miR-203a和miR-203b基因在食管鱗狀細胞癌中的表達及其甲基化狀態(tài)分析-碩士畢業(yè)大論文終結(jié)版

1、No. 河 北 醫(yī) 科 大 學 碩士研究生畢業(yè)論文 miR-203a 和和 miR-203b 基因在食管鱗狀細胞癌中的基因在食管鱗狀細胞癌中的 表達及其甲基化狀態(tài)分析表達及其甲基化狀態(tài)分析 研 究 生梁梁 佳佳 導師郭郭 煒煒 教教 授授 董稚明董稚明 教教 授授 專業(yè)病理學與病理生理學 二級學院河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院 研究起止日期2013 年 9 月-2015 年 3 月 交稿日期2015 年 3 月 目目 錄錄 中文摘要1 英文摘要5 英文縮寫9 研究論文 miR-203a 和 miR-203b 基因在食管鱗狀細胞癌中的表達及其甲基 化狀態(tài)分析 前言10 材料與方法12 結(jié)果22 附圖24

2、附表28 討論35 結(jié)論39 參考文獻40 綜述 miR-203a 在腫瘤中的研究進展43 致謝55 個人簡歷56 miR-203amiR-203a 和和 miR-203bmiR-203b 基因在食管鱗狀細胞癌中的表達及其甲基基因在食管鱗狀細胞癌中的表達及其甲基 化狀態(tài)分析化狀態(tài)分析 摘摘 要要 目的目的：食管癌是發(fā)生在食管粘膜上皮的惡性腫瘤，根據(jù)食管癌的組織 學特點可分為五種類型，其中食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）在食管癌中所占比例最多，大約占 90%，食管腺癌 （esophageal adenocarcinoma, EA）

3、次之，占 7%左右，其他幾種類型均少見。 我國是世界上食管癌發(fā)生率和病死率均較高的國家之一，同時食管癌預后 特別差，晚期患者生存率極低。然而到目前為止，食管癌的發(fā)病機制尚不 清楚。 近年來對食管癌的發(fā)病機制已進行廣泛研究，其中對表觀遺傳學的改 變特別是 miRNAs 啟動子區(qū)高甲基化已成為研究的熱點，本研究通過檢測 miR-203a 和 miR-203b 基因在食管癌細胞和食管鱗癌組織中的表達及其甲 基化狀態(tài)，探討 miR-203a 和 miR-203b 基因甲基化與食管癌發(fā)生、發(fā)展的 關(guān)系，從而為食管癌發(fā)病的分子機制、治療方案及其評估預后等方面提供 新的理論依據(jù)。 方法方法： 1 應用實時定

4、量 RT-PCR（Quantitative real-time RT-PCR, qRT-PCR） 方法檢測應用 DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑 5-氮雜-2-脫氧胞苷（5-aza-2- deoxycitydine, 5-aza-dC）處理前后的食管癌細胞系（TE1、TE13、YES- 2、Ec109 和 T.TN）和 54 例食管鱗癌組織及其相應的癌旁組織中 miR-203a 和 miR-203b 基因的表達。 2 應用甲基化特異性 PCR（methylation specific polymerase chain reaction, MSP）方法檢測應用 5-aza-dC 處理前后的食管癌細胞系

5、和 83 例食 管鱗癌組織及其相應的癌旁組織中 miR-203a 和 miR-203b 基因的甲基化狀 態(tài)。 3 運用統(tǒng)計軟件 SPSS19.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。 結(jié)果結(jié)果： 1 miR-203a 基因在食管癌中的表達及甲基化 1.1 食管癌細胞系中 miR-203a 基因的表達及甲基化狀態(tài) 未經(jīng) 5-aza-dC 處理，五種食管癌細胞中 miR-203a 基因的表達均相對較 低，且呈高甲基化狀態(tài)；5-aza-dC 處理后，miR-203a 基因的表達均顯著升 高（均 P0.05），YES-2 細胞中 miR-203 基因甲基化程度顯著降低，其余 4 種食管癌細胞系中 miR-203a

6、基因為非甲基化狀態(tài)。 1.2 食管癌組織中 miR-203a 基因的表達 miR-203a 基因在食管癌和其相應的癌旁組織的表達量分別為 0.2530.099 和 0.4810.189，食管癌組織 miR-203a 基因的表達量明顯低于 其相應的癌旁組織，兩者的差異有統(tǒng)計學意義（t=-14.137，P=0.000）。在 食管鱗癌患者中, miR-203a 的表達與腫瘤組織的腫瘤分期和分化程度有關(guān) （P0.05）。 1.3 食管癌組織中 miR-203a 基因甲基化狀態(tài)的研究 miR-203a 基因啟動子區(qū)在食管鱗癌組織和其相應的癌旁組織的甲基化 率分別 62.7%（52/83）和 7.2%（6

7、/83）。食管鱗癌組織中 miR-203a 基因啟 動子區(qū)甲基化發(fā)生率明顯高于其相應的癌旁組織（2=3.918，P=0.048）。 miR-203a 基因在低分化鱗癌組中甲基化發(fā)生率 75.0%（33/44）明顯高于中 高分化鱗癌組甲基化發(fā)生率 48.7%（19/39）（2=6.103，P=0.013）；期 和期 miR-203a 基因啟動子區(qū)的甲基化發(fā)生率 94.1%（16/17）明顯高于 期和期 54.5%（36/66）（2=9.047，P=0.003）；miR-203a 基因啟動子區(qū) 甲基化發(fā)生率與患者的年齡、性別和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)（P0.05）。 1.4 食管癌組織中 miR-203a

8、基因的表達、甲基化狀態(tài)及其與臨床病理資料 之間的關(guān)系 在 miR-203a 基因啟動子區(qū)發(fā)生甲基化的食管鱗癌組織中，其平均相對 表達量為 0.2320.818，未發(fā)生甲基化的食管鱗癌組織中平均相對表達量為 0.3130.120，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P=0.006）。 2 miR-203b 基因在食管癌中的表達及甲基化 2.1 食管癌細胞系中 miR-203b 基因的表達及甲基化狀態(tài) 未經(jīng) 5-aza-dC 處理的 5 種食管癌細胞系中 miR-203b 基因的表達均相對 較低，同時表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)；而應用 5-aza-dC 處理后，miR-203b 在 YES-2 和 T.TN 細胞中的甲

9、基化程度降低，非甲基化程度增加，其余 3 種食 管癌細胞系中 miR-203b 基因均表現(xiàn)為非甲基化狀態(tài)。 2.2 食管癌組織中 miR-203b 基因的表達 miR-203b 基因在食管癌和其相應的癌旁組織的表達量分別為 0.0260.021 和 0.0490.041，食管癌組織 miR-203b 基因的表達明顯低于其 相應的癌旁組織，兩者的差異有統(tǒng)計學意義（t=7.810，P=0.000）。在食管 鱗癌患者中，miR-203b 的表達與腫瘤組織的分化程度有關(guān)（P0.05）。 2.3 食管癌組織中 miR-203b 基因甲基化狀態(tài)的研究 miR-203b 基因啟動子區(qū)在食管鱗癌組織和其相應的

10、癌旁組織中的甲基 化率分別 57.8%（48/83）和 12.0%（10/83）。食管鱗癌組織中 miR-203b 基 因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率明顯高于其相應的癌旁組織 （2=6.673，P=0.010）。miR-203b 基因在低分化鱗癌組甲基化發(fā)生率 68.2%（30/44 明顯高于中高分化鱗癌組甲基化發(fā)生率 46.2%（18/39） （2=4.114，P=0.043）；miR-203b 基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與年齡、性 別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織分期無關(guān)（P0.05）。 2.4 食管癌組織中 miR-203b 基因的表達、甲基化狀態(tài)及其與臨床病理資料 之間的關(guān)系 在 miR-203b 基因

11、啟動子區(qū)發(fā)生甲基化的食管鱗癌組織中，其平均相對 表達量是 0.0170.013，未發(fā)生甲基化的食管鱗癌組織中平均相對表達量是 0.0360.025，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）。 結(jié)論結(jié)論： 1 miR-203a 和 miR-203b 在食管癌細胞系中表達較低，且呈現(xiàn)為高甲基 化狀態(tài)，5-aza-dC 能逆轉(zhuǎn) miR-203a 和 miR-203b 基因的甲基化，使 miR- 203a 和 miR-203b 恢復表達，提示 miR-203a 和 miR-203b 基因啟動子區(qū)異 常甲基化有可能是導致它們在食管癌細胞中表達缺失的重要機制之一。 2 miR-203a 和 miR-203b

12、 基因在食管鱗癌組織中的表達明顯低于其相應 的癌旁組織，提示 miR-203a 和 miR-203b 基因在食管鱗癌中可能主要起抑 癌基因的作用。 3 食管鱗癌組織中 miR-203a 和 miR-203b 基因啟動子區(qū)甲基化情況明 顯高于其相應的癌旁組織，提示 miR-203a 和 miR-203b 基因甲基化可能是 食管鱗癌發(fā)生的機制之一。 4 miR-203a 和 miR-203b 啟動子區(qū)甲基化情況與患者年齡，性別等因素 無關(guān)，與分化程度等生物學行為有關(guān)，提示 miR-203a 和 miR-203b 基因啟 動子區(qū)甲基化與食管鱗癌的預后可能有關(guān)。 關(guān)鍵詞關(guān)鍵詞：食管鱗癌，甲基化，表達，

13、miR-203a，miR-203b The expression and methylation status of miR-203a gene and miR-203b gene in esophageal squamous cell carcinoma ABSTRACT Objective: Esophageal cancer is occurred in esophageal mucosa epithelial malignant tumors, According to the histological features of esophageal cancer can be divi

14、ded into five types, of which the most common esophageal squamous cell carcinoma, accounting for about 90 percent, followed by esophageal adenocarcinoma, accounting for about 7 percent, other types are rare. China is a country with high incidence and mortality regions of esophageal cancer, and the a

15、verage annual incidence and mortality were 20.14/10 ten thousand and 16.7/10 ten thousand. The prognosis of esophageal cancers is poor, The 5-year survival rate is about 10% in middle or advanced stages patients. So far, the pathogenesis of esophageal cancer is still unclear. In the etiology of esop

16、hageal cancer, epigenetic changes, especially aberrant DNA methylation of the promoter region is the current research focus. In this study, the expression and methylation status of miR-203a and miR-203b were detected in esophageal cancer cell lines and esophageal squamous cell carcinoma to explore t

17、he relationship between gene methylation and development and occurrence of ESCC. Thus we provide a new theory and experimental evidence for pathogenesy, therapeutic schedule and clinical prognosis of ESCC. Methods: 1 Quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCP) method was used to detect the expression mi

18、R-203a and miR-203b gene in esophageal cancer cell lines (TE1, TE13, Yes-2, Ec109, T.TN) and the cell lines treated with 5-aza-dC, 54 ESCC tumor tissues and corresponding normal tissues. 2 Methylation specific PCR (MSP)method was used to examine the methylation status of miR-203a and miR-203b gene i

19、n esophageal cancer cell lines and the cell lines treated with 5-aza-dC, 83 ESCC tumor tissues and corresponding normal tissues. 3 SPSS19.0 was applied to analyze the results of experiments. Results: 1 The expression and methylation of miR-203a gene in ESCC 1.1 The expression and methylation status

20、of miR-203a in esophageal cancer cell lines Relative low expression and hypermethylation of miR-203a was detected in the five esophageal cancer cell lines untreated with 5-aza-dC. After treatment with 5-aza-dC, the expression of miR-203a was enhanced, the methylation level of miR-203a in YES-2 cell

21、line was decreased, and complete unmethylation of miR-203a was detected in TE1, TE13, EC109, and T.TN cell lines. 1.2 The expression of miR-203a in ESCC The expression of miR-203a in tumor tissues (0.2530.099) was significantly lower than that in corresponding normal tissues (0.4810.189) (P0.05). 1.

22、3 The methylation status of miR-203a in ESCC The promoter methylation frequency of in tumor specimens 62.7%（52/83）was significantly higher than that in corresponding normal tissues 7.2%（6/83）(2=3.918, P=0.048). Methylation frequencies of miR-203a gene in poor differentiation group 75.0%（33/44）was mu

23、ch higher than that in moderate and high differentiation group 48.7%（19/39）(2=6.103，P=0.013). Methylation frequencies of miR-203a in stage and stage 94.1%（16/17） was significantly higher than that in stage and stage 54.5%（36/66） (2=9.047，P=0.003). Methylation status of miR-203a gene was not associat

24、ed with lymph node metastasis, age, and gender (P0.05). 1.4 Relationship between methylation status of miR-203a and its expression The expression of miR-203a in tumor tissues with promoter methylation of the gene (0.2320.818) was significantly lower than that in tumor tissues with unmethylation of t

25、he gene (0.3130.120) (P=0.006). 2The expression and methylation of miR-203b gene in ESCC 2.1The expression and methylation status of miR-203b in esophageal cancer cell lines Relatively low expression and hypermethylation of miR-203b was detected in the five esophageal cancer cell lines untreated wit

26、h 5-aza-dC. After treatment with 5-aza-dC, the expression of miR-203b was enhanced, and the methylation status of miR-203b was reversed in esophageal cancer cell lines. Complete unmethylation of miR-203b was detected in TE1, TE13, and EC109 cell lines. 2.2 The expression of miR-203b in ESCC Th expre

27、ssion of miR-203b in tumor tissues (0.0260.021) was significantly lower than that in corresponding normal tissues (0.0490.041) (t=7.810 P=0.000). The expression of miR-203b was correlated with status of differentiation of ESCC patients (P 0.05). 2.3 The methylation status of miR-203b in ESCC The pro

28、moter methylation frequency of in tumor specimens 57.8%（48/83）was significantly higher than that in corresponding normal tissues 12.0%（10/83） (2=6.673，P=0.010). Methylation frequencies of miR- 203b gene in poor differentiation group 68.2%（30/44）was much higher than that in moderate and high differen

29、tiation group 46.2%（18/39） (2=4.114，P=0.043). Methylation status of miR-203b gene was not associated with age, gender, lymph node metastasis and TNM stage (P0.05). 2.4 Relationship between methylation status of miR-203b and its expression The expression of miR-203b in tumor tissues with promoter met

30、hylation of the gene (0.0170.013) was significantly lower than that in tumor tissues with unmethylation of the gene (0.0360.025) (P=0.001). Conclusions: 1 The relatively low expression and the hypermethylation of miR-203a and miR-203b gene were detected in the esophageal cancer cell lines. 5-aza-dC

31、can reverse the methylation status of miR-203a and miR-203b and restore its expression in esophageal cancer cell lines, indicating that promoter exception hypermethylation of miR-203a and miR-203b gene may be an important mechanism for its inactivation in ESCC. 2 The expression of miR-203a and miR-2

32、03b in ESCC tissues was significantly lower than that in the corresponding normal tissues, indicating that miR-203a and miR-203b gene may play a major tumor suppressor gene of the role in ESCC. 3 The promoter methylation frequency of miR-203a and miR-203b in tumor specimens was significantly higher

33、than that in corresponding normal tissues, indicating that promoter methylation of miR-203a and miR-203b may be associated with the occurrence of ESCC. 4 The methylation status of miR-203a and miR-203b promoter was not correlated with age, gender of patients. However, it was significantly related to

34、 differentiations, indicating that promoter methylation of miR-203a and miR-203b may be associated with tumor prognosis. Key words: Esophageal squamous cell carcinoma（ESCC）, expression, methylation, miR-203a, miR-203b 英文縮寫英文縮寫 ESCCesophageal squamous cell carcinoma 食管鱗癌 EAesophageal adenocarcinoma食管

35、腺癌 qRT-PCRQuantitative real-time RT-PCR 實時定量 RT-PCR MSPmethylation specific polymerase chain reaction, 甲基化特異性 PCR 5-aza-dC5-aza-2-deoxycitydine 5-氮雜-2-脫氧胞苷 miRNAsmicroRNAs微小 RNA PI3K/Aktphosphatidylinositol-3-kinases/ protein-serine-threonine kinase 磷脂酰肌醇-3-激酶/ 蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸 激酶 miR-203a 和和 miR-203b 基因在食

36、管鱗狀細胞癌中的表達及其甲基基因在食管鱗狀細胞癌中的表達及其甲基 化狀態(tài)分析化狀態(tài)分析 前前 言言 食管癌是發(fā)生在食管粘膜上皮的惡性腫瘤，超過 90%的食管癌主要是 食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）和食管腺癌 （esophageal adenocarcinoma，EA） ，在亞洲主要是 ESCC1。我國亦是世界 上食管癌發(fā)生率和病死率較高的國家之一，年平均發(fā)病率和病死率分別為 20.14/10 萬和 16.7/10 萬2。然而食管癌的發(fā)生機制至今尚未明確。目前認 為，惡性腫瘤的發(fā)生主要有兩種機制：分別是遺傳學機制和表觀遺傳學機

37、制。這兩種機制起著不同的作用，遺傳學機制是指 DNA 序列和染色體水平 的結(jié)構(gòu)和數(shù)目的改變，其中包括各類基因突變、基因缺失和基因過度擴增 等，以及染色體缺失、染色體重復、染色體易位和染色體非整倍體等改變， 表觀遺傳學是指 DNA 序列不變的前提下，全基因組的基因表達調(diào)控所決定 的表觀遺傳3。表觀遺傳在調(diào)節(jié)基因表達起著重要的作用，調(diào)控的喪失可顯 著促進癌癥的發(fā)生，發(fā)展和進展。近年來隨著對腫瘤研究的不斷深入，認 為表觀遺傳學機制對基因的表達調(diào)控比遺傳學機制更為多見4。同時研究顯 示，表觀遺傳學改變特別是 DNA 甲基化已經(jīng)成為研究的熱點。 miRNAs是一類大約含1825個核苷酸的非編碼、內(nèi)源性小

38、分子單鏈 RNA，廣泛存在于動植物中5。已有研究證實，miRNAs可以作為癌基因或 抑癌基因，調(diào)控腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，維持血管生成和抑制細胞凋亡， 并且發(fā)現(xiàn)miRNAs啟動子區(qū)CpG島高甲基化是腫瘤中miRNAs表達沉默的機 制之一6-8。 miR-203a和miR-203b基因均定位于人染色體 14q32，具有高度同源性， 這個區(qū)域也是染色體上的不穩(wěn)定區(qū)域，約12%已發(fā)現(xiàn)的miRNAs基因位于此 區(qū)域。miR-203a和miR-203b基因是由不同啟動子轉(zhuǎn)錄的，miR-203a轉(zhuǎn)錄方 向是從基因組DNA主鏈即正義鏈5端起始，則其啟動子區(qū)可能位于基因組 DNA主鏈即正義鏈5端前的堿基中，mi

39、R-203b轉(zhuǎn)錄方向是從基因組DNA從 鏈即反義鏈5端起始，則其啟動子區(qū)可能位于基因組DNA從鏈即反義鏈5 端起始前的堿基中。當前對miR-203a的研究較多，如Feber9等通過miRNAs 芯片分析發(fā)現(xiàn)，miR-203a在食管癌組織中表達下調(diào)2倍以上；Furuta等10進 一步發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌中，由于miR-203a基因啟動子區(qū)高甲基化導致miR- 203a基因沉默。但miR-203a基因在食管鱗癌中的表達及甲基化狀態(tài)研究較 少，miR-203b基因在食管鱗癌中的表達及甲基化狀態(tài)的研究在國內(nèi)外尚未 見報道。 本研究采用實時定量 RT-PCR（Quantitative real-time R

40、T-PCR, qRT- PCP）方法和甲基化特異性 PCR（methylation specific polymerase chain reaction, MSP）方法檢測食管癌細胞系及食管鱗癌和癌旁正常組織中 miR- 203a 和 miR-203b 基因的表達水平和啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)并結(jié)合臨床資料分 析其與臨床病理資料之間的關(guān)系，探討 miR-203a 和 miR-203b 甲基化與食 管鱗癌發(fā)生的關(guān)系，為確定 miR-203a 和 miR-203b 基因在食管鱗癌發(fā)生及 發(fā)展中的作用提供實驗依據(jù)。 材料與方法材料與方法 1 研究對象 1.1 食管癌細胞系 人食管癌細胞系TE1、TE13、

41、YES-2、Eca109、T.TN由河北醫(yī)科大學 第四醫(yī)院腫瘤研究所病理室保存。 1.2 組織標本 研究對象取自河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院2008-2011年間收治的ESCC手術(shù) 患者，共83例。其中男性61例，女性22例，年齡3774歲，中位年齡60歲。 每例患者均取ESCC原發(fā)灶及癌旁組織，全部病人術(shù)前均沒有進行放、化療。 手術(shù)切除標本一部分放入液氮保存，用以提取DNA和RNA，一部分標本用 4中性甲醛溶液固定，常規(guī)制作蠟塊保存。依據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組：淋 巴結(jié)轉(zhuǎn)移組35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組48例；按照國際抗癌聯(lián)盟（UICC）標準 進行TNM分期：83例腫瘤患者中期3例、期63例、期16例、期1例

42、。 按照WHO腫瘤的病理學分級：83例腫瘤患者中高分化19例、中等分化20例、 低分化44例。在全部83例 ESCC 組織及其相應癌旁組織中檢測了miR-203a 和miR-203b基因甲基化狀態(tài)，但僅在54例ESCC 組織及其相應癌旁組織中 檢測了miR-203a和miR-203b表達水平。在這54例患者中，男性40例，女性 14例，年齡3774歲，中位年齡61歲；按照 WHO 的腫瘤病理學分級：54 例患者中高分化16例，中等分化6例，低分化32例；按淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況分組： 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組27例；按照UICC標準進行TNM分期： 期2例，期43例，期8例，期1例（Tab

43、le 3）本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學 第四醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審查后批準，并獲得全部患者的知情同意。 2 主要儀器及試劑 2.1 主要實驗儀器 儀器名稱型號生產(chǎn)廠家 數(shù)顯電熱保溫箱303-4A上海陽光實驗儀器有限公司 實時定量PCR擴增儀德國 eppendorf 公司 Qcapture圖像采集系統(tǒng)加拿大QIMAGING公司 離心機LXJ-64-01北京醫(yī)療儀器修理廠 臺式離心機PQ-1600A上海培清科技有限公司 恒溫磁力攪拌器HJ-3江蘇金壇醫(yī)療儀器廠 微型混合器H-1上海彭氏實業(yè)有限公司 電子天平PB3002-SMETTLER 公司 PCR擴增儀Mastercycler5333德國 eppendo

44、rf 公司 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-2北京市六一儀器廠 電泳槽DYY-31D北京市六一儀器廠 醫(yī)用微波爐ZD-b上海中達醫(yī)學應用研究 紫外分光光度計北京市新技術(shù)應用研究所 Eppendorf Research移液器德國eppendorf公司 凝膠成像系統(tǒng)FOTODYNE美國Image公司 超凈工作臺XD-10-1北京市西城半導體設備一廠 制冰機SIM-F124日本三洋集團 臺式低溫超速離心機JY-16-6德國 低溫冰箱日本三洋集團 電熱恒溫水浴箱DK-98-天津市泰斯特儀器有限公司 5%CO2培養(yǎng)箱日本三洋集團 生物安全柜BSC-1500A濟南鑫貝西 2.2 主要試劑 試劑名稱生產(chǎn)廠商 qRT-

45、PCR主要試劑 TRIzol美國SBS公司 總RNA提取試劑美國Promega公司 逆轉(zhuǎn)錄 PCR 試劑盒美國Promega公司 qRT-PCR 體系試劑盒美國Promega公司 氯仿、異丙醇上海化學試劑總廠 DEPC美國invitrogen公司 MSP主要試劑 Wizard DNA試劑盒美國Promega公司 亞硫酸氫鹽Sig-aldrich 對苯二酚Sig-aldrich 乙酸鈉天津博迪化工 無水乙醇、異丙醇上海永大 蛋白酶K美國Sigma公司 瓊脂糖西班牙進口分裝 5-氮雜-2-脫氧胞苷美國Sigma公司 DNA Marker北京Solarbio技術(shù)有限公司 PCR引物北京賽百盛基因技術(shù)

46、有限公司 藍色體系美國 Foments 公司 EB 北京鼎國生物技術(shù)有限公司 3 實驗方法 3.1 食管癌細胞系的培養(yǎng)及處理 TE1、TE13、YES-2、Eca109、T.TN用含10%胎牛血清、100U/mL青霉 素、100g/ml鏈霉素、8%NaHCO3的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37、CO2體積 分數(shù)為5%的條件下培養(yǎng)，細胞接種、傳代和收集方法如下：取生長狀態(tài)良 好，幾乎接近匯合成片（80%匯合率）密度的，對數(shù)生長期的細胞，倒掉 舊的培養(yǎng)液；在每個培養(yǎng)瓶中加入2ml左右的PBS，洗滌3次，每瓶中加入2- 3ml的0.25%的胰酶，充分消化3-5分鐘；然后加入等體積的的含10%FBS的

47、 1640培養(yǎng)液，離心，倒掉上層清液，在每個離心管內(nèi)加1ml左右培養(yǎng)液，然 后將各管內(nèi)的細胞懸液移至另一個離心管內(nèi)后離心，去除上層清液，加入 適量培養(yǎng)液，混勻，稀釋成三份，分別移至新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，混勻細胞，將 細胞懸液均勻鋪在培養(yǎng)瓶內(nèi)表面，將傳代的細胞在于37、CO2體積分數(shù) 為5% 的條件下培養(yǎng)。次日觀察，更換培養(yǎng)液。倒置顯微鏡觀察細胞數(shù)量， 有無細胞融合。常規(guī)培養(yǎng)同時應用去甲基化劑5-氮雜-2-脫氧胞（5-Aza-2- deoxycytidine，5-aza-dC）（濃度10mol/L）作用于TE1、TE13、YES- 2、Eca109、T.TN五株細胞系，24h更換一次培養(yǎng)液，抑制劑培養(yǎng)2

48、d后，第 3d換全血清培養(yǎng)液，24h后收集細胞，用于后續(xù)檢測。 3.2 qRT-PCR方法檢測miR-203a和miR-203b基因的表達 3.2.1 提取細胞/組織總RNA 取適量組織放入加好1ml Trizol研磨器中充分研磨用細胞刮子將培養(yǎng)瓶 中細胞全部刮下，移入EP管中PBS洗3遍后加入1ml Trizol 反復吹打混勻 （整個過程冰上操作，研磨器預冷） 加入200l的氯仿，震蕩，冰上靜置5min 12000rpm 4離心，15min 將上清至另一EP管中，加等體積異丙醇， 充分混勻后冰上靜置10min 12000rpm/min 4離心15min 棄上清，加入400l 的75%乙醇 4

49、離心5min 棄上清，去除殘留乙醇，在吸紙上晾干 加入適量0.1% DEPC溶解沉淀（即為提取的總RNA） ，-80保存?zhèn)溆?（整個操作過程需保持低溫，避免RNA酶的污染） 3.2.2 RNA完整性的鑒定 提取的總RNA與上樣緩沖液（0.25%溴酚蘭，0.25二甲苯青FF，30%甘 油）按1: 5混勻，在1.5%瓊脂糖凝膠（用電泳緩沖液配置，含0.5l/ml溴乙 錠）中電泳（電壓120V電流60mA），電泳緩沖液為1TAE。待上樣緩沖液 中的溴酚蘭遷出一定距離后，停止電泳。將凝膠移至紫外透射儀下觀察， RNA的電泳條帶28s、18s、5s應清晰無降解。 3.2.3 mRNA的反轉(zhuǎn)錄 （1）按反

50、轉(zhuǎn)錄試劑盒配置12l反應體系 RNA3g 特異性莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物1.0l 無菌水補到12l，于PCR 反應儀中70孵育5min。 （操作在冰上） ； 置冰上加 Nuclease-Free Water1.6l 5Reaction Buffer 4.0l MgCl2（25mM）2.0l 10mM dNTP Mix4.0l RNase Inhibitor(20g/l)1.0l ReverseTranscriptase(200g/l)1.0l (2) 反應條件：置于冰上加入以上試劑后，42 60min，25 5min，70 5min，4保存。 (3)取出反應產(chǎn)物cDNA，-20保存?zhèn)溆谩?3.2.4 c

51、DNA的qRT-PCR擴增（引物序列見Table 4） (1) 反應體系 cDNA 2l qRT-PCR mix 10l 目的基因/U6上下游引物 各0.5l CXR0.2l 加去離子水補足20l (2) qRT-PCR反應條件：95預變性10 min；95變性15 s，55退火30 s，72延伸30 s，40個循環(huán)；72延伸7 min。每個樣本設3個復孔。 3.2.5 miRNAs表達水平的結(jié)果判定 根據(jù)每孔熒光信號達到閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)作為 Ct 值，以 U6 為內(nèi)參， miRNAs 表達水平使用相對定量法，以 2Ct表 miRNAs 的相對表達量，其 中 Ct=CtmiR-203a 或

52、miR-203b CtU6。 3.3 甲基化特異性 PCR（MSP）方法檢測 miR-203a 和 miR-203b 基因啟動 子區(qū)甲基化狀態(tài) 3.3.1 食管癌細胞系中 DNA 的提取 (1)常規(guī)培養(yǎng)五種細胞系，生長至 90%左右后，用 PBS 洗 5min3 次，加入 1 mlPBS 后，用細胞刮除器將細胞從培養(yǎng)瓶中分離，收集到 EP 管中， 12000rpm 離心 10min。 (2)倒掉上清，用PBS洗5min3次 (3)倒掉上清，加0.5ml DNA提取液，30l 10% SDS充分混勻，再加入12.5l 蛋白酶K溶液（終濃度為0.5mg/ml），置于58恒溫箱內(nèi)過夜。 (4)向每個

53、EP管中分別加等體積的PCI液（約0.5ml），震蕩混勻后瞬時離心， 吸取上清溶液到一個新的EP管（約1ml），如有必要可重復抽取。 (5)加入1/10原始體積的乙酸鈉（50l），加入2-2.5倍體積的100%乙醇，放 置在-20冰箱內(nèi)，2小時以上。 (6)12000rpm離心15min，倒掉乙醇。 (7)加入70%乙醇1ml，12000rpm離心10分鐘。 (8) 加合適體積的TE緩沖液小心懸浮團塊，4過夜后，放入-20冰箱內(nèi)保 存。 3.3.2食管癌組織中DNA的提取 (1)取合適大小新鮮組織，用剪刀剪成米粒大小后放于研磨器，加入組織消 化液 500l，置于冰上充分研磨后，倒入對應編碼的大

54、 EP 管中，再在研磨 器中加入 500l 消化液，將研磨器中留的組織充分洗脫至大 EP 管，并加入 25l 蛋白酶 K 溶液（終濃度 0.5mg/ml），震蕩后在 55水浴箱過夜。 (2)第二天早上 8 點和晚上六點加 25l 蛋白酶 K，顛倒混勻，然后放到水浴 箱過夜。 (3)分裝后，向每個 EP 管中分別加等體積的 PCI 液（1ml），震蕩混勻后瞬 時離心，吸取上清溶液到一個新的 EP 管（約 1ml）。 (4)加入 1/10 原始體積的乙酸鈉（500l），加入 2-2.5 倍體積的 100%乙醇， 放置在-20冰箱內(nèi)，2 小時以上。 (5)離心后，棄去乙醇。 (6)加入 70%乙醇

55、1ml，12000rpm 離心 10 分鐘。 (7)加入少量的 TE 緩沖液（50100l），注意懸浮團塊完全浸沒在 TE 緩 沖液中，4過夜，-20保存。 (8)用紫外分光光度儀檢測 DNA 光密度（D）值，計算 DNA 的濃度和純度， 選取 A260 nm /A280 nm 的比值在 1.8-2.0 的標本進行分析。 3.3.3 DNA 甲基化修飾（亞硫酸氫鹽處理） 3.3.3.1 亞硫酸氫鹽處理的原理 單鏈 DNA 的沒有發(fā)生甲基化胞嘧啶(C)可以在亞硫酸氫鹽作用下脫氨 基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶(U)，而發(fā)生了甲基化的胞嘧啶則不能轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぁＶ?要過程：(1)磺化作用：亞硫酸氫鈉使胞嘧啶發(fā)生磺

56、化。(2)脫氨基：磺化的 胞嘧啶在對苯二酚作用下脫去氨基。(3)脫磺化：在堿性條件下，磺化基團 被脫去，胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。 3.3.3.2 實驗步驟 DNA 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 （1）使需要轉(zhuǎn)化的 DNA 完全解凍，使亞硫酸氫鹽溶液被完全溶解； （2）把亞硫酸氫鹽反應的試劑（參照 Table 1）添加入 200l PCR 管中；順 序依次添加反應成分； （3）合上 PCR 管，均勻混合上述反應物，室溫（15-25）保存 PCR （4）使用 thermal cycler 進行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化參照 Table 2，設置 thermal cycler； （5）將含有亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的各種試劑的 PCR 管

57、放入 thermal cycler，啟 動 PCR 儀。 亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后 DNA 的回收 （6）反應停止后，將含有反應物的 PCR 管瞬時離心，然后將反應物轉(zhuǎn)移 到干凈的 1.5ml EP 管中； （7）向每個樣品中加入 carrier RNA 濃度 10ng/ml 新鮮配置的 Buffer BL 310l。通過渦旋震蕩充分混合，簡單離心； （8）向每個樣品中加入 250l 乙醇（96-100）。震蕩 20 秒完全混合，瞬 時離心來去除管壁上殘留的液體； （9）準備必要數(shù)量的 MinElute DNA spin columns 和收集管，將步驟 8 的 混合物全部轉(zhuǎn)移到 spin colum

58、n； （10）在最大轉(zhuǎn)速下離心 spin columns 1 分鐘后，將液體倒掉，將 spin column 再次放回到收集管； （11）向每個 spin column 中加入 500l Buffer BW(wash buffer)，12000rpm 離心 1 分鐘，倒掉液體，將 spin column 放回到收集管； （12）向每個 spin column 中加入 500l Buffer BD，室溫（15-25）放置 15 分鐘； （13）在最大轉(zhuǎn)速下離心 spin columns 1 分鐘，將液體倒掉，將 spin column 重新放回到收集管； （14）向每個 spin column

59、中加入 500l Buffer BW(wash buffer)，載最大轉(zhuǎn) 速下離心 1 分鐘，將液體倒掉，將 spin column 再次放回到收集管； （15）重復步驟 14 一次； （16）向每個 spin column 中加入 250l 乙醇（96-100）。12000rpm 離心 1 分鐘； （17）把 spin column 放到新的 2ml 收集管，12000rpm 離心 1 分鐘，除去 任何殘留液體； （18）把 spin column 放到干凈的 1.5ml 離心管中。向每個 spin column 膜中 央直接加入 15l Buffer EB(elute buffer)小心合

60、上 column 的蓋子； （19）室溫下放置 spin columns 1 分鐘； （20）在 12000 轉(zhuǎn)速下離心 1min，將溶解的 DNA 被完全洗脫出來，放入 -20的冰箱保存，以備后用。 3.3.3.3 DNA 亞硫酸氫鹽修飾完整性的判定 應用上下游引物中均不含 CG 位點的引物擴增修飾前與修飾后的同一 樣品 DNA，若修飾后擴增出了目的條帶而修飾前無任何目的條帶擴增，則 說明亞硫酸氫鹽修飾完全。 3.3.4 MSP 擴增過程 PCR 反應體系如下：（引物見 Table 4） 藍色體系 10.0l 上游引物 1.0l 下游引物 1.0l DNA 模板 2l ddH2O 6l 反應