(2015年版藥典)非無(wú)菌藥品微生物限度檢查操作規(guī)程

1、(2015 年版藥典 ) 非無(wú)菌藥品微 生物限度檢查操作規(guī)程公司 gmp 文件非無(wú)菌藥品微生物限度檢查操作規(guī)程編碼：sop-qc-ty-02-0332015 年 12 月 01起草人日期年月日?qǐng)?zhí)行日期日審核人日期年月日頒發(fā)部門質(zhì)保部批準(zhǔn)人日期年月日變更記載：修訂號(hào)執(zhí)行日期質(zhì)保部（）份質(zhì)檢部（）份2012 年 06 月 01生產(chǎn)部（）份物資部（）份00分 發(fā)日設(shè)備部（）份采供部（）份部 門2014 年 05 月 01銷售部（）份行政部（）份01日財(cái)務(wù)部（）份2015 年 12 月 0102日1. 目的：建立非無(wú)菌藥品微生物限度檢查檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范檢驗(yàn)操作， 確保檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確。2. 適用范圍

2、：適用于本公司所有采用非無(wú)菌藥品微生物限度檢查法測(cè)定的供試 品。3. 責(zé)任者：qc 檢驗(yàn)員、qc 經(jīng)理。4. 正文：4.1 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法4.1.1 簡(jiǎn)述第 2 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033微生物計(jì)數(shù)法系用于能在有氧條件下生長(zhǎng)的嗜溫細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料等是否符合規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)按下述規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品的取樣量和結(jié)果的判斷等。除另有規(guī)定外，本法不 適用于活菌制劑的檢查。本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動(dòng)檢測(cè)方法，但必須證明替代方法 等效于藥典規(guī)定的檢查方法。微生物計(jì)數(shù)試驗(yàn)應(yīng)

3、在受控潔凈環(huán)境下的局部潔凈度不低于 b 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗(yàn)全過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)。如供試品有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí), 若使用了中和劑或 滅活劑，應(yīng)確認(rèn)其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中 和劑或滅活劑的相容性。4.1.2 計(jì)數(shù)方法計(jì) 數(shù) 方 法 包 括 平 皿 法 、 薄 膜 過(guò) 濾 法 和 最 可 能 數(shù) 法（most-probable-numbermethod，簡(jiǎn)稱mpn 法）。mpn 法用于微

4、生物計(jì)數(shù)時(shí)精確度較差，但對(duì)于某些微生物污染量很小的供試品，mpn 法可能是更適合的方 法。供試品檢查時(shí), 應(yīng)根據(jù)供試品理化特性和微生物限度標(biāo)準(zhǔn)等因素選擇計(jì)數(shù)方法，所選的方法必須具備檢測(cè)充足樣品量的能力，以保證所獲得的試驗(yàn)結(jié)果能夠判斷供試 品是否符合規(guī)定。所選方法的適用性須經(jīng)確認(rèn)。4.1.3 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和供試品計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)第 3 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033供試品微生物計(jì)數(shù)中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的微生物計(jì)數(shù)方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該 產(chǎn)品的微生物計(jì)數(shù)。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)

5、，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新進(jìn)行適用性試 驗(yàn)。表1 試驗(yàn)菌液的制備和使用計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性 計(jì)數(shù)方法適用性試試驗(yàn)菌株試驗(yàn)菌液的制備檢查驗(yàn) 霉菌和 霉菌和需氧菌總 酵母菌 需氧菌總 酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)金黃色葡 胰 酪 大 豆 胰酪大豆萄球菌 胨 瓊 脂 培 胨瓊脂培(staphylo 養(yǎng) 基 或 胰 養(yǎng)基和胰coccusau 酪 大 豆 胨 酪大豆胨-reus) 液 體 培 養(yǎng) 液體培養(yǎng)cmcc( 基 ， 培 養(yǎng) 基，培養(yǎng)溫總數(shù)計(jì)數(shù)數(shù)計(jì)數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基/胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（mpn總數(shù)計(jì)數(shù)第 4 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033b)26溫度 30 度法），培養(yǎng)003)

6、35 ，培 3035，養(yǎng) 時(shí) 間 培養(yǎng)時(shí)間18 24 不超過(guò)溫度3035，培養(yǎng)時(shí)間不超小時(shí) 3天，接過(guò)3天，種量不大于100cfu銅綠假單 胰 酪 大 豆 胰 酪 大 豆接種量不大于100cfu胰酪大豆胞菌胨 瓊 脂 培 胨 瓊 脂 培胨瓊脂培（pseudo 養(yǎng) 基 或 胰 養(yǎng) 基 和 胰monasae 酪 大 豆 胨 酪 大 豆 胨ru-ginosa 液 體 培 養(yǎng) 液 體 培 養(yǎng)養(yǎng)基/胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基）基 ， 培 養(yǎng) 基，培養(yǎng)溫（mpn第 5 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件 cmcc 溫度 30 度 30 （b）10 35 ，培 35，培養(yǎng)編碼：sop-qc-ty-02-033 法

7、），培養(yǎng)溫度30104養(yǎng) 時(shí) 間 時(shí) 間 不 超18 24 過(guò) 3 天，接35，培養(yǎng)時(shí)間不超小時(shí)種 量 不 大過(guò)3天，于100cfu枯草芽孢 胰酪大豆 胰酪大豆接種量不大于100cfu胰酪大豆桿菌胨瓊脂培 胨瓊脂培胨瓊脂培(bacilluss 養(yǎng)基或胰 養(yǎng)基和胰養(yǎng)基/胰ubtilis) 酪大豆胨 酪大豆胨cmcc( 液體培養(yǎng) 液體培養(yǎng)酪大豆胨液體培養(yǎng)b) 63基，培養(yǎng) 基，培養(yǎng)溫基（mpn第 6 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033501溫度30 度3035，培 35，培養(yǎng)法），培養(yǎng)溫度30養(yǎng)時(shí)間時(shí)間不超35，培養(yǎng)1824 過(guò)3天，接時(shí)間不超小時(shí)種量不大過(guò)3

8、天，于100cfu接種量不大于100cfu白色念珠 沙氏葡萄 胰酪大豆 沙氏葡 胰酪大豆 沙氏葡菌糖瓊脂培 胨瓊脂培 萄糖瓊 胨瓊脂培 萄糖瓊(candida 養(yǎng)基或沙 養(yǎng)基，培養(yǎng) 脂培養(yǎng)養(yǎng)基脂培養(yǎng)albicans) 氏葡萄糖 溫度30 基，培 （mpn基，培養(yǎng)cmcc( 液體培養(yǎng) 35，培養(yǎng) 養(yǎng)溫度法不適溫f) 98基，培養(yǎng) 時(shí)間不超 20 用），培養(yǎng) 度 20第 7 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033001溫度20 過(guò)5天，接 25， 溫度30 25，培 種量不大 培養(yǎng)時(shí) 35，培養(yǎng) 25，養(yǎng)時(shí)間 于100cfu 間不超 時(shí)間不超 培養(yǎng)時(shí)23天過(guò)5天，

9、過(guò)5天， 間不超接種量 接種量不 過(guò)5天，不大于100cfu大于100cfu接種量不大于100cfu黑曲霉沙氏葡萄 胰酪大豆 沙氏葡 胰酪大豆 沙氏葡(aspergill 糖瓊脂培 胨瓊脂培 萄糖瓊 胨瓊脂培 萄糖瓊us niger) 養(yǎng)基或馬 養(yǎng)基，培養(yǎng) 脂培養(yǎng) 養(yǎng)（mpn 脂培養(yǎng)cmcc( 鈴薯葡萄 溫度30 基，培法不適 基，培養(yǎng)f) 98糖瓊脂培 35，培養(yǎng) 養(yǎng)溫 用），培養(yǎng)溫003養(yǎng)基，培 時(shí)間不超 度 20 溫度30 度 20第 8 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件養(yǎng)溫度 過(guò)5 天，編碼：sop-qc-ty-02-033 35，培養(yǎng) 20接種量不 25， 時(shí)間不超 25，25，培

10、大于培養(yǎng)時(shí) 過(guò)5天，接 培養(yǎng)時(shí)養(yǎng)時(shí)間57天，100cfu 間不超 種量不大 間不超過(guò)5天，于100cfu 過(guò)5天，或直到獲得豐富的孢子接種量不大于100cfu接種量不大于100cfu注：當(dāng)需用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查，檢查方法 同沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。4.1.4 菌種及菌液制備菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò) 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。 計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用菌株見表1。第 9 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033

11、菌液制備按表 1 規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗(yàn)菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物，用ph7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物加入35ml含 0.05 聚山梨酯 80 的 ph7.0 無(wú)菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液或 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含 0.05 聚山梨酯 80 的 ph7.0 無(wú)菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液或 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜 濃度的黑曲霉孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在 2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在 28，可在24小時(shí)

12、內(nèi)使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。 4.1.5 陰性對(duì)照為確認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。 如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。4.1.6 培養(yǎng)基適用性檢查微生物計(jì)數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng) 基適用性檢查。按表 1 規(guī)定，接種不大于 100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試驗(yàn)菌株平行制備 2 管或 2 個(gè)平皿。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢 培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對(duì)照培養(yǎng)基

13、上的菌落平均數(shù)的比值應(yīng)在 0.5-2范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基上的菌落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對(duì)照培 養(yǎng)基管比較，試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。第 10 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-0334.1.7 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)供試液制備根據(jù)供試品的理化特性與生物學(xué)特性 , 采取適宜的方法制備供試液。供試液制備若需加溫時(shí) ,應(yīng)均勻加熱 ,且溫度不應(yīng)超過(guò) 45 。供試液從制備至加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基 , 不得超過(guò)1 小時(shí)。常用的供試液制備方法如下。如果下列供試液制備方法經(jīng)確認(rèn)均不適用，應(yīng)建立 其他適宜的方法。水溶性供試品取供試品，用ph7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或ph

14、7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋制成1:10 供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液 ph 值至68 。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10 倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液。水不溶性非油脂類供試品取供試品，用 ph7.0 無(wú)菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液，或 ph7.2 磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基制備成 1:10 供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋劑中加入表面活性劑如0.1% 的聚山梨酯80，使供試品分散均勻。若需要，調(diào)節(jié)供試液 ph 值至 6 8 。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一 步10 倍系列稀釋。油脂類供試品取供試品，加入經(jīng)過(guò)濾除菌的十四

15、烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無(wú)菌聚山梨酯 80 或其他無(wú)抑菌性的無(wú)菌表面活性劑充分混勻。表面活性劑的溫度一般不超過(guò)40（特殊情況下，最多不超過(guò)45），小心混合，若需要可在水浴中進(jìn)行，然后加入預(yù)熱的稀釋劑使成110供試液，保溫，混合，并在最短時(shí)間內(nèi)形成乳狀液。必要時(shí)，用含適宜濃度的無(wú)菌聚山梨酯80 或其他 無(wú)抑制性無(wú)菌表面活性劑的稀釋劑進(jìn)一步10 倍系列稀釋。第 11 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件需用特殊方法制備供試液的供試品編碼：sop-qc-ty-02-033膜劑供試品取供試品 ,剪碎,加ph7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，或 ph7.2磷酸鹽緩沖液，或胰酪大豆胨液

16、體培養(yǎng)基，浸泡，振搖，制備成 1 10 的供試液。若需要，調(diào)節(jié)供試液 ph 值至6 8。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10倍系列 稀釋。腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品取供試品，加入 ph6.8 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于腸溶制劑）或ph7.6 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（用于結(jié)腸溶制劑），置45水浴中,振搖,使溶解,制備成110 的供試液。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步10倍系列稀釋。氣霧劑、噴霧劑供試品取供試品 ,置冰凍室冷凍約 1 小時(shí)，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無(wú)菌鋼錐在該部位鉆一小孔，放至室溫，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無(wú)菌注射器從每一容器中吸出全部藥液于無(wú)菌容器中混合，然后

17、取樣檢查。貼膏劑供試品取供試品 , 去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無(wú)菌玻璃或塑料器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無(wú)菌多孔材料（如無(wú)菌紗布），避免貼膏劑粘貼在一起。將處理后的貼膏劑放入盛有適宜體積并含有表面活性劑（如聚山梨脂80 或卵磷脂）稀釋液的容器中，振蕩至少30 分鐘。必要時(shí)，用同一稀釋液將供試液進(jìn)一步 10 倍系列稀釋。接種和稀釋按下列要求進(jìn)行供試液的接種和稀釋 , 制備微生物回收試驗(yàn)用供試液。所加菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的 1%。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng) 選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。（1）試驗(yàn)組取上述制備好的供試液，加入試驗(yàn)菌液，混勻，使每 1m

18、l供試液第 12 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件或每張濾膜所濾過(guò)的供試液中含菌量不大于100cfu 。編碼：sop-qc-ty-02-033（2）供試品對(duì)照組取制備好的供試液, 以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。（3）菌液對(duì)照組取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代供試液,按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因?qū)е聼o(wú)法選擇最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)采用適宜的方法對(duì)供試液進(jìn)行進(jìn)一步的處理。如果供試品對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用無(wú)法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過(guò)中和、稀釋或薄膜過(guò)濾處 理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適應(yīng)性試驗(yàn)?？咕钚缘娜コ驕缁罟┰?/p>

19、液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)。若試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值小于菌液對(duì)照組菌數(shù) 值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。1 增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。2 加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表 2）可用于消除抗菌劑的抑菌活性， 最好在稀釋劑或培養(yǎng)基滅菌前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗(yàn)中應(yīng)設(shè)中和劑或滅活劑對(duì)照組，即取相應(yīng)量稀釋液替代供試品同試驗(yàn)組操作，以確認(rèn)其有效性和對(duì)微生物無(wú)毒性。中和劑或 滅活劑對(duì)照組的菌落數(shù)與菌液對(duì)照組的菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.52范圍內(nèi)。表2 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物戊二醛酚類、乙醇、吸附物 醛類可選用的中和劑或滅活

20、方法 亞硫酸氫納稀釋法甘氨酸季銨化合物、對(duì)羥基苯甲酸、雙胍類化合物 卵磷脂第 13 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件季銨化合物、碘、對(duì)羥基苯甲酸 水銀水銀、汞化物、醛類編碼：sop-qc-ty-02-033聚山梨酯巰基醋酸鹽硫代硫酸鹽乙二胺四乙酸（edta）、喹諾酮類抗生素 鎂或鈣離子磺胺類-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)氨基苯甲酸 -內(nèi)酰胺酶3 采用薄膜過(guò)濾法。4 上述幾種方法的聯(lián)合使用。若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對(duì)特定試驗(yàn)菌回收的失敗，表明供試品對(duì)該試驗(yàn)菌具有抗菌活性，同時(shí)也表明供試品不可能被該類微生物污染。但是，供試 品也可能僅對(duì)特定試驗(yàn)菌株具有抑制作用，而對(duì)其他菌株沒有抑制作用。因此，根

21、據(jù)供試品須符合的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)和菌數(shù)報(bào)告規(guī)則，在不影響檢驗(yàn)結(jié)果判斷的前提下，應(yīng)采用能使微生物生長(zhǎng)的更高稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。若方法適用性試驗(yàn)符合要求，應(yīng)以該稀釋級(jí)供試液作為最低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行 供試品檢查。供試品中微生物的回收表1 所列的計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)用的各試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。 微生物的回收可采用平皿法、薄膜過(guò)濾法或mpn 法。平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。表 1 中每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制備2 個(gè)平皿，以算術(shù)均值作為計(jì)數(shù)結(jié)果。傾注法取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供試液1ml，置直徑90mm 的無(wú)菌平皿中, 注入1

22、520ml 溫度不超過(guò)45熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基的用量應(yīng)相應(yīng)增加。按表 1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)第 14 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件 數(shù)。編碼：sop-qc-ty-02-033同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。涂布法取1520ml 溫度不超過(guò)45的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，注入直徑90mm 的無(wú)菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應(yīng)相應(yīng)增加。每一平皿表面接種上述照“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備

23、的供試液不少于0.1ml。按表1 規(guī)定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。同法測(cè)定供試品對(duì)照組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。 計(jì)算各試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)。薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法所采用的濾膜孔徑應(yīng)不大于 0.45m,直徑一般為50mm,若采用其他直徑的濾膜,沖洗量應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。選擇濾膜材質(zhì)時(shí)應(yīng)保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應(yīng)采用適宜的方法滅菌。使用時(shí) ,應(yīng)保證濾膜在過(guò)濾前后的完整性。水溶性供試液過(guò)濾前先將少量的沖洗液過(guò)濾以潤(rùn)濕濾膜。油類供試品 , 其濾膜和濾器在使用前應(yīng)充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過(guò)濾效率 ,應(yīng)注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個(gè)濾膜表面。供試液經(jīng)薄膜過(guò)濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每

24、張濾膜每次沖洗量為100ml ?？倹_洗量不得超過(guò) 1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除”制備的供試液適量（一般取相當(dāng)于1g、1ml或10cm2的供試品,若供試品中所含的菌數(shù)較多時(shí)，供試液可酌情減量），加至適量的稀釋液中,混勻,過(guò)濾。用適量的沖洗液沖洗濾 膜。若測(cè)定需氧菌總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測(cè)定霉菌和酵母總數(shù)，轉(zhuǎn)移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1 規(guī)第 15 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033定條件培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基至少制

25、備一張濾膜。同法測(cè)定供試品對(duì)照 組及菌液對(duì)照組菌數(shù)。 mpn 法 mpn 法的精密度和準(zhǔn)確度不及薄膜過(guò)濾法和平皿計(jì)數(shù)法，僅在供試品需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下使用，本法不適用于霉菌計(jì)數(shù)。若使 用mpn 法，按下列步驟進(jìn)行。取照上述 “供試液的制備”、“接種和稀釋”和“抑菌活性的中和或消除 ”制備的供試液至少 3 個(gè)連續(xù)稀釋級(jí)，每一稀釋級(jí)取 3 份 1ml 分別接種至 3 管裝有 9 10ml 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，同法測(cè)定菌液對(duì)照組菌數(shù)。必要時(shí)可在培養(yǎng)基中加 入表面活性劑、中和劑或滅活劑。接種管置3035培養(yǎng)3 天，逐日觀察各管微生物生長(zhǎng)情況。如果由于供試品的原因使得結(jié)果難以判斷，可將

26、該管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，在相同條件下培養(yǎng)12 天，觀察是否有微生物生長(zhǎng)。根據(jù)微生物生 長(zhǎng)的管數(shù)從表3 查對(duì)被測(cè)供試品每1g 或每1ml 中總需氧菌的最可能數(shù)。表3 微生物最可能數(shù)檢索表生長(zhǎng)管數(shù)每管含樣品的g或ml數(shù)需氧菌總數(shù) 最可能數(shù)95%置信限mpn/g或ml下限上限0.10.010.0010000001101013336.100.10.11.29.49.51017第 16 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-03300111111112222222222232300011223000111222330000120101001

27、20120120106.29.43.67.2117.4111115169.214201520272128352936231.23.50.21.241.344551.54545959999517351717352035353838353538383894409494949494第 17 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-0333333333333333300111122223333120123012301233864437512016093150210290240460110011009169173030183030904090200104181181199360

28、38036038040099099019804000注：表內(nèi)所列檢驗(yàn)量如改用1g（或ml）、0.1g（或ml）和0.01g（或ml）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低 10 倍；如改用 0.01 g（或ml ）、0.001 g （或ml）和0.0001 g （或ml）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)增第 18 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件 加10 倍，其余類推。編碼：sop-qc-ty-02-033結(jié)果判斷計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中，采用薄膜過(guò)濾法或平皿法時(shí)，試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組菌落數(shù)的值與菌液對(duì)照組菌落數(shù)的比值應(yīng)在 0.5 2 范圍內(nèi)；采用 mpn 法，試驗(yàn)組菌數(shù)應(yīng)在菌液對(duì)照組菌數(shù)的 95%置信限內(nèi)。若各試驗(yàn)

29、菌的回收試驗(yàn)均符合要求，照所用的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌 總數(shù)計(jì)數(shù)。方法適用性確認(rèn)時(shí),若采用上述方法還存在一株或多株試驗(yàn)菌的回收達(dá)不到要求 , 那么選擇回收最接近要求的方法和試驗(yàn)條件進(jìn)行供試品的檢查。4.1.8 供試品檢查檢驗(yàn)量檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品量（g、ml 或cm2）。除另有規(guī)定外 , 一般供試品的檢驗(yàn)量為 10g 或 10ml ；膜劑為 100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗(yàn)量可以酌減。檢驗(yàn)時(shí) , 應(yīng)從 2 個(gè)以上最小包裝單位中抽取供 試品,大蜜丸還不得少于4 丸,膜劑還不得少于4 片。一般應(yīng)隨機(jī)抽取供試品，取規(guī)定容器數(shù)，混合，取規(guī)定量供

30、試品進(jìn)行檢驗(yàn)。 供試品的檢查按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的計(jì)數(shù)方法進(jìn)行供試品中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌 總數(shù)的測(cè)定。胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基用于測(cè)定需氧菌總數(shù)；沙氏葡萄 糖瓊脂培養(yǎng)基用于測(cè)定霉菌和酵母菌總數(shù)。陰性對(duì)照試驗(yàn)以稀釋劑代替供試液進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生 第 19 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件長(zhǎng)。如果陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。編碼：sop-qc-ty-02-033平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。除另有規(guī)定外，取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和菌數(shù)測(cè)定，每稀釋級(jí)每種培養(yǎng)基至少制備2個(gè)平皿。培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 除另有規(guī)定外，胰酪大豆

31、胨瓊脂培養(yǎng)基平板在 3035培養(yǎng)3天，沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板在 2025培養(yǎng) 5 天， 觀察菌落生長(zhǎng)情況 , 點(diǎn)計(jì)平板上生長(zhǎng)的所有菌落數(shù)，必要時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至 7 天進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并報(bào)告。菌落蔓延生長(zhǎng)成片的平皿不宜計(jì)數(shù)。點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)后，計(jì)算各稀釋級(jí)供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)。若同稀釋級(jí)兩個(gè)平皿的菌落數(shù)平均值不小于 15 ，則兩個(gè) 平皿的菌落數(shù)不能相差1 倍或以上。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 需氧菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于 300cfu 的稀釋級(jí)、霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu 的稀釋級(jí)，作為菌數(shù)報(bào)告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計(jì)算1g、1ml

32、或10cm2 的微生物數(shù)。供試品中所含如各稀釋級(jí)的平皿均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌 落數(shù)小于1 時(shí)，以1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。薄膜過(guò)濾法除另有規(guī)定外，按計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備。取相當(dāng)于1g、1ml 或10cm2供試品的供試液，若供試品所含的菌數(shù)較多時(shí)，可取適宜稀釋級(jí)的供試液，照方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法加至適量稀釋液中，立即過(guò)濾，沖洗，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上培 養(yǎng)。第 20 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿計(jì)數(shù)法，每

33、張濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不超過(guò) 100cfu。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則 以相當(dāng)于 1g、1ml 或10cm2供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以 1 報(bào)告菌數(shù)（每張濾膜過(guò)濾 1g、1ml 或 10cm2 或1 乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。供試品） , mpn 法取規(guī)定量供試品，按方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法進(jìn)行供試液制備和供試品接種，所有試驗(yàn)管在 3035 培養(yǎng) 3 5 天，如果需要確認(rèn)是否有微生物生長(zhǎng)，按方法適應(yīng)性試驗(yàn)確定的方法進(jìn)行。記錄每一稀釋級(jí)微生物生長(zhǎng)的管數(shù)，從表 3查對(duì)每 1g 或 1ml 供試品中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。4.1.9 結(jié)果判斷需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包

34、括真菌菌落數(shù)）；霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的總菌落數(shù)（包括細(xì)菌菌落數(shù)）。若因沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)菌使霉菌和酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、慶大霉素）的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或其他選擇性培養(yǎng)基（如玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)測(cè)定。使用選擇性培養(yǎng)基時(shí)，應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基適用性檢查。若采用mpn 法，測(cè)定結(jié)果為需氧菌總數(shù)。 各品種項(xiàng)下規(guī)定的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)解釋如下：101 cfu ： 可接受的最大菌數(shù)為20；102 cfu ： 可接受的最大菌數(shù)為200 ；103 cfu ： 可接受的最大菌數(shù)為2000 ：依此類推。若供試品的需氧菌總數(shù)、

35、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢查結(jié)果均符合該品種項(xiàng)下的規(guī)第 21 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項(xiàng)不符合該品種項(xiàng)下的規(guī)定，判供試品不符合 規(guī)定。稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基見非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法（通則1106 ）無(wú)菌檢查法系用于檢查藥典要求無(wú)菌的藥品、生物制品、醫(yī)療器具、原料、輔料、及其他品種是否無(wú)菌的一種方法。若供試品符合無(wú)菌檢查法的規(guī)定 ,僅表明了供試品 在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。4.1.10 稀釋液、沖洗液及培養(yǎng)基見非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制及檢查法。4.2 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制及檢查法4.

36、2.1 簡(jiǎn)述控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗(yàn)條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生 物。當(dāng)本法用于檢查非無(wú)菌制劑及其原、輔料是否符合相應(yīng)的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng) 按下列規(guī)定進(jìn)行檢驗(yàn)，包括樣品取樣量和結(jié)果判斷等。本檢查法可采用替代的微生物檢查法，包括自動(dòng)檢測(cè)方法，但必須證明替代方法 等效于藥典規(guī)定的檢查方法。供試液制備及實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求同 “ 非無(wú)菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法 ” （通則1105）。如果供試品具有抗菌活性，應(yīng)盡可能去除或中和。供試品檢查時(shí), 若使用了中和 劑或滅活劑，應(yīng)確認(rèn)有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。供試液制備時(shí)如果使用了表面活性劑，應(yīng)確認(rèn)其對(duì)微生物無(wú)毒性以及與所使用中第 22 頁(yè) 共

37、 45 頁(yè)公司 gmp 文件和劑或滅活劑的相容性。編碼：sop-qc-ty-02-0334.2.2 培養(yǎng)基適用性檢查和控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)供試品控制菌檢查中所使用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行適用性檢查。供試品的控制菌檢查方法應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該 產(chǎn)品的控制菌檢查。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，控制菌檢查方法應(yīng)重新進(jìn)行適 用性試驗(yàn)。4.2.3 菌種及菌液制備菌種試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)不得超過(guò) 5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。 金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus)c

38、mcc（b）26 003銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa) cmcc（b）10 104 大腸埃希菌(escherichia coli) cmcc（b）44 102乙型副傷寒沙門菌(salmonella paratyphi b) cmcc（b）50 094 白色念珠菌(candida albicans)cmcc（f）98 001 生孢梭菌（clostridium sporogenes）cmcc（b）64 941菌液制備將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上， 3035培養(yǎng) 1824 小時(shí)；將白色念珠菌

39、接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，2025培養(yǎng) 23 天；將生孢梭菌接種于梭菌增菌培養(yǎng)基中置厭氧條件下 3035培養(yǎng) 2448 小時(shí)或接種于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中 3035培養(yǎng) 1824 小時(shí)。上述培養(yǎng)物用 ph7.0 無(wú)菌氯化鈉 - 蛋白胨緩沖液或 0.9% 無(wú)菌氯化鈉溶液制成適宜濃度第 23 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件 的菌懸液。編碼：sop-qc-ty-02-033菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用；若保存在28，可在24 小時(shí)內(nèi)使用。生孢梭菌孢子懸液可替代新鮮的菌懸液，穩(wěn)定的孢子懸液可保存在 2 8，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。4.2.4 陰性對(duì)照為確

40、認(rèn)試驗(yàn)條件是否符合要求，應(yīng)進(jìn)行陰性對(duì)照試驗(yàn)，陰性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。 如陰性對(duì)照有菌生長(zhǎng)，應(yīng)進(jìn)行偏差調(diào)查。4.2.5 培養(yǎng)基適用性檢查控制菌檢查用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng) 基的適用性檢查。控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查項(xiàng)目包括促生長(zhǎng)能力、抑制能力及指示特性的 檢查。各培養(yǎng)基的檢測(cè)項(xiàng)目及所用的菌株見表1。表1 控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)能力、抑制能力和指示特性控制菌培養(yǎng)基特性試驗(yàn)菌株檢查耐膽鹽腸道菌增菌液大腸埃希菌、促生長(zhǎng)能力革蘭陰體培養(yǎng)基銅綠假單胞菌性菌抑制能力金黃色葡萄球第 24 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件編碼：sop-qc-ty-02-033菌紫紅

41、膽鹽葡萄促生長(zhǎng)能力大腸埃希菌、糖瓊脂培養(yǎng)基 +指示特性 麥康凱液體培促生長(zhǎng)能力 養(yǎng)基銅綠假單胞菌大腸埃希菌大腸埃金黃色葡萄球抑制能力希菌菌麥康凱瓊脂培促生長(zhǎng)能力大腸埃希菌養(yǎng)基+指示能力rv 沙門菌增乙型副傷寒沙促生長(zhǎng)能力菌液體培養(yǎng)基沙門菌 四硫磺酸鈉亮門菌乙型副傷寒沙促生長(zhǎng)能力綠培養(yǎng)基門菌抑制能力第 25 頁(yè) 共 45 頁(yè)金黃色葡萄球公司 gmp 文件木糖賴氨酸脫編碼：sop-qc-ty-02-033菌氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基三糖鐵瓊脂培 養(yǎng)基溴化十六烷基銅綠假 三甲銨瓊脂培 單胞菌 養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力+指示能力指示能力促生長(zhǎng)能力抑制能力乙型副傷寒沙 門菌乙型副傷寒沙 門菌銅綠假單胞菌大腸埃希菌金黃色葡

42、萄球菌梭菌甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基梭菌增菌培養(yǎng)促生長(zhǎng)能力+指示能力抑制能力促生長(zhǎng)能力金黃色葡萄球 菌大腸埃希菌生孢梭菌第 26 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件 基哥倫比亞瓊脂編碼：sop-qc-ty-02-033促生長(zhǎng)能力生孢梭菌培養(yǎng)基沙氏葡萄糖液促生長(zhǎng)能力白色念珠菌體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊促生長(zhǎng)能力白色念白色念珠菌脂培養(yǎng)基 +指示能力珠菌念珠菌顯色培促生長(zhǎng)能力養(yǎng)基 +指示能力抑制能力白色念珠菌大腸埃希菌液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查分別接種不大于 100cfu 的試驗(yàn)菌（見表 1）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培 養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培

43、養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好。固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)能力檢查用涂布法分別接種不大于100cfu 的試驗(yàn)菌（見表1）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征第 27 頁(yè) 共 45 頁(yè)公司 gmp 文件 應(yīng)一致。編碼：sop-qc-ty-02-033培養(yǎng)基抑制能力檢查接種不少于100cfu 的試驗(yàn)菌（見表1 ）于被檢培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不短于規(guī)定的最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間下培 養(yǎng)，試驗(yàn)菌應(yīng)不得生長(zhǎng)。培養(yǎng)基指示特性檢查用涂布法分別接種不大于 100cfu 的試驗(yàn)菌（見表 1）于被檢培養(yǎng)基

44、和對(duì)照培養(yǎng)基平板上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不長(zhǎng)于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng) 情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致。4.2.6 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)供試液制備 按下列“供試品檢查”中的規(guī)定制備供試液。試驗(yàn)菌根據(jù)各品種項(xiàng)下微生物限度標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應(yīng)試驗(yàn)菌株，確認(rèn)耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時(shí),采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗(yàn)菌。適用性試驗(yàn)按控制菌檢查法取規(guī)定量供試液及不大于 100cfu 的試驗(yàn)菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中；采用薄膜過(guò)濾法時(shí) , 取規(guī)定量供試液 , 過(guò)濾 , 沖洗 , 試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中,過(guò)濾后,注入規(guī)定的培養(yǎng)基或取出濾膜接入規(guī)定的培養(yǎng)基中。依相應(yīng)的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度及最短時(shí)間下培養(yǎng)，應(yīng)能檢出所加試驗(yàn)菌相應(yīng)的反應(yīng) 特征。結(jié)果判斷上述試驗(yàn)若檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品檢查；若未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)消除供試品的抑菌活性（見非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)法中的“抗菌活性的去除或滅活”），并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。如果經(jīng)過(guò)試驗(yàn)確證供試品對(duì)試驗(yàn)菌的抗菌作用無(wú)法消