒上1、調(diào)整梳子的高度，使 梳子齒與膠槽的底面相接觸。 用水平儀調(diào)整膠槽使 其水平。2、從 37水浴中取出膠塊，平衡到室溫。3、用槍頭吸出酶切混合液，避免損傷或吸出膠塊。4、 每管加入 200l TBE（Tris 硼酸緩沖液） 。5、 把梳子平放在膠槽上，把膠塊加在

10、梳子齒上。如果用的是 10 個(gè)齒的梳 子，把標(biāo)準(zhǔn)菌株 H9812加在第 1、5、10 個(gè)齒上。6、 用吸水紙的邊緣吸去膠塊附近多余的液體，在室溫下風(fēng)干約3 分鐘。7、把梳子放入膠槽，確保所有的膠塊在一條線(xiàn)上 ，并且 膠塊與膠槽的底面 相接觸 。從膠槽的下部中央緩慢到入 100ml 熔化的在 5560平衡的1SKG。避免氣泡的生成； 如果有，用槍頭消除 。在室溫下凝固 30 分 鐘左右。8、記錄加樣順序。（二）將膠塊直接加在加樣孔內(nèi)1、調(diào)整梳子的高度，使 梳子齒與膠槽的底面有一定間距 。用水平儀調(diào)整膠 槽使其水平。2、把梳子放入膠槽， 從膠槽的 中央緩慢倒入 100ml熔化的在 55 60平 衡

11、的 1SKG。避免氣泡的生成；如果有，用槍頭消除。在室溫下凝固 30 分鐘左右。3、小心拔出梳子。4、從 37水浴中取出膠塊，平衡到室溫。5、用槍頭吸出酶切混合液，避免損傷或吸出膠塊。6、每塊膠加入 200l TBE平衡。7、用小鏟將膠塊加入加樣孔。8、用溶化的膠封閉加樣孔。a） 可以在加樣孔中加入 TBE，利用毛細(xì)作用將膠塊沉在加樣孔底，盡 量避免氣泡形成。b） 記錄加樣順序。六、電泳1、確保電泳槽是水平的。如果不水平，調(diào)整槽底部的旋鈕。注意：不要觸碰電極。 （CHEF-DR111）2、加入 2.2L TBE,關(guān)上蓋子。3、打開(kāi)主機(jī)和泵的開(kāi)關(guān)， 確保泵設(shè)在 70（這時(shí)緩沖液的流速約 1L/

12、分鐘） 和緩沖液在管道中正常循環(huán)。4、打開(kāi)冷凝機(jī)，確保預(yù)設(shè)溫度在 14（緩沖液達(dá)到該溫度通常需要 20 分 鐘左右）。5、打開(kāi)膠槽的旋鈕，取出凝固好的膠，用吸水紙清除膠四周和底面多余的 膠，小心的把膠放入電泳槽，關(guān)上蓋子。6、設(shè)置電泳參數(shù)。7、記錄電泳 初始電流（通常 120145ma）。8、結(jié)束電泳：關(guān)機(jī)順序?yàn)椋豪淠龣C(jī)泵主機(jī)。第二天七、圖像的獲取1、取出膠，放在盛放 400ml EB溶液的托盤(pán)內(nèi)（ EB儲(chǔ)存液濃度為 10mg/ml，1：10,000 稀釋?zhuān)丛?400ml 水中加入 40l 儲(chǔ)存液）。EB是致畸劑 。儲(chǔ)存在棕色瓶中的 EB稀釋液可以用 3-5 次。廢棄的 EB 溶液應(yīng)妥善處理

13、。2、將托盤(pán)放在搖床上搖 25-30 分鐘。3、放掉電泳槽中的 TBE，用 1-2L 純水清洗電泳槽，并倒掉液體。4、戴上手套 將用后的 EB溶液小心倒入做有標(biāo)記的棕色瓶中，在托盤(pán)中加 入 400-500ml 純水，放在搖床上脫色 60-90 分鐘，如果可能每 20-30 分 鐘換一次純水。5、用 Gel Doc 2000 拍攝圖像。 注意：如果背景干擾分析，可進(jìn)一步脫色 30-60 分鐘。6、轉(zhuǎn)換成 *.1sc 文件用于處理分析。八、數(shù)據(jù)的分析圖像的讀取 電泳圖像通常用 BIO-RAD的 GEL DOC 2000或其它成像系統(tǒng)來(lái)獲取。其它可以替 代的成像設(shè)備，只要具有 CCD相機(jī)，可以提供

14、IBM 兼容的未壓縮的 TIFF 圖像， 且分辨力 768 x 640 像素，能夠用 BioNumerics software （Applied Maths, Inc.） 軟件與 PulseNet 數(shù)據(jù)庫(kù)中其它圖像進(jìn)行對(duì)比分析，也可以運(yùn)用。運(yùn)用 GEL DOC 2000的簡(jiǎn)單說(shuō)明：QUANTITY ON軟E 件1、點(diǎn)擊 QUANTITY ON按E 鈕打開(kāi)該軟件。2、點(diǎn)擊菜單 FILE GEL DO。C 注意：需要 1020 秒打開(kāi)窗口。3、打開(kāi)抽屜，把膠放在臺(tái)板上。膠已經(jīng)經(jīng)過(guò) EB或 GEL-STAR染色并經(jīng)過(guò)充分 脫色。用黑色膠框把膠放在合適的位置。關(guān)上抽屜門(mén)。圖像的獲取1、按下 EPI-L

15、IGHT 按鈕打開(kāi)白光。2、把膠放在調(diào)準(zhǔn)網(wǎng)格線(xiàn)內(nèi)， 使膠的加樣孔和調(diào)準(zhǔn)網(wǎng)格線(xiàn)的最上面一條藍(lán)線(xiàn)對(duì) 齊。3、保證調(diào)準(zhǔn)網(wǎng)格線(xiàn)和過(guò)飽和按鈕 被選中。4、改變鏡頭的 MIDDLE RING以調(diào)整圖像的大（順時(shí)針）?。鏁r(shí)針） ，使圖 像占據(jù)整個(gè)窗口。如果需要，挪動(dòng)膠在臺(tái)板上的位置。膠的加樣孔、下邊 界和左右邊界在屏幕上都應(yīng)該可以看到。5、如果需要，按 BOTTOM RIN以G調(diào)整相機(jī)的焦距。 注意：焦距的調(diào)整只可以偶爾用之， 不可用于每一塊膠。 可以用尺子幫助調(diào)整焦 距。6、按下 EPI-LIGHT 關(guān)掉白光，按下 UV按鈕打開(kāi)透射紫外光。7、點(diǎn)擊 AUTO EXPOS以E 確定大概的曝光時(shí)間。當(dāng)圖像出

16、現(xiàn)在窗口時(shí)， AUTO EXPOSE自動(dòng)關(guān)閉而 MANUAL EXPOS被E激活。8、點(diǎn)擊 MANUAEL XPOSE的按鈕，調(diào)整曝光時(shí)間。而調(diào)整飽和度時(shí)，點(diǎn)擊 箭頭或 TURNT HET OPR ING以降低光量（如果圖像過(guò)飽和， 圖像顯現(xiàn)紅色）。 注意：如果出現(xiàn)對(duì)話(huà)框“曝光可以在 360 秒之間波動(dòng)”，則需通過(guò)改變相機(jī)的 像素以調(diào)整飽和度。調(diào)整飽和度使樣品條帶沒(méi)有紅色很重要，因?yàn)檫@會(huì)影響 BIONUMERIC軟S件對(duì)膠圖像的分析。而膠加樣孔的過(guò)飽和屬于正常現(xiàn)象。9、當(dāng)圖像調(diào)整的比較滿(mǎn)意時(shí)， 按下 FREEZE按鈕停止曝光過(guò)程。 按下 UV按鈕 關(guān)掉紫外光（如果開(kāi)門(mén)時(shí) UV燈打開(kāi)，它會(huì)自動(dòng)關(guān)

17、閉） 。圖像的輸出1、保存圖像（ *.1sc ）：FILE SAVE。確保選擇正確的路徑。文件默認(rèn)的名字 包括日期、時(shí)間和用戶(hù)?？梢愿淖兾募?。2、打印文件： FILE PRINTVIDEOP RINT，也可以直接點(diǎn)擊屏幕上的 PRINT 按鈕。3、轉(zhuǎn)為*.TIFF 格式： FILEEXPOR TO TIFF IMAGEEXPOR，T選擇正確的 路徑。4、關(guān)閉 QUANTITY ON程E 序： FILEEXIT。5、取出膠放在染色盒內(nèi)。用軟麻布擦掉臺(tái)板表面多余的液體，用水或70的異丙醇洗干凈。試劑儲(chǔ)存液的配制1、1 M Tris HCl, pH *121.1 g Tris base 溶于 65

18、0-700 ml 純水中，加入 80 ml 6 N HCl*， 在室溫下調(diào) pH至，加水終體積至 1000 ml ，高壓滅菌?；蛘?157.6 g Tris-HCl 溶于 800 ml 純水中，在室溫下調(diào) pH至， 加水終體積至 1000 ml ，高壓滅菌。2、10 N NaOH*400 g NaOH小心溶于 800 ml 純水中，冷卻到室溫，加滅菌的純水 使終體積至 1000 ml 。3、0.5 M EDTA, pH *186.1 g Na 2EDTA 2H2O溶于 800 ml 純水中，加入 50ml 10N NaOH調(diào) pH至，加水終體積至 1000 ml ，分成數(shù)份，高壓滅菌。4、20

19、%S odium Dodecyl Sulfate (SDS)* 十二烷基硫酸鈉用于 E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei , PFGE將 20 克 SDS小心加入裝有 80 ml 滅菌純水的容器中，在 35 - 45C 輕輕混勻溶解，定容至 100ml。5、20 mg/ml 蛋白酶 K儲(chǔ)存液 *100 mg Proteinase K 粉末溶于 5 ml 滅菌純水中，混勻，分裝在 ml 離心管中，每管 500- 600 l ， - 20C保存?zhèn)溆谩?、10X Tris-Borate EDTA Buffer (TBE), pH*0.9 M

20、Tris base (108 g)0.9 M Boric Acid (55 g)0.02 M EDTA, pH (40 ml 0.5 M) 溶于 1000 ml 滅菌的純水中，高壓滅菌 注意：如果緩沖液有沉淀生成必須丟棄。7、Ethidium Bromide (EB) *10 mg/ml EB 的儲(chǔ)存液用純水 1:10,000 稀釋(即 100 ml 水中加入 10 l 儲(chǔ)存液 ) ，(500ml水中加 50ul )。稀釋液在丟棄前可以染 5-6 塊膠。實(shí)驗(yàn)試劑注意 ：用滅菌的玻璃制品、塑料制品和純水來(lái)制備以下試劑。1、Tris:EDTA Buffer (TE), pH *(10 mM Tri

21、s-HCL:1 mM EDTA, pH )10 ml 1 M Tris-HCL, pH2 ml 0.5 M EDTA, pH 用滅菌的純水稀釋到 1000 ml在 E. coli O157:H7, Salmonella and Shigella sonnei , and Campylobacter jejuni PFGE 用 TE Buffer 于: . 溶解 1% SeaKem Gold:1% SDS agarose . 細(xì)菌裂解后洗膠塊在 L. monocytogenes PFGE 用 TE Buffer 于 :. 懸浮菌細(xì)胞 . 細(xì)菌裂解后洗膠塊2、Cell Suspension Buf

22、fer (CSB)100 mM Tris-HCl:100 mM EDTA, pH用于 E. coli O157:H7, Salmonella , and Shigella sonnei PFGE10 ml 1 M Tris-HCl, pH20 ml 0.5 M EDTA, pH用滅菌的純水稀釋到 100 ml3 、 CellLysis Buffer ( CLB) 50 mM Tris-HCl:50 mM EDTA, pH + 1%N-Lauroyl-Sarcosine, Sodium salt (Sarcosyl)， ml Proteinase K ( 用前再加入)用于裂解E. coli O1

23、57:H7, Salmonella , Shigella sonnei , 和 Campylobacterjejuni25 ml 1 M Tris-HCl, pH50 ml 0.5 M EDTA, pH350 ml 10% Sarcosyl 3用滅菌的純水稀釋到 500 ml，每 5 ml CLB加入 25l蛋白 酶 K 儲(chǔ)存液 (20 mg/ml) ，使其終濃度為 mg/ml.5、 TBE Buffer200 ml 5X TBE 用純水稀釋到 2000 ml 或100 ml 10X TBE 用純水稀釋到 2000 ml注意：用來(lái)稀釋 5X TBE、10X TBE的純水可以不滅菌 6、SeaK

24、em Gold Agarose做膠塊； 電泳膠 報(bào)價(jià) seakem gold 瓊脂糖 25g 貨號(hào) 50111 ， 1567 元人民幣?？纱?9 折。125g 貨號(hào) 50150 ， BMA， 6422 元。 北京基因公司 ；上海 ；廣州 ； 天津 022 ；西安；成都 ；沈陽(yáng) 濟(jì)南 ；武漢 ；昆明 ；杭州 4 長(zhǎng)沙 ；重慶 ；南京無(wú)菌的超純水8、蛋白酶 K粉末或蛋白酶 K溶液（ 20mg/ml） 6、限制性?xún)?nèi)切酶E. coli O157:H7, Salmonella , Shigella sonnei XbaI, ，AvrII （ 同切限制

25、內(nèi)切酶 BlnI） ，SpeI（NotI 可用于 S. sonnei ；但不用于 E. coli O157:H7） L. monocytogenes ， AscI, ApaI Campylobacter jejuni , C. coli ， SmaI, KpnI 器材1、Dade Microscan Turbidity MeterSpectrophotometerbioMrieux Vitek Colorimeter 調(diào)整細(xì)胞懸濁液的濃度2、微波爐溶膠3、水浴搖床裂解膠塊中的細(xì)胞 （54 C）用水和 TE（50 C）洗膠塊4、56C水浴箱平衡和保溫熔化的膠5、25C, 30 C, 37 C水浴

26、箱酶切6、50C水浴箱加熱用于洗膠塊的水和 TE，酶切7、離心機(jī)。8、最少需要兩個(gè)水浴箱一個(gè)平衡到 56C，另一個(gè)到 37C。如果需要，溫度 可以上下調(diào)動(dòng)。 Listeria PFGE中膠塊的 ApaI 酶切需 30C水浴。耗材1、無(wú)菌的 Falcon 2054 （12-mm x 75-mm）或 Falcon 2057 （ 17-mm x 100-mm） 用于細(xì)胞懸濁液的制備基因公司代理 ，2、無(wú)菌的聚酯纖維或棉簽用于從瓊脂平板上刮取細(xì)菌3、無(wú)菌的槍頭或巴斯得吸管4、無(wú)菌的 ml 離心管用于混合細(xì)胞懸濁液和膠、酶切5、無(wú)菌的 50 ml screw-cap tubes 或 50 ml Oak

27、Ridge tubes 用于裝膠塊，6、Green Screened Caps （ Bio-Rad 1703711 ）洗膠塊時(shí)用 伯樂(lè)公司 貨號(hào) 170-3711 。7、模具 10孔（可重復(fù)利用的， 2cm x 1cm x 1.5mm ） 50孔（一次性的， 1.5mm x 10mm x 5mm）8、單刃剃須刀、手術(shù)刀、平皿或類(lèi)似物用于切膠塊9、無(wú)菌的一次性皮氏平皿或大的玻璃載物片用于切膠塊10、一端寬、一端窄的平鏟 藥鏟，生工等公司的實(shí)驗(yàn)室耗材部分有。11、標(biāo)準(zhǔn)膠槽（ 14 x 13cm 的框和平板）12、10孔的梳子（ 14 cm 長(zhǎng)，1.5 mm寬）13、15孔的梳子（ 21 cm 長(zhǎng)，1.5 mm寬） Bio-Rad 170-362714、膠水平臺(tái)15、盛放 EB染液的塑料容器16、70異丙醇、 5%10%的漂白劑或其它合適的消毒劑17、各種體積的無(wú)菌燒瓶或瓶子( 50 ml - 2000 ml )